Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Submillisecond konformasjonsendring Endringer i Proteiner løst ved Photothermal bjelkenedbøying

doi: 10.3791/50969 Published: February 18, 2014

Summary

Her rapporterer vi en anvendelse av photothermal stråleavbøyningsspeil teknikk i kombinasjon med et bur kalsium sammensatte, DM-nitrophen, for å overvåke mikrosekund og millisekund dynamikk og energetics av ​​strukturelle endringer knyttet til kalsium assosiasjon til en neuronal kalsium sensor, Nedstrøms Regulatory Element Antagonist Modulator .

Abstract

Photothermal stråleavbøyningsspeil sammen med foto-akustisk kalorimetri og termisk rist tilhører familien av photothermal metoder som overvåker tid profilerte volum og entalpi endringer av lys indusert konformasjonsendringer i proteiner på mikrosekund til millisekund tidsskalaer som ikke er tilgjengelige ved hjelp av tradisjonell stopp -flyt instrumenter. I tillegg, siden generelle endringer i volum og / eller entalpi blir analysert, er disse teknikker kan brukes til proteiner og andre Biomacromolecules som mangler en fluorofor og eller en kromofor etikett. Å overvåke dynamikken og energetics av strukturelle endringer knyttet til Ca 2 + binding til kalsium transdusere, slike nevrale kalsium sensorer, et bur kalsium sammensatte, DM-nitrophen, er ansatt til foto-trigger en rask (τ <20 usekunder) økning i fritt kalsium konsentrasjon og den tilhørende volum-og entalpi-endring blir analysert ved hjelp av fototermiske stråleavbøyningsspeilet teknikk.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bilde-termiske metoder som fotoakustisk kalorimetri, photothermal stråleavbøyningsspeil (PDB), og forbigående rist kombinert med nanosekund laser eksitasjon representerer et kraftig alternativ til forbigående optiske spectroscopies for tid-løst studier av kortvarige mellom 1,2. I motsetning til optiske teknikker, slik som transient absorpsjon og IR-spektroskopi, som overvåker tidsprofilen for absorpsjon endringer i kromofor omkring; photothermal teknikker detektere den tidsavhengighet av varme / volumendringer og derfor er verdifulle verktøy for å undersøke tidsprofiler av optisk "stille" prosesser. Så langt har fotoakustiske kalorimetri og forbigående rist blitt brukt til å studere conformational dynamikken i foto-indusert prosesser, inkludert diatomic ligand migrasjon i globins 3,4, ligand interaksjoner med oksygen sensor protein FixL 5, elektron og proton transport i heme-kobber oksidase 6 ennd photo II samt foto-isomerization i rhodopsin 7 og conformational dynamikk i cryptochrome åtte.

For å utvide anvendelsen av fototermiske teknikker til biologiske systemer som mangler en intern kromofor og / eller fluorofor, ble PBD teknikk i kombinasjon med bruken av bur forbindelsen til foto-trigger en økning av ligand / substrat-konsentrasjon i løpet av noen få mikrosekunder eller raskere, avhengig på bur sammensatte. Denne tilnærmingen tillater overvåking av dynamikk og energetics av ​​strukturelle endringer knyttet til ligand / substrat binding til proteiner som mangler en intern fluoroforen eller kromofor og på tidsskala som ikke er tilgjengelig med kommersielle stop-flow instrumenter. Her en anvendelse av PBD å overvåke termodynamikk av buret forbindelsen, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-spaltning, så vel som kinetikken for Ca 2 + tilknytning til det C-terminale domene av de neuronale kalsium sensor nedstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) er presentert. Ca 2 + er foto løslatt fra Ca 2 + DM-nitrophen innen 10 usekunder og rebinds til en unphotolysed bur med en tidskonstant på ~ 300 usekunder. På den annen side, i nærvær av apoDREAM en ytterligere kinetisk inntreffe på millisekund tidsskalaen er observert og reflekterer den ligand-binding til proteinet. Anvendelsen av PBD å sondere konformasjonsforandringer overganger i biologiske systemer har vært noe begrenset på grunn av de instrumentelle vanskeligheter, f.eks krevende innretting av sonden og pumpestråle for å oppnå en sterk og reproduserbar PBD signal. Imidlertid er en nitid utforming av en instrumentering set-up, en nøyaktig kontroll av temperaturen, og en forsiktig justering av sonden og pumpestråle tilveiebringe en konsistent og robust PBD signal som tillater overvåking av tidsoppløst volum-og entalpi-endring på et bredt tidsskala fra 10 usekunder til ca 200 msek. Videre modifiseringsjoner av den eksperimentelle fremgangsmåte for å sikre deteksjon av prøve-og referanse spor under identiske temperatur, buffersammensetning, optisk celle orientering, laserkraft, etc. reduserer den eksperimentelle feil i målte reaksjonsvolumer og enthalpies betydelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Eksempel Forberedelser

