Milliseconde conformationnels changements dans les protéines résolues par Photothermal déviation du faisceau
Summary
Nous rapportons ici l'application de la technique de déflexion de faisceau photothermique en combinaison avec un composé de calcium mis en cage, DM-nitrophen, pour surveiller microsecondes et une milliseconde dynamique et énergétique des changements structurels associés à l'association de calcium à une sonde calcique neuronal, Regulatory Element aval Antagoniste Modulator .
Abstract
déviation du faisceau photothermique avec photo-acoustique de la calorimétrie et réseau thermique appartient à la famille des méthodes photothermiques qui surveillent les temps un profil de volume et d'enthalpie changements de lumière induit des changements conformationnels de protéines sur microseconde à la milliseconde des échelles de temps qui ne sont pas accessibles à l'aide traditionnelle d'arrêt -flux instruments. En outre, étant donné que les changements globaux dans le volume et / ou l'enthalpie sont sondés, ces techniques peuvent être appliquées à des protéines et d'autres macromolécules biologiques qui n'ont pas un fluorophore et une étiquette ou d'un chromophore. Pour suivre la dynamique et de l'énergétique de changements structurels associés à Ca 2 + se lier à des transducteurs de calcium, de tels capteurs calciques neuronaux, un composé de calcium en cage, DM-nitrophen, est utilisé pour la photo-déclenchement d'une augmentation rapide (τ <20 ps) en calcium libre concentration et le volume associé et enthalpie changements sont sondés en utilisant une technique de déviation du faisceau photothermique.
Introduction
méthodes de photo-thermique tels que la calorimétrie photoacoustique, déviation du faisceau photothermique (APB), et des réseaux transitoires couplé avec une excitation laser nanoseconde représentent une alternative puissante aux transitoires spectroscopies optiques pour les études résolues en temps de courte durée intermédiaires 1,2. Contrairement aux techniques optiques, tels que l'absorption transitoire et la spectroscopie IR, qui contrôlent le profil temporel des changements d'absorption dans le chromophore environnante; techniques photothermiques détecter la dépendance temporelle de l'évolution de la chaleur / volume et donc sont des outils précieux pour l'étude des profils de temps de optiquement processus «silencieux». Jusqu'à présent, la calorimétrie photoacoustique et réseau transitoire a été appliquée avec succès pour étudier la dynamique de conformation des processus photo-induites, y compris la migration de ligand diatomique dans globines 3,4, interactions ligand avec la protéine du capteur d'oxygène FixL 5, électronique et le transport des protons dans l'hème-cuivre oxydases 6 une photosystème II ainsi que photo-isomérisation dans la rhodopsine 7 et dynamique conformationnelle de cryptochromes 8.
Pour étendre l'application des techniques photothermiques de systèmes biologiques qui manquent un chromophore interne et / ou fluorophore, la technique PBD a été combiné avec l'utilisation du composé en cage à photo-déclenchement d'une augmentation de la concentration de ligand / substrat à l'intérieur de quelques microsecondes ou plus rapide, en fonction de sur le composé encagé. Cette approche permet la surveillance de la dynamique et de l'énergétique de changements structurels associés à la liaison ligand / substrat de protéines qui manquent un fluorophore interne ou chromophore et sur l'échelle de temps qui ne sont pas accessibles par des instruments arrêt flux commerciaux. Ici, une demande de PBD pour surveiller la thermodynamique du composé de cage, Ca 2 + DM-nitrophen, photo-clivage, ainsi que la cinétique de liaison de Ca 2 + pour le domaine C-terminal de la sonde calcique neuronal vers le basflux réglementation élément antagoniste Modulator (DREAM) est présenté. Le Ca2 + est libéré par photo-Ca 2 + DM-nitrophen à moins de 10 microsecondes et lie de nouveau à une cage unphotolysed avec une constante de temps d'environ 300 microsecondes. D'autre part, en présence d'un apoDREAM cinétique supplémentaire se produisant sur l'échelle de temps d'une milliseconde est observée et reflète la liaison à la protéine ligand. L'application de PBD pour sonder les transitions conformationnelles dans les systèmes biologiques a été quelque peu limitée en raison des difficultés instrumentales; alignement par exemple difficile de la sonde et du faisceau pompe pour obtenir un signal fort PBD et reproductible. Cependant, une conception minutieuse d'une instrumentation mise en place, un contrôle précis de la température, et un alignement précis de la sonde et la pompe faisceau fournissent un signal cohérent et robuste PBD qui permet de contrôler le volume en temps résolu et changements d'enthalpie sur un large échelle de temps de 10 microsecondes à environ 200 ms. En outre, modifications de la procédure expérimentale pour assurer la détection d'échantillon et de référence traces sous température identique, la composition du tampon, de l'orientation de la cellule optique, la puissance du laser, etc réduit sensiblement l'erreur expérimentale dans les volumes et les enthalpies de réaction mesurés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le principe physique derrière procédés photothermiques qui est une molécule de photo-excité dissipe de l'énergie en excès par relaxation vibrationnelle à l'état de base, ce qui entraîne un chauffage thermique de la 1,12 solvant environnant. Pour les solvants tels que l'eau, ce qui produit une expansion de volume rapide (AV th). Molécules à l'état excité peuvent également subir des processus photochimiques qui entraînent des changements de volume non thermiques (AV <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (MCB 1021831, JM) et J. & E. Programme de recherche biomédicale (Floride ministère de la Santé, JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
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