Summary
Drosophila är känd för sin kraftfulla genetisk manipulation, men inte för dess lämplighet för djupgående biokemisk analys. Här presenterar vi ett TAP-baserat förfarande för att identifiera samverkande partners av något protein av intresse från flugan hjärnan. Detta förfarande kan eventuellt leda till nya vägar för forskning.
Abstract
Genetiska skärmar som genomförts med hjälp av Drosophila melanogaster (bananfluga) har gjort många milstolpe upptäckter i förväg av biologiska vetenskaper. Emellertid var användningen av biokemiska skärmar att utvidga kunskap från genetisk analys undersökt först nyligen. Här beskriver vi en metod för att rena protein-komplex som associerar med något protein av intresse från vuxengylf huvuden. Detta förfarande drar fördel av den Drosophila GAL4/UAS systemet för att uttrycka ett betesprotein fuserat med en tagg Tandemaffinitetsrening (TAP) i gylf neuroner in vivo och sedan implementerar två rundor av rening med användning av ett TAP förfarande liknande det som ursprungligen etablerades jäst en för rening av interagerande protein-komplexet. Vid slutet av detta förfarande, är en blandning av flera olika proteinkomplex som erhållits vars molekylära identiteter kan bestämmas genom masspektrometri. Validering av kandidatproteiner kommer att gynnas av reSource och enkel att utföra förlust av funktion studier i flugor. Liknande tillvägagångssätt kan tillämpas på andra gylf vävnader. Vi tror att kombinationen av genetiska manipulationer och detta proteomic förhållningssätt i gylfen modellsystem har en enorm potential för att ta itu med grundläggande problem inom neurobiologi och därefter.
Introduction
Att definiera de molekylära vägar eller nätverk som förmedlar en viss biologisk process är en av de slutliga målen i biomedicinsk forskning. Fly genetiker har berott mycket på termins genetik, särskilt modifieringen genetiska skärmar (både förstärkare och suppressor skärmar), för att identifiera faktorer som samverkar, parallellt med, eller uppströms eller nedströms av en gen av intresse. Men framåt genetik skärmar ofta gånger misslyckas med att identifiera viktiga gener som, när muterade, orsakar dödlighet i tidiga utvecklingsstadier, eller gener med funktionell redundans och ersättning vars förlust av funktion endast orsaka subtila defekter som är svåra att göra mål. Ett sätt att övervinna denna svårighet är att screena för direkta protein-proteininteraktioner. För mer än ett decennium, en växande lista av biokemiska metoder, bland annat jäst två-hybrid, fag display, kemisk tvärbindning, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), osv. har använts för att undersöka protein-protein-interaktioner. Var och en av dessa metoder har sin egen uppsättning av styrkor och svagheter i fråga om känslighet och specificitet. Bland dem, gör det möjligt för TAP-metod för detektion av fysisk interaktion enligt nästan fysiologiska betingelser bevarar specificitet och enhetlighet 2 och innefattar förmågan att sträcka sig till hög genomströmning analyser 3,4.
TAP Metoden utvecklades ursprungligen i jäst genom Rigautand kollegor 1. I denna metod är ett protein av intresse uttrycks med en TAP-taggen. TAP-taggen hyser två oberoende affinitetsbindande domäner: en Protein En domän som binder till IgG och en kalmodulinbindande domän. De två domänerna är separerade av en TEV (Tobacco Etch Virus)-klyvningsställe. En sådan kombination tillåter två oberoende rundor av affinitets reningar för att tillräckligt minska ospecifika bindningar och berika specifika bindningar 1. För detta exempel, är TAP metod en mycket kraftfull method för att identifiera in vivo-interaktioner av ett givet protein, även om överuttrycker det exogena proteinet kan göra den mer benägen att associera med proteiner som normalt gör inte komplex med dess endogena motsvarighet. Sedan dess utveckling, har TAP metoden använts i många andra system, inklusive cellkulturbaserade system 5,6 och andra in vivo modellsystem 6-9. Här beskriver vi en anpassning av TAP-metod i Drosophila. Vi genererar första pUAST-NTAP och pUAST-CTAP vektorer för att underlätta kloning och fusion av TAP-taggen för att antingen N-eller C-terminalen av genen av intresse. Den UAS-TAP-märkta transgenen uttrycks sedan i nervsystemet under kontroll av en neuronal GAL4 förare 10. Härnäst kommer ett stort antal av vuxna flugan huvuden samlas in, vilket har hög halt av neurala celler och är lätta att separera från andra delar av kroppen efter frysning baserat på storleksskillnader. De vuxna huvuden är homogeniseras och rensas by sekventiella centrifuge och supernatanten är föremål för en TAP förfarande som beskrivs nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generera UAS-TAP-märkta Transgena Flies
- Generera pUAST-TAP-märkta DNA-konstruktioner.
