Submillisecond konformasjonsendring Endringer i Proteiner løst ved Photothermal bjelkenedbøying
Summary
Her rapporterer vi en anvendelse av photothermal stråleavbøyningsspeil teknikk i kombinasjon med et bur kalsium sammensatte, DM-nitrophen, for å overvåke mikrosekund og millisekund dynamikk og energetics av strukturelle endringer knyttet til kalsium assosiasjon til en neuronal kalsium sensor, Nedstrøms Regulatory Element Antagonist Modulator .
Abstract
Photothermal stråleavbøyningsspeil sammen med foto-akustisk kalorimetri og termisk rist tilhører familien av photothermal metoder som overvåker tid profilerte volum og entalpi endringer av lys indusert konformasjonsendringer i proteiner på mikrosekund til millisekund tidsskalaer som ikke er tilgjengelige ved hjelp av tradisjonell stopp -flyt instrumenter. I tillegg, siden generelle endringer i volum og / eller entalpi blir analysert, er disse teknikker kan brukes til proteiner og andre Biomacromolecules som mangler en fluorofor og eller en kromofor etikett. Å overvåke dynamikken og energetics av strukturelle endringer knyttet til Ca 2 + binding til kalsium transdusere, slike nevrale kalsium sensorer, et bur kalsium sammensatte, DM-nitrophen, er ansatt til foto-trigger en rask (τ <20 usekunder) økning i fritt kalsium konsentrasjon og den tilhørende volum-og entalpi-endring blir analysert ved hjelp av fototermiske stråleavbøyningsspeilet teknikk.
Introduction
Bilde-termiske metoder som fotoakustisk kalorimetri, photothermal stråleavbøyningsspeil (PDB), og forbigående rist kombinert med nanosekund laser eksitasjon representerer et kraftig alternativ til forbigående optiske spectroscopies for tid-løst studier av kortvarige mellom 1,2. I motsetning til optiske teknikker, slik som transient absorpsjon og IR-spektroskopi, som overvåker tidsprofilen for absorpsjon endringer i kromofor omkring; photothermal teknikker detektere den tidsavhengighet av varme / volumendringer og derfor er verdifulle verktøy for å undersøke tidsprofiler av optisk "stille" prosesser. Så langt har fotoakustiske kalorimetri og forbigående rist blitt brukt til å studere conformational dynamikken i foto-indusert prosesser, inkludert diatomic ligand migrasjon i globins 3,4, ligand interaksjoner med oksygen sensor protein FixL 5, elektron og proton transport i heme-kobber oksidase 6 ennd photo II samt foto-isomerization i rhodopsin 7 og conformational dynamikk i cryptochrome åtte.
For å utvide anvendelsen av fototermiske teknikker til biologiske systemer som mangler en intern kromofor og / eller fluorofor, ble PBD teknikk i kombinasjon med bruken av bur forbindelsen til foto-trigger en økning av ligand / substrat-konsentrasjon i løpet av noen få mikrosekunder eller raskere, avhengig på bur sammensatte. Denne tilnærmingen tillater overvåking av dynamikk og energetics av strukturelle endringer knyttet til ligand / substrat binding til proteiner som mangler en intern fluoroforen eller kromofor og på tidsskala som ikke er tilgjengelig med kommersielle stop-flow instrumenter. Her en anvendelse av PBD å overvåke termodynamikk av buret forbindelsen, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-spaltning, så vel som kinetikken for Ca 2 + tilknytning til det C-terminale domene av de neuronale kalsium sensor nedstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) er presentert. Ca 2 + er foto løslatt fra Ca 2 + DM-nitrophen innen 10 usekunder og rebinds til en unphotolysed bur med en tidskonstant på ~ 300 usekunder. På den annen side, i nærvær av apoDREAM en ytterligere kinetisk inntreffe på millisekund tidsskalaen er observert og reflekterer den ligand-binding til proteinet. Anvendelsen av PBD å sondere konformasjonsforandringer overganger i biologiske systemer har vært noe begrenset på grunn av de instrumentelle vanskeligheter, f.eks krevende innretting av sonden og pumpestråle for å oppnå en sterk og reproduserbar PBD signal. Imidlertid er en nitid utforming av en instrumentering set-up, en nøyaktig kontroll av temperaturen, og en forsiktig justering av sonden og pumpestråle tilveiebringe en konsistent og robust PBD signal som tillater overvåking av tidsoppløst volum-og entalpi-endring på et bredt tidsskala fra 10 usekunder til ca 200 msek. Videre modifiseringsjoner av den eksperimentelle fremgangsmåte for å sikre deteksjon av prøve-og referanse spor under identiske temperatur, buffersammensetning, optisk celle orientering, laserkraft, etc. reduserer den eksperimentelle feil i målte reaksjonsvolumer og enthalpies betydelig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den fysiske prinsippet bak fototermiske metoder er at en foto-spent molekyl avleder overskytende energi via vibrasjons avkobling til grunntilstanden resulterer i termisk oppvarming av den omkringliggende oppløsningsmiddel 1,12. For løsningsmidler som vann, gir dette en hurtig volumøkning (ΔV th). Spent-statlige molekyler kan også gjennomgå fotokjemiske prosesser som resulterer i ikke-termiske volumendringer (ΔV nonth) på grunn av bindingen spalting / formasjon og / eller endringe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) og J. & E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