  1. Gjennomføre prøveopparbeidelse og alle prøve manipulasjoner i et mørkt rom for å hindre en uønsket uncaging.
  2. Solubilisere DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimetoksyfenyl) - N, N, N ', N'-tetrakis-[(oksy-karbonyl)-metyl] -1,2-etandiamin) i 50 mM HEPES buffer, 100 mM KCl, pH 7,0 til en endelig konsentrasjon på 400 pM (ε 350nm = 4,330 M -1 cm -1 9).
  3. Legg CaCl 2 fra 0,1 M stamløsning for å oppnå et ønskelig forhold på [Ca2 +]: [DM-nitrophen]. For proteiner med K d for Ca 2 + forening større enn 10 mikrometer, forholdet mellom [Ca 2 +]: er [DM-nitrophen] av 1:01 foretrekke å hindre binding av foto utgitt Ca 2 + til Uncaged DM-nitrophen . Faktisk, med tanke på K d verdi for DM-nitrophen å være 10 nM, og den totale konsentrasjon av DM-nitrophen og Ca 2 + som 400 mM, ~ 90% av et kalsiumbindende proteinetmed K d = 10 pM vil være i apoform. På den annen side, for studium av Ca 2 +-binding til proteiner med K d <10 mikrometer, er det å foretrekke å minske [Ca2 +]: [DM-nitrophen] forholdet til 0,95 til å hindre Ca 2 + kompleksdannelse med apo- protein før buret foto-dissosiasjon.
  4. Oppløseliggjøre referanseforbindelsen, K 3 [Fe (III) (CN) 6] eller Na 2 CrO 4, i den samme buffer som for prøven.

2. Sette opp eksperimentet

  1. Den grunnleggende eksperimentelle konfigurasjon er vist i figur 2..
  2. Bruk et fint hull (P 2) for å justere diameteren av sonden stråle (632 nm produksjon av He-Ne-laser, ~ 5 mW lasereffekt) til 1 mm, og forplante sondestråle gjennom sentrum av en celle som plasseres i et temperatur kontrollerte celleholderen med en M en speil.
  3. Bruk et speil (M 2) bak prøven å sentrere sonden strålenpå et senter av posisjon følsom detektor.
  4. Fokus sondestråle på midten av kapselen på en slik måte at forskjellen i spenningen mellom de to øverste dioder og to nederste dioder samt forskjellen i spenning mellom de to dioder på venstre og høyre side av sensoren er null.
  5. Deretter forme en diameter av pumpestråle, en 355 nm utgang Q-koblet Nd: YAG-laser, FWHM 5 nanosekunder) ved bruk av et 3 mm pinhole (P 1) som er lagt inn mellom to 355 nm laser-speil.
  6. Copropagate pumpestråle gjennom sentrum av kyvetten som vist i figur 2.. Det er viktig at begge laserstråler forplanter seg gjennom midten av den optiske celle i nesten kolineær måte for å oppnå en målbar avbøyning vinkel og dermed høy amplitude av PBD signal. Under eksperimentelle betingelser, vinkelen på skjæringspunktet mellom sonden og pumpestråler er mindre enn 15 °.
  7. Bruk en referanseforbindelse for å justere sonden og pumpenstrålen for å oppnå en tilfredsstillende PBD signal, det vil si en god S / N-forhold og stabil PBD amplitude på lengre tidsskalaer (~ 100 ms).
  8. Justere posisjonen til pumpestråle i forhold til sondestråle ved en trinnvis regulering av 355 nm laser-speil.
  9. Måle amplituden av PBD referansesignal som en forskjell mellom to topp-og bunnfotodioder i stilling følsomme detektoren. Den PBD-signalet skal fremvise en rask økning i amplitude på en rask time-skala (<10 usekunder) og holde seg stabilt på 100 msek tidsskala som demonstrert i figur 3. Den skudd til skudd variabilitet av PDB amplituden er innenfor 5% av den signalamplitude og signalet reproduserbarhet blir i hovedsak påvirket av vibrasjoner.
  10. Kontroller linearitet i PBD signalamplituden i forhold til den frigjorte varmeenergi ved å måle den lineære avhengighet av PBD signal på eksitasjon lasereffekten og på antall Einsteins absorbert, E en= (1-10-A), hvor A svarer til referanse absorbans ved eksitasjon bølgelengde.
  11. Hold lasereffekten under ca 1000 μJ og absorbansen av prøven / referanseforbindelse ved eksitasjon bølgelengde mindre enn 0,5 for å forhindre multiphoton absorpsjon og reduksjon av pumpestråleeffekt, henholdsvis, for å sikre linearitet av PBD-signalet.