- Bestäm vilken sida (N-eller C-terminalen) hos betesprotein TAP-taggen bör vara kondenserad till, baserat på proteinets struktur / funktion. Se diskussionen för mer information.
- Subklona cDNA-kodande regionen av genen av intresse in i de multipla kloningsställena (MCS) i pUAST-NTAP eller pUAST-CTAP vektorer för att generera N-eller C-terminal-taggade UAS-TAP-transgener, respektive. Se figur 1 för detaljerade kartor och användbara restriktionsställen och läsramar.
- Generera UAS-TAP-märkta transgena flugor.
- Generera transgena flugor efter standardprotokoll som använder P-element-medierad insättning 11. Ett antal injektions tjänst är kommersiellt tillgängliga.
- Korsa neuronal GAL4 förare (dvs. BG380-GAL4) till varje enskild transgen linje och bestämma proteinexpressionsnivåerav varje rad genom western blöt (med peroxidas anti-peroxidas-antikropp) och / eller immunfärgning (med anti-TAP-antikroppen). I allmänhet är en transgen linje med en proteinexpressionsnivå som ligger nära det endogena proteinet rekommenderas för TAP förfaranden. Se diskussionen för mer information.
- PerformGAL4/UAS-based räddningsförsök för att bekräfta funktionaliteten av TAP-märkta transgener om förlust-av-funktion mutanter av generna av intresse finns. Välj en transgen som väsentligt kan rädda de muterade fenotyper för följande TAP experiment.
2. Förbered Prover för TAP Tillvägagångssätt
- Generera en fluga lager som bär både en neuronal GAL4 drivrutin (t.ex. BG380-Gal4) och den valda TAP-märkta transgenen för att underlätta utbyggnaden av fluga prover. Samla F1 avkommor av GAL4 förare och UAS-transgenen kors i sällsynta fall när ovanstående kombinationen orsakar överlevnad och tillväxt nackdel. </ Li>
- Samla småskaliga prov och optimera lys förutsättning för solubilisering av TAP-märkta proteinet.
- Gör en serie av lyseringsbuffertarna med hjälp av en kombination av de icke-joniska detergenter NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) och Triton X-100 (0,05-0,5%). Se tabell 1 och diskussion för mer information.
- På toppen av en CO2-pad, använd # 5 pincett för att dissekera 20 vuxna huvuden från TAP transgen uttrycker flugor och samla dem i ett 1,5 ml rör för att testa varje lysbuffert skick.
- Tillsätt 100 ul testning lysbuffert till röret och homogenisera huvudena genom strök upp och ned med en plastmortelstöt och sedan lägga till ytterligare 100 ul testning buffert.
- Snurra huvud lysatet vid 21.500 x g under 10 min (4 ° C), och separera supernatanten och pelleten efter centrifugering. Tillsätt 25 ul 2x SDS laddningsbuffert till pelleten och 10 ul 4x SDS laddningsbuffert till 30 ul av supernatanten respektive.
- Koka två prover för 5 min och analysera dem sida vidSidan med användning av SDS-PAGE och efterföljande Western Blöt med PAP-antikropp. Bestämma lösligheten av förhållandet TAP-proteinnivåer i supernatanten vs pelleten.
- Förbered provet i stor skala
- Expandera och samla vuxna flugor.
- Expandera neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene lager i flaskor och vända flaskorna var 3 dagar till ackumulerade 250 flaskor används för samlingen.
- Samla 1-3 dagar gammal vuxen flyger in i 50 ml koniska rör, sätter röret i flytande kväve omedelbart djupfryst flugorna. Förvara flugorna i en -80 ° C frys. Notera att volymen av flugorna inte får överstiga 2/3 av 50 ml rör.
- Samla gylfhuvuden (utföra detta steg på toppen av pulveriserad torris).
- Ta ut kyld siktarna och mortel från -80 ° C frys och sätta dem på torris, helst i en stor ishink. Stack två USA standardtestsiktar med en nr 25 på the toppen och nr 40 vid botten.
- Ta de frysta flugor ut och släppa dem i flytande kväve och hålla flugorna där i ca 10 min. Vortex eller skaka rören kraftigt bryta huvuden, ben och vingar från kropparna.
- Häll blandningen till den övre sikten och sedan skaka siktar kraftigt samtidigt som du håller båda siktar tillsammans. Efter siktning, kommer de organ stanna på den övre sikten, flyga huvuden kommer att kvarhållas på den nedre sikten och ben, vingar och annat skräp kommer att falla till torris. Separera de båda siktarna och töm i farten huvuden till den kalla murbruk.
- Homogeni flugan huvuden
- På toppen av torris, slipa huvudena med mortel och mortelstöt till pulverformiga partiklar, sedan överföra pulvret till en 15 ml glas Dounce Tissue Grinder som var förkyld på is.
- Mät vikterna av kvarnen före och efter provhuvudet hälldes i det, och sedan beräkna hur mycket huvudet sample väger. Sammanlagt 6-15 gram av gylf huvuden kommer att vara tillräcklig för varje TAP experiment justering i enlighet med de expressionsnivåer av proteinet. Tillsätt 15 ml iskall homogeniseringsbuffert (lysbuffert optimeras i steg 2,2) till pulver och sedan slaglängd med den stora spelmortelstöt tills det är lätt för mortelstöt för att gå upp och ner. Håll glaset kvarnen på is hela tiden.
- Förbered supernatanten för TAP
- Överför homogenatet till en höghastighetscentrifug-rör och centrifugering under 20 min vid ~ 50.000 x g (4 ° C). Överför supernatanten till ett nytt höghastighets centrifugrör och upprepa centrifugeringen en gång till.
- Överför supernatanten till ett ultracentrifugrör och utföra en 40 min ~ 250.000 xg spin att ytterligare rensa supernatanten. Den överstående är redo för reningsförfaranden tandem affinitet efter ultracentrifugering.
- Expandera och samla vuxna flugor.
3. TAP Rening Följande avsnitt var härledda från Séraphin lab TAP protocol 12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )
- Utför IgG pärla affinitetsrening
- Förbered IgG sepharose pärla medan proverna som centrifugeras. Tvätta 400 pl IgG pärla 3x i en 15 ml Falcon rör med 10 ml kall IgG tvättbuffert. För varje tvättning gungas röret försiktigt under 2 min och sedan centrifugera ner kulorna vid 1000 xg i en annan 2 min. Vid slutet av den tredje tvättningen, avlägsna buffert och lämna endast de pärlor i röret.
- Försiktigt överföra den klarerade supernatanten (~ 15 ml) i 15 ml rör innehållande IgG-pärlor. Inkubera pärlor och hjärnan lysat mix vid 4 º C på en nutator 2 timmar.
- Sätt upp en ren och tom mikrokolonn med ca 15 ml total volym i det kalla rummet. Ladda IgG pärla blandningen genom stadigt hälla blandningen i kolonnen, försök att inte fälla någonluftbubblor inuti kolonnen. Låt kulorna att bosätta sig i kolumnen och bufferten för att sakta rinna genom självfall.
- Tvätta kolonnen noggrant med 10 ml kall IgG tvättbuffert efter hela hjärnan lysat har strömmat genom fasta IgG-kolumnen. Upprepa tvätta 2x. OBS: låt aldrig pärlan torka i luften.
- Utför TEV klyvnings
- Efter den tredje tvätten, tvätta kolonnen igen med 10 ml TEV klyvningsbuffert. Detta steg förbereder IgG pärla som sequestrates betet komplex för TEV klyvning.
- Precis innan den sista droppen av TEV-buffert är på väg att rinna ut, satte ett lock på botten av kolonnen för att blockera flödet, tillsätt 1,3 ml TEV-buffert innehållande 130 enheter av TEV enzymet till kolonnen, och sedan säkert cap toppen av kolonnen. Se till kolonnen försluts väl i båda ändar.