Tre. PBD Målinger

  1. Begynn med målingen av PBD spor for referansen. Plasser løsning av referanseforbindelsen i et 1,0 cm x 1,0 cm eller 1,0 cm x 0,5 cm kvartscelle, og plassere cellen i temperaturkontrollerte holderen. Begge veilengder gi sammenlign PBD amplitude.
  2. Merker referanse PBD signal som en funksjon av temperaturen i temperaturområdet 16-35 ° C med temperaturtrinn på 3 ° C.
  3. Ved hvert temperaturendringer, kontrollere posisjonen av sonden trålen på posisjonen følsomme detektor og rejustere posisjonen til midten av detektoren om nødvendig.
  4. Kontroller linearitet av PBD-signalet som en funksjon av [(dn / dt) / C-p ρ] sikt i henhold til ligning 2..
  5. Plasser prøveløsningen i den samme optiske cellen som for referanseforbindelsen holde den samme retning av den optiske cellen som for referansemåling.
  6. Merker eksempel PBD spor i samme temperaturområde som for referanse-og kontrollere linearitet av prøven PBD amplitude med hensyn til [(dn / dt) / C-p ρ] sikt.

4. Data Analysis

Størrelsen av avbøyningen er direkte proporsjonal med volumendringen på grunn av prøven oppvarming (ΔV th) og nonthermal volumendring (ΔV nonth) i henhold til ligning 1:
Ligning 1
Amplituden av prøven (A S) Og referanse (A r) PBD signal kan bli beskrevet ved hjelp av ligningene 2 og 3, respektivt.
Ligning 2

Ligning 3

PBD-signalet er direkte proporsjonal med instrumentrespons parameter (K), og antallet av Einsteins absorbert (E a). Det første leddet i ligning 2, (dn / dt) (1/ρC p) Q, svarer til den signalendring på grunn av den varme som frigjøres i væsken. Den dn / dt leddet representerer den temperaturavhengige endring i brytningsindeksen, er ρ tettheten av oppløsningsmidlet, er C p varmekapasiteten. Alle parametere er kjent for det destillerte vann, og kan bestemmes for en bufferoppløsning ved å sammenligne en PBD signal for referanseforbindelsen i destillert vann og i en egnet buffer. Q er den mengden varme returned til løsningsmidlet. Den ρ (dn / d ρ) begrepet er en enhet-mindre konstant som er temperaturuavhengig i temperaturområdet 10-40 ° C 10. Ín abs sikt tilsvarer endringen i brytningsindeks på grunn av tilstedeværelsen av absorberende arter i løsningen, og det er neglisjerbar dersom bølgelengden av sonden trålen er forskjøvet i forhold til absorpsjons-spektra av alle arter i oppløsningen. Signalet som oppstår fra referanseforbindelsen (A r) er uttrykt ved hjelp av ligningen 3, hvor E h ν er fotonenergien ved eksitasjonsbølgelengde, E h ν = 80,5 kcal / mol for 355 nm eksitasjon.