- Vrid-kolonn vid 18 ° C under 2 h för att göra det möjligt för TEV-enzym för att klyva peptiden vid TEV platsen och frigöra proteinkomplex while lämnar bakom protein A domän peptid bunden till IgG sepharose pärlor.
- Utför Calmodulin pärla affinitetsrening
- Förbered Calmodulin pärlor medan IgG-pärlor inkuberas med TEV-enzymet. Tvätta 200 il Calmodulin pärlor i en 15 ml Falcon rör 3x, varje gång med 10 ml kall Calmodulin bindande buffert. För varje tvättning försiktigt vicka rör under 2 min på en nutator och sedan centrifugera ner kulorna vid 1000 x g under 2 min. Vid slutet av den tredje tvättningen, ta ut all buffert och lämna endast de pärlor i röret.
- Vid slutet av TEV inkubationen (steg 3.2.3), returnera IgG kolumnen tillbaka till det kalla rummet och sätta den rakt upp. Låt pärlorna sedimentera under 10 min.
- Ta bort det övre locket och botten lock, och sedan samla in 1,3 ml TEV klyvningsprodukt i en 15 ml Falcon rör. Låt bufferten tömmas helt. Lägg till ytterligare 200 l TEV buffert i kolonnen för att driva ut de döda volymen för kolonnen, samla in flåg i samma rör.
- Lägg till 4,5 ml av Calmodulin bindningsbuffert och 4,5 pl 1 M CaCl2 till 1,5 ml TEV klyvningsprodukt samlas ovan. Den CaCl 2 tjänar till att titrera EDTA i TEV buffert. Överför 6 ml blandning till röret innehållande de kalmodulin pärlor och rotera röret vid 4 ° C på en nutator under 1 timme.
- Ställ upp en annan ren och tom mikrokolonn med ca 10 ml total volym i det kalla rummet. Fyll på Calmodulin kornsblandningen på kolonnen och låt den rinna av gravitationen.
- När all lösning har runnit igenom fasta Calmodulin kolumnen, tvätta kolonnen två gånger, vardera med 10 ml kall Calmodulin bindande buffert. OBS: undvika att störa Calmodulin pärlor och försöka hålla ytan på kulorna så platta som möjligt under tvätten.
- Eluera betet komplexet från Calmodulin kolonn.
Direkt efter tvätt, eluera Calmodulin kolonnen med fem fraktioner av 200 ^ kall Calmodulin elueringsbuffert. För varje fraktion genom att försiktigt tillsätt 200 | il elueringsbuffert till kolonnen och samla upp eluatet med ett märkt 1,5 ml Eppendorf-rör. Upprepa detta 4x. - Analysera proteinkomplex av SDS-PAGE
- Ta en liten alikvot från vardera av de fem fraktionerna (ca 30 | il) och tillsätt SDS laddningsbuffert. Koka proverna i 5 min och ladda proverna sida vid sida med proteinmolekylmarkörer i en gradient (4-15%) SDS-PAGE-gel.
- Efter proven har helt löst i gelén, stoppa elektrofores och färga gelen med alla G-250-baserade känsliga kolloidalt Coomassie färgningsförfaranden som "blå silver" färgning 13. Silverfärgning är valfri men inte att föredra, eftersom det inte är helt kompatibla med den efterföljande analysen masspektrometri. Förvara resten av eluatet i en -80 ° C frys för ytterligare analys såsom masspektrometri för att avslöja de molekylära identiteten hos det renade proteinkomplexet. Selene diskussion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi våra ansträngningar att identifiera Highwire-interagerande proteiner i gylfen hjärnan. Highwire (HIW) och dess ryggradsdjur och ryggradslösa homologer är enorma ubiquitin ligas som reglerar utvecklingen och reparation av nervsystemet 14. De delar ett antal mycket konserverade funktionella domäner. Men deras molekylära handlingar är inte helt klart. Arbete som utförts i masken, fluga och mus ledde till den aktuella arbetsmodellen som HIW fungerar som en E3-ligas och som en byggnadsställning protein för att underlätta bildandet av en multi-subenhet ubikvitinering komplex, som reglerar tids och celltyp-specifika neuronala funktioner genom Kombinationen av att interagera med olika kofaktorer och inriktade på olika ubiquitin substrat. För att identifiera HIW-associerade ubiquitination komplex, först genererade vi en N-terminal taggade UAS-TAP-HIW transgen som är fullt fungerande med att rädda hiw mutantfenotypen 15. Ca 10 g av vuxen fly huvuden som uttrycker endast TAP eller TAP-HIW transgena proteiner samlades och utsattes för TAP förfaranden sida vid sida enligt ovan. Slutliga eluaten från båda reningar analyserades med SDS-PAGE och därefter silverfärgning. Masspektrometri identifierat en lista på proteiner i TAP-HIW endast prov, inklusive Drosophila FSN (DFsn, en F-box protein) och Rae1 (figur 2). Efterföljande genetiska och biokemiska analyser visade att HIW och DFsn arbeta tillsammans som SCF-liknande E3 ubiquitin ligas komplicerat att reglera synaptiska struktur och funktion 16, och Rae1 associerar med HIW in vivo och hindrar synaptiska överväxt 17. Denna funktion av Rae1 är åtminstone delvis uppnås genom dess förmåga att främja HIW proteinstabilitet via skyddande HIW från autophagic nedbrytning, som avslöjar en ny mekanism som selektivt styr HIW protein överflöd under synaptic utveckling 17.
Figur 1. Vektorer för generering av TAP-märkta transgena flugor. (A) Kartan i pUAST-NTAP konstruera. (B) Kartan i pUAST-CTAP konstruera. De multipla kloningsställena (MCS) i båda konstrukten är märkta med en hållare, där enkelslipade restriktionsställen presenteras med röd färg. (C) primära sekvensen visar de multipla kloningsställena av kranens vektorer med läsramen för TAP-taggen. För att underlätta subkloning, finns ytterligare två NTAP konstruktioner genereras från den ursprungliga pUAST-NTAP: pUAST-NTAP +1 och pUAST-NTAP +2. Tillsammans med tre NTAP konstrukt omfattar alla tre möjliga läsramar för att inrymma användningen av MCS. Alla vektorer är konstruerade med hjälp av NTAP eller CTAP fragment ursprungligen genereras iSeraphin Lab 1. Klicka här för att visa en större bild.
. Figur 2 Rening av Highwire-interagerande proteiner från fluga hjärna med TAP reningsVuxen huvuden från flugor som uttrycker TAP. (BG380-GAL4, UAS-TAP) eller TAP-HIW (BG380-GAL4, UAS-TAP-HIW) i nervsystemet uppsamlas, homogeniserades och utsattes för TAP rening, respektive. De slutliga Eluaten analyserades genom en-dimensionell SDS-PAGE-gel följt av silverfärgning. Pilen huvudet indikerar betesprotein HIW och asterisken indikerar en stympad TAP-protein på grund av TEV-klyvning. I TAP-HIW provet är en lista av proteiner identifierades genom massspektrometri, inklusive HSC-70, β-tubulin, Rae1 och DFsn (indikerat med pilar). Denna siffra är modifierad från figur 1a i Tian et al. 17 Klicka här för att visa en större bild.