  1. Ta amplituden av referanse PBD signal som forskjellen mellom pretrigger og etter trigger PBD signal som vist i figur 3.. På lignende måte, bestemme amplituden av den raskt (A s hurtig) og langsom fase (A s langsom) Av prøven PBD signal.
  2. For å eliminere den instrumentrespons-parameter, K, skalere amplituden av prøven PBD signal med amplituden av PBD signal for referansen. Forholdet av prøvesignalet med referansesignalet gir likning 4 og kan skrives som:
    Ligning 4
  3. Ved hjelp av denne ligning, bestemme den varme som frigjøres i løsning (Q) og nonthermal volumendring (ΔV nonth) forbundet med en foto-initiert reaksjon fra skråningen og skjæringspunkt, henholdsvis av et plott av [(A s / A r) E h ν] uttrykk versus temperaturavhengige term [(dn / dt) (1/ρCp)].
  4. Å avgjøre reaksjonen volum og entalpi endring for den raske og den langsomme prosessen, skalere observerte volum og entalpi endring til riktig kvanteutbyttet ifølge ligninger 5-7.
    "Equation
    Ligning 6

    Ligning 7

    For en flertrinnsprosess med kinetikken skjer på tidsskala mellom 10 usekunder ~ 200 ms, kan volumet og entalpi endringer forbundet med de enkelte trinn av reaksjonen bestemmes. Amplitudene og levetider for de enkelte trinn analyseres ved å tilpasse dataene til funksjonen F (t) som beskriver tidsprofilen for den volum-og entalpi-endring.
    Ligning 8
    hvor α 0 tilsvarer A er rask og α i tilsvarer en s langsom for hver enkelt prosess og τ i er levetiden for de enkelte reaksjonstrinn. Fra temperatur-avhengighet av hastigheten konstant for enkelte prosesser (k i = 1 / τ i) kan aktiverings entalpi og entropi parametre lett bestemmes ved hjelp av Eyrings plott.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Et representativt eksempel på PBD spor for Ca 2 + foto-frigjøring fra Ca 2 + DM-nitrophen er vist i figur 3.. Den raske fasen tilsvarer bildet-spalting av Ca 2 + DM-nitrophen og Ca 2 + frigjøring, mens den langsomme fasen reflekterer Ca 2 + binding til nonphotolysed buret. Plottet av prøven PBD amplitude for den raske og langsomme fase skalert til amplituden av referanseforbindelsen som en funksjon av temperaturen avhengig faktor [C p ρ / (dn / dt)]-faktor i henhold til likning 4 og skalering av den observerte mengde av varme som frigjøres i løsning og nonthermal volumendring til kvanteutbytte for DM-nitrophen foto-dissosiasjon (Φ = 0,18) 11 i henhold til ligningene 5-7, forutsatt at verdiene for reaksjons entalpi og volum for den raske fase (ΔV hurtig = - 12 ± 5 ml / mol og AH hurtig = -50 ± 20 kcal / mol) ogfor den langsomme fase (ΔV langsom = 9 ± 5 ml / mol og AH langsom = -23 ± 12 kcal / mol). Den PBD spor for Ca 2 + tilknytning til det C-terminale domene av de neuronale kalsium sensor Nedstrøms regulatorisk element Antagonist Regulator (drøm) (aminosyrerester 161-256) er vist i figur 4.. Ved Ca 2 + foto-dissosiasjon, foto utgitt ligand medarbeidere til C-terminal domenet DREAM med tiden konstant på 1,3 ± 0,3 msek ved 20 ° C. Fra temperaturavhengigheten av den observerte hastighetskonstant, aktiverings barriere for Ca 2 +-binding til det C-terminale domenet av drøm var bestemt til å være 9,2 ± 0.4 kcal / mol.

Figur 1
Figur 1. Reaksjon ordning for Ca 2 + DM-nitRohen uncaging og Ca 2 + binding til en Ca 2 + sensor. Skjematisk fremstilling av en foto-initiering av Ca 2 + utløst conformational overgang i Ca 2 + sensorer. Bilde-spalting av Ca 2 + DM-nitrophen fører til en økning i frie Ca 2 + konsentrasjon (protokoll 1), Ca 2 + tilknytning til Ca 2 + svinger og samtidig strukturell overgang (Protokoll 2). Klikk her for å se større versjon image .

Fig. 2
Figur 2. Photothermal stråleavbøyningsspeil set-up. Eksperimentelle oppsett for foto-termisk bjelkenedbøying målinger i kolineære konfigurasjon. M 1 og M 355 representerer høyenergi Nd: YAG laser-speil, L 1 representerer en konveks linse plassert foran en detektor, P 1 og P 2 representerer pinholes å forme pumpen og sonden strålediameter, henholdsvis, og DM er et dikroisk speil. F 1 representerer en 500 nm lange pass filter. Innfelt: Beam avbøyning på grunn av den fototermiske effekt. Sonden stråle som går gjennom en brytningsindeks-gradient opprettes på grunn av en temperaturgradient i et medium avbøyes med en vinkel θ og avbøyningsvinkel er målt ved hjelp av en posisjon følsom detektor. for å vise større bilde .