| Buffert | Komposition | Kommentarer |
| Lysbuffert | 50 mM Tris-HCl pH 7,5 | OBS: 1) Lägg DTT och proteas och proteasomhämmare strax före användning. |
| 125 mM NaCl | 2) Visar här är en lyseringsbuffert med 0,5% NP40. Se diskussion för ändringar på nonjoniska tvättmedel. | |
| 5% glycerol | ||
| 0,5% NP40 | ||
| 1,5 mM MgCl2 | ||
| 25 mM NaF | ||
| 0,2 mM DTT | ||
| (Följande är proteas och proteasomhämmare) | ||
| 1 mM Na-3 VO 4 | ||
| 0,05 mM MG-115 | ||
| 1 mM PMSF | ||
| Proteashämmare mix (Sigma P8340) | ||
| Proteashämmare cocktail (Roche 04693159001) | ||
| IgG tvättbuffert | 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml av 2 M förrådslösning) | |
| 150 mM NaCl (3 ml av 5 M förrådslösning) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 ml av 10%-lager) | <td>||
| H 2 0 till 100 ml slutlig | ||
| TEV klyvningsbuffert | 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml av 2 M förrådslösning) | OBS: lägg DTT strax före användning. |
| 150 mM NaCl (3 ml av 5 M förrådslösning) | ||
| 0,1% NP40 (1,0 ml av 10%-lager) | ||
| 0,5 mM EDTA (100 pl av 0,5 M förrådslösning) | ||
| 1 mM DTT (100 | il av 1 M förrådslösning) | ||
| H 2 O till 100 ml final | ||
| Calmodulin bindningsbuffert | 10 mM β-merkaptoetanol (69,7 | il-lager) | |
| 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml av 2 M förrådslösning) | ||
| 150 mM NaCl (3 ml av 5 M förrådslösning) | ||
| 1 mM Mg-acetat (100 pl av 1 M förrådslösning) | ||
| 1 mM imidazol (100 ul av 1 M förrådslösning) | ||
| 2 mM CaCl2 (200 pl av 1 M förrådslösning) | ||
| 0,1% NP40 (1 ml av en 10%-lager) | ||
| H 2 O till 100 ml final | ||
| Calmodulin elueringsbuffert | 10 mM β-merkaptoetanol (69,7 | il-lager) | |
| 10 mM Tris-Cl pH 8,0 (0,5 ml av 2 M förrådslösning) | ||
| 150 mM NaCl (3 ml av 5 M förrådslösning) | ||
| 1 mM Mg-acetat (100 pl av 1 M förrådslösning) | ||
| 1 mM imidazol (100 ul av 1 M förrådslösning) | ||
| 10 mM EGTA (2 ml av en 0,5 M förrådslösning) | 0,1% NP40 (1 ml av en 10%-lager) | |
| H 2 O till 100 ml final |
Tabell 1. Sammansättning av buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tandemaffinitetsrening (TAP)-metoden erbjuder en dubbel reningsprotokoll som tillåter isolering och anrikning av proteinkomplex genom två oberoende affinitetsreningssteg. Utformningen av TAP-taggen är inte begränsad till vad som anges i detta protokoll, andra proteinbindande domäner och motiv är också tillämpliga om buffertförhållandena justeras i enlighet därmed. Ett bra exempel på andra TAP-taggar är det GS-TAP-tagg, en kombination av en G-protein och en streptavidin-bindande motiv, designad av Giulio Superti-Furga grupp som syftar till att rena proteinkomplex i odlade däggdjurscellinjer 18. GS-TAP anpassades senare för att studera protein-proteininteraktion i Drosophila S2-celler och embryon 19. En nyligen JUPITER publikation av Bailey et al. Visade hur GS-TAP procedur utfördes med cellodling lysat 20. Här presenterade vi användningen av TAP-taggen i Drosophila neurala vävnader (adult huvuden) för storskaliga proteomik screening. Detta protokoll kan eventuellt anpassas till andra vävnader som tillåter storskalig provsamling, såsom embryon. De vuxna kroppar som samlats på den övre sikten (steg 2.3.2.3) kan också användas för TAP, vilket kan vara en mycket utmanande uppgift. Lysbufferten måste ändras och kondition att förhindra de massiva proteaser som finns i mag-tarmkanalen som mest och det första reningsförfarandet avsevärt förkortas för att minska exponeringstiden av proteinerna till proteaser. Även olika TAP taggar kräver olika hanteringar och buffertvillkor för affinitets reningar, de allmänna principerna för TAP är desamma. Nedan diskuterar vi frågor som kommer att påverka kvaliteten på TAP resultat.
Framgången av TAP tillvägagångssätt beror på att generera höger transgen. För det första måste TAP-taggen i sig inte den övergripande konformationen av betesproteinet, vilket är avgörande för att behålla sin förmågaatt interagera med sina fysiologiska bindningspartners. Således är det viktigt att bestämma var att fusera TAP-taggen för att genen av intresse. Kan göras Beslutet grundar sig på tidigare studier av proteinet, i synnerhet information om dess struktur eller funktionella epitode-märkta transgener. Om sådan information inte är tillgänglig, tagging betet proteinet vid N-eller C-terminala parallellt rekommenderas. Därefter kan utföras funktionella räddningsexperiment för att bestämma vilka transgenen som skall användas. För det andra bör de expressionsnivåer av det transgena proteinet vara nära den för det endogena proteinet. Detta är särskilt viktigt eftersom det Gal4/UAS systemet kör normalt uttryck av transgenen vid olika tidpunkter och på en mycket högre nivå jämfört med de kroppsegna proteiner, som antingen kan öka falska positiva eller orsaka oväntade konsekvenser som förändrar profilen av samspelet proteinet nätverk i cellerna. Till exempel kan överuttrycker byggnadsställningar proteiner Cause dominanta negativa effekter och överuttrycker proteiner som besitter enzymatiska aktiviteter, såsom kinaser, ofta gånger orsakar gain-of-function effekter, vilka båda kan i sin tur påverkar möjligheten för deras endogena bindningspartners för att interagera med dem. Sålunda bör GAL4/UAS systemet undvikas vid tidpunkten för och nivån av expression av genen av intresse är avgörande för bevarandet av de endogena interaktioner som endast är närvarande under normala betingelser. Istället bör expression av TAP-taggade transgen styras under sin egen promotor. Detta kan uppnås antingen genom att ersätta UAS-sekvensen med den endogena promotorsekvensen, eller genom att fusera TAP-sekvens i ram med exonal sekvens i ett genom-DNA-fragment som innehåller hela lokus för genen av intresse 21. I vissa fall kan det TAP experiment utföras i en förlust av funktion mutant bakgrund av genen av intresse för att minska konkurrensen från det endogena proteinet för incorporating i multiproteinkomplex. För detta exempel, ett protein null bakgrund, om sådana finns, erbjuder en idealisk förutsättning för att helt eliminera den endogena proteinet. Med hjälp av genetisk mutant bakgrunden kommer alltid att öka chansen att ge resultat med högre kvalitet.
Löslighet av betet protein är en annan avgörande faktor för framgång. Nonjoniska detergenter används vanligtvis i lysbuffert för att lösa upp plasmamembranet och bibehåller proteinkomplexet, lösligt och intakt i ett tillstånd som är i närheten av den fysiologiska miljön. Emellertid, beroende på huruvida de proteiner av intresse är membranintegrerade eller-associerade proteiner, kan sammansättningen och koncentrationen av icke-joniska detergenter vara avgörande för att solubilisera betesprotein. 0,1-0,3% NP40 är ofta tillräcklig för att solubilisera cytosoliska proteiner. För membranproteiner, är en kombination av NP40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) och Triton-X-100 (0,05-0,5%) ibland att löslighetenLize och berika tillräckligt med proteiner för TAP experimentet. Eftersom emellertid en stringent lysbuffert tenderar att störa svagare protein-proteininteraktioner, måste en balans nås på vilken tillräckligt lösliga betesproteiner finns närvarande i provet, medan på samma gång en majoritet av protein-proteininteraktioner är bevarade. En allmän princip är att alltid försöka använda så få typer av rengöringsmedel med den lägsta koncentrationen.
För att underlätta felsökning, är det starkt rekommenderat att spara en liten delmängd av prov från varje steg av de två reningar. Efterföljande SDS-PAGE och proteinfärgning / Western-analys på de alikvoter tillåta nivåerna av betesprotein och den sekventiella anrikning av vissa proteinspecies som skall övervakas. Till exempel, om en plötslig reduktion av betesprotein detekterades i alikvot av flödet ut efter TEV klyvning (steg 3.3.3), är det troligt att betet proteinet förlorades under IgG vulst tvättning (steg 3.1.4) . En Possible orsak kan vara otillräcklig detergentkompositionen av IgG-tvättbuffert. Det finns en kraftig nedgång på sammansättningen och koncentrationen av rengöringsmedel i IgG-tvättbuffert (0,1% NP-40 bara) jämfört med lysbuffert. Betet proteinet kan vara känsliga för dessa förändringar och ta avstånd från den IgG-del på kulorna. Justering av IgG tvätt mot lyseringsbuffert kan hjälpa till att lösa problemet. Alternativt, om än mindre troligt, TEV klyvning (steg 3.2) får inte ha arbetat tillräckligt för att släppa betet innehåller komplex av IgG-pärlor. Stegen värda en andra inspektion är den jämvikt av IgG-pärlor med TEV buffert (steg 3.2.1) och enzymaktiviteten kan felhantering dämpa enzymet.