Figur 3 Figur 3. Representant PBD spor for Ca 2 + DM-nitrophen uncaging. PBD spor for Ca 2 + foto-release utgivelse fra Ca 2 + DM-nitrophen (vist i rødt) og referanseforbindelse (markert med blått). Forholdene: 1 mm DM-nitrophen i 20 mMHEPES buffer, 100 mM KCl pH 7,0 og 0,8 mM Ca 2 +. K 3 [Fe (CN) 6] ble brukt som referanseforbindelse. Absorpsjon av prøven ved 355 nm matchet med referanseforbindelsen (A 355nm = 0,4). Den optiske densitet på 0,4 er valgt fordi det er i området fra lineariteten til PBD-signalet som en funksjon av antallet av Einsteins absorbert . De PBD spor representerer et gjennomsnitt på 20 spor. Klikk her for å se større bilde .

Figur 4 content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4.jpg" width = "600px" />
Figur 4. Representant PBD spor for Ca 2 + DM-nitrophen uncaging i nærvær av C-terminal domenet av DREAM. PBD spor for Ca 2 + foto-utgivelse fra Ca 2 + DM-nitrophen i nærvær av C-terminal domenet av DREAM protein ( vist i rødt), og for referanseforbindelsen (vist i sort). Innfelt: Eyrings plottet ved hjelp av kinetikken utvinnes fra en eksponensiell desintegrasjon til prøven PBD spor ved forskjellige temperaturer. Forhold 400 pM DM-nitrophen, 390 mM CaCl 2, 100 uM C-terminale drøm i 20 mM HEPES buffer pH 7,4, 100 mM KCl, og 500 mM TCEP og spor for referanse under de samme betingelser. Den PBD spor for referanse representerer et gjennomsnitt av 20 spor, og at det for prøven er et gjennomsnitt av tre spor.hres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den fysiske prinsippet bak fototermiske metoder er at en foto-spent molekyl avleder overskytende energi via vibrasjons avkobling til grunntilstanden resulterer i termisk oppvarming av den omkringliggende oppløsningsmiddel 1,12. For løsningsmidler som vann, gir dette en hurtig volumøkning (ΔV th). Spent-statlige molekyler kan også gjennomgå fotokjemiske prosesser som resulterer i ikke-termiske volumendringer (ΔV nonth) på grunn av bindingen spalting / formasjon og / eller endringer i molekylstruktur som kan endre den molekylære dimensjoner av molekylet (s) (dvs. endringer i van der Waals volum), så vel som å endre ladningen fordeling av molekyl (er) resulterer i electrostriction effekter. Dette resulterer i en rask økning av det belyste volum som genererer brytningsindeksendring som kan bli analysert ved forskjellige optiske metoder. PBD tar fordel av det faktum at en brytningsindeks gradient etablert i prøven due til Gauss-formet laserpuls, forårsaker avbøyning av en sonde strålen forplanter seg gjennom prøven som vist i figur 2..

Den foto-termisk stråle avbøyning teknikk muliggjør bestemmelse av tidsoppløst volum og entalpi-endring for en lang rekke av fotoinitierte prosesser, inkludert reaksjonsmekanismen av foto-spaltning av ligand-heme-komplekser 13 og frigjøring av et bioaktivt molekyl fra buret Forbindelse komplekset 14, så vel som undersøkelser av fluoroforen triplet tilstand levetid. Denne tilnærmingen har flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle teknikker som vanligvis brukes for å overvåke strukturelle endringer i Biomacromolecules, slik som transient absorpsjonsspektroskopi og fluorescens. Ingen iboende kromofor / fluorofor eller flere protein-king er nødvendig siden strukturelle overganger blir undersøkt ved å overvåke endringer i volum og / eller i entalpi, selv om nærværet av en kromofor i prøven slik atrensning er nødvendig for å generere PBD signal. I tillegg, kinetiske parametre (hastighetskonstanter, aktivering entalpi og entropi) for prosesser som skjer på submicrosecond tidsskala, som ikke kan løses i stop-flømmingseksperimenter, er lett tilgjengelig i PBD målinger. Nylig har andre etikett frie deteksjonssystemer som probe en endring i brytningsindeksen eller et bølgelengdeforskyvning for eksempel overflate-plasmonresonans og biolag interferometri, henholdsvis, ble det utviklet og anvendt for å studere ligand / protein og protein / protein-interaksjoner. Imidlertid, i motsetning til PBD, disse metodene involverer immobilisering av biologiske målmolekyler på overflaten, og således kreves ytterligere bio-makromolekyl modifikasjoner av denne kan forstyrre den observerte prosessen.