Kom ihåg att även med den två-stegs rening, kommer det fortfarande att vara falska positiva och proteiner som dras ned ospecifikt närvarande i den slutliga TAP-renat komplex. Ett sätt att identifiera de icke-specifika interaktioner, vidstone delvis, är att inkludera en styr TAP hjälp av TAP-only transgen parallellt med TAP-taggade transgen i TAP reningsexperiment. Proteiner som identifierats i TAP-enda förfarande bör tas bort från den förteckning som anges i TAP-transgen rening.
En framgångsrik TAP kommer att rena en blandning av proteiner som är potentiellt förknippade med proteinet av intresse in vivo. Nästa steg är den molekylära identifieringen av dessa proteiner och masspektrometri är vanligen används för detta ändamål. Beroende på resultaten från SDS-PAGE och experimentet behov, kan de molekylära identiteter i det renade proteinkomplex fastställas i följande två sätt: 1) varje enskild proteinband kan skäras ut ur gelén och utsattes för en låg- komplexitet LC-MS/MS, eller 2) att eluera fraktionen som innehåller det innehåll toppprotein (normalt den andra eluering) direkt kan utsättas för måttlig komplexitet LC-MS/MS. Ett sådant skott-gun proteomic tillvägagångssätt kommer potentiellt identifiera alla proteiner i komplexet, beroende på det dynamiska området av MS-utrustning 22.
Sammanfattningsvis presenterar vi en metod för att identifiera protein-proteininteraktioner i neurala vävnader i en genetisk modell organism - fruktflugan. Det finns ett antal fördelar med att tillämpa TAP metod till flyga: 1) fruktflugor har en kort livslängd, så det är relativt enkelt och snabbt att generera transgena flugor och för att erhålla vävnad i stor mängd, båda är avgörande för TAP strategi, 2) i farten genomet fullt kommenterad och innehåller 70% av sjukdomsframkallande gener mänskliga, och 3) viktigast av allt, är det lätt att funktionellt validera och karakterisera den kandidat interagerande proteiner i flugor. Det finns omfattande resurser tillgängliga i gylfen forskarsamhället för karakterisering av en viss gen, såsom transgena baserade RNAi samling intressant att studera vävnadsspecifik förlust-av-funktion för en majoritet av genens, muterade och brist alleler för de flesta av genen loci, samt cDNA-kloner och transgener användbara för gain-of-function studier. Vi tror att flugan TAP-metoden kommer att bli ett värdefullt tillskott till den verktygslåda som används i fluga labb. I framtida perspektiv, kan denna metod kombineras med fluga beteende paradigm och människa-sjukdomsmodeller för att undersöka förändringen av protein-proteininteraktioner nätverk som svar på särskilda villkor och stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar EUROSARF för att skicka oss jäst TAP uttryckningsplasmider. Vi är också tacksamma för redaktionell hjälp från Ryan Labadens. Detta arbete stöddes av en NIH / NINDS bidrag (R01NS070962) till CW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U.S.A. standard test sieve No. 25 | Fisher Scientific | 04-881-18 | |
| U.S.A. standard test sieve No. 40 | Fisher Scientific | 04-881-21 | |
| Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml | Kimble Chase | 885300-0015 | |
| IgG sepharose beads | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 cm x 20 cm | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 cm x 15 cm | Bio-Rad | 737-4716 | |
| Calmodulin beads | Stratagene | 214303 | |
| Coors Mortar and Pestle | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protease Inhibitor Mix | Sigma | P8340 |
References
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).
- Gavin, A. C., et al. Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery. Nature. 440, 631-636 (2006).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440, 637-643 (2006).
- Forler, D., et al. An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes. Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).
- Li, Y. The tandem affinity purification technology: an overview. Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).
- Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry. Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).
- Xu, X., et al. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bachmann, A., Knust, E. The use of P-element transposons to generate transgenic flies. Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Candiano, G., et al. Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Tian, X., Wu, C. The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm. J. Physiol. , (2013).
- Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements. J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).
- Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth. Neural Dev. 2, 16 (2007).
- Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons. Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).
- Burckstummer, T., et al. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system. Fly. 2, 229-235 (2008).
- Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification. J. Vis. Exp. (60), e3643 (2012).
- Wu, Y., et al. A Drosophila model for Angelman syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).
- Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R.