Vi har vedtatt flere endringer vår instrumentering set-up som resulterte i bedre data reproduserbarhet og mindre feil i gjenvunnet termodynamiske parametre. Nærmere bestemt, ved anvendelse av enfiredobbelt foto-diode som PBD detektoren tillates en nøyaktig innretting av sonden strålen på detektoren stilling og dermed bedre reproduserbarhet signal, mens en ytterligere vibrasjons isolering av både sonden strålen og PBD-detektor ved hjelp av dempede monteringsstenger redusert støy av PBD-signalet og utvidet tidsskalaer tilgjengelige i PBD målinger. Vi ønsker å understreke at følsomheten av forsøket avhenger av tidsskalaen av hendelsen (e), og overvåking av langsommere prosesser (τ> 10 msek) er svært følsomme for instrumentering oppsett og eksperimentelle forhold. Også, å plassere et dikroisk speil foran prøvecellen forenkler en kolineære innretting av sonden og pumpetrålen, øker S / N forholdet for PBD signal.

De kritiske trinnene i protokollen inkluderer faste verifisering av linearitet av PBD-signalet som en funksjon av i) den temperaturavhengige faktor, [(dn / dt) / C-p ρ], ii) laser power, og iii) prøve / referanse absorbans ved eksitasjon bølgelengde. I tillegg er nøyaktig styring av temperaturen og identiske eksperimentelle forhold til prøve-og referansemålinger avgjørende for robuste PBD målinger og vellykket datainnsamling.

Den viktigste begrensningen av PBD teknikken minner kravet om at studert bio-makromolekyl bærer en foto-merkegruppe. Denne ulempe kan overvinnes ved anvendelse av ulike caged forbindelser. Faktisk, ny utvikling av nye bur strategier, inkludert bur peptider, bur protein og bur DNA åpner for bred anvendelse av PBD å overvåke komplekse biologiske systemer og prosesser, inkludert protein - peptid, og protein - protein interaksjoner samt raske kinetikk forbundet med DNA folding på fysiologisk relevante tidsskalaer. Strategien som presenteres her, viser tydelig at det i kombinasjon med en passende bur sammensatte system, PBD teknikker kan lett anvendes for åkarakterisere mikrosekund til millisekund strukturelle overganger forbundet med Ca 2 +-binding til kalsiumsensorer, så vel som til å overvåke små ligander interaksjoner med proteiner transdusere eller binding av substrat-molekyler til enzymer etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) og J. & E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid Life Technologies D-6814 DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) Sigma Adrich 0909C HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III) Sigma Aldrich 702587 reference compound for PBD measurements
Sodium chromate Sigma Aldrich 307831 reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm Edmund Optics 54-179 use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,  LeCroy Wave Surfer 42Xs 400 MHz bandwith
Nd:YAG laser Continuum ML II pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror Edmund Optics 47-324 laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror Edmund Optics 43-532 visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm Edmund Optics 62-649 pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens Thorlabs LB1844 a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror Thorlabs DMLP505 a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter Andower 500FH90-25 a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder Quantum Northwest FLASH 300  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
  2. Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251, (9-10), 1101-1127 (2007).
  3. Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37, (1-3), 73-79 (1990).
  4. Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101, (7), 977-986 (2007).
  5. Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochemistry. 44, (30), 10028-10036 (2005).
  6. Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579, (14), 3014-3018 (2005).
  7. Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
  8. Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413, (1), 128-137 (2011).
  9. Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, (17), 6571-6575 (1988).
  10. Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43, (11), 3887-3892 (1965).
  11. Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
  12. Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
  13. Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44, (4), 1006-1014 (2005).
  14. Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
Submillisecond konformasjonsendring Endringer i Proteiner løst ved Photothermal bjelkenedbøying
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection. J. Vis. Exp. (84), e50969, doi:10.3791/50969 (2014).More

Gonzalez, W. G., Miksovska, J. Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection. J. Vis. Exp. (84), e50969, doi:10.3791/50969 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter