Photothermal बीम नीचे को झुकाव द्वारा हल प्रोटीन में Submillisecond गठनात्मक परिवर्तन
Summary
यहाँ हम microsecond और मिलीसेकंड गतिशीलता और एक neuronal कैल्शियम सेंसर, डाउनस्ट्रीम नियामक तत्व विरोधी न्यूनाधिक करने के लिए कैल्शियम एसोसिएशन के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तन की ऊर्जा की निगरानी के लिए एक बंदी कैल्शियम परिसर, डीएम nitrophen, के साथ संयोजन में photothermal किरण विक्षेपन तकनीक का एक आवेदन पत्र की रिपोर्ट .
Abstract
एक साथ तस्वीर ध्वनिक उष्मामिति और थर्मल झंझरी के साथ Photothermal किरण विक्षेपन पारंपरिक स्टॉप का उपयोग नहीं पहुँचा रहे हैं कि समय तराजू millisecond के लिए microsecond पर प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन प्रेरित प्रकाश के समय प्रोफाइल मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन की निगरानी कि photothermal तरीकों के परिवार का है प्रवाह के साधन. मात्रा और / या तापीय धारिता में समग्र परिवर्तन की जांच कर रहे हैं इसके अलावा, इन तकनीकों का एक fluorophore और या एक क्रोमोफोर लेबल की कमी है कि प्रोटीन और अन्य Biomacromolecules के लिए लागू किया जा सकता है. 2 सीए के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता और ऊर्जा की निगरानी करने के लिए + कैल्शियम transducers, ऐसे neuronal कैल्शियम सेंसर, एक बंदी कैल्शियम परिसर, डीएम nitrophen, फोटो ट्रिगर करने के लिए स्वतंत्र कैल्शियम में एक तेजी से (τ <20 μsec) वृद्धि कार्यरत है के लिए बाध्य एकाग्रता और संबद्ध मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन photothermal किरण विक्षेपन तकनीक का उपयोग कर जांच की जा रही.
Introduction
ऐसे photoacoustic उष्मामिति, photothermal किरण विक्षेपन (पीडीबी), और nanosecond लेजर उत्तेजना के साथ मिलकर क्षणिक झंझरी के रूप में फोटो थर्मल तरीकों अल्पकालिक मध्यवर्ती 1,2 का समय हल पढ़ाई के लिए ऑप्टिकल spectroscopies क्षणिक के लिए एक शक्तिशाली विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं. ऐसे क्षणिक अवशोषण और आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में ऑप्टिकल तकनीक, के विपरीत, कि आसपास के क्रोमोफोर में अवशोषण परिवर्तन के लिए समय रुपरेखा की निगरानी; photothermal तकनीक ऑप्टिकली के समय प्रोफाइल की जांच के लिए कीमती उपकरण गर्मी / मात्रा में परिवर्तन के समय निर्भरता का पता लगाने और इसलिए कर रहे हैं "चुप" प्रक्रियाओं. अब तक, photoacoustic उष्मामिति और क्षणिक झंझरी सफलतापूर्वक globins 3,4, ऑक्सीजन सेंसर प्रोटीन के साथ ligand बातचीत में द्विपरमाणुक ligand माइग्रेशन सहित फोटो प्रेरित प्रक्रियाओं के गठनात्मक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है FixL 5, 6 oxidases इलेक्ट्रॉन और हीम तांबे में प्रोटॉन परिवहन एकएन डी प्रकाशतंत्र द्वितीय के साथ ही rhodopsin 7 और cryptochrome 8 में गठनात्मक गतिशीलता में फोटो isomerization.
एक आंतरिक क्रोमोफोर और / या फ्लोरोफोरे कमी कर रहे हैं कि जैविक प्रणालियों को photothermal तकनीक के इस्तेमाल का विस्तार, प्रवासी भारतीय दिवस तकनीक के आधार पर, फोटो ट्रिगर करने के लिए बंदी परिसर के उपयोग कुछ microseconds के भीतर ligand / सब्सट्रेट एकाग्रता में वृद्धि के साथ या तेजी से जोड़ दिया गया था बंदी परिसर पर. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता है ligand / सब्सट्रेट एक आंतरिक fluorophore या क्रोमोफोर कमी कर रहे हैं कि प्रोटीन के लिए और वाणिज्यिक ठहराव प्रवाह उपकरणों से सुलभ नहीं हैं कि समय पैमाने पर बाध्यकारी के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता और ऊर्जा की निगरानी. यहाँ पिंजरे परिसर, सीए की ऊष्मा 2 + डीएम nitrophen, फोटो दरार के साथ ही neuronal कैल्शियम सेंसर की सी टर्मिनल डोमेन के लिए सीए 2 + सहयोग के लिए कैनेटीक्स नीचे नजर रखने के लिए प्रवासी भारतीय दिवस के लिए एक आवेदन पत्रधारा नियामक तत्व विरोधी न्यूनाधिक (सपना) प्रस्तुत किया है. सीए 2 + 10 μsec भीतर तस्वीर जारी की सीए से 2 + डीएम nitrophen है और ~ 300 μsec की एक समय लगातार साथ एक unphotolysed पिंजरे में rebinds. दूसरी ओर, apoDREAM की उपस्थिति में मिलीसेकंड समय पैमाने पर होने वाली एक अतिरिक्त गतिज मनाया और प्रोटीन के लिए बाध्य ligand को दर्शाता है. जैविक प्रणालियों में गठनात्मक संक्रमण की जांच के लिए प्रवासी भारतीय दिवस का आवेदन किसी भी तरह वाद्य कठिनाइयों के कारण सीमित किया गया है, एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रवासी भारतीय दिवस संकेत प्राप्त करने के लिए जांच और पंप बीम की जैसे दुरूह संरेखण. हालांकि, एक उपकरण सेट अप की एक जटिल डिजाइन, तापमान का एक सटीक नियंत्रण, और जांच और पंप बीम का एक सावधान संरेखण एक व्यापक पर समय हल मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन की निगरानी की अनुमति देता है कि एक सुसंगत और मजबूत पीबीडी संकेत प्रदान 10 μsec लगभग 200 मिसे करने से समय पैमाने. इसके अलावा, modific मेंआदि समान तापमान, बफर रचना, ऑप्टिकल सेल अभिविन्यास, लेजर बिजली, के तहत नमूना और संदर्भ के निशान का पता लगाने के आश्वस्त करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया के ations काफी मापा प्रतिक्रिया मात्रा और enthalpies में प्रयोगात्मक त्रुटि कम कर देता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
photothermal तरीकों के पीछे भौतिक सिद्धांत एक फोटो उत्साहित अणु आसपास विलायक 1,12 के थर्मल ताप, जिसके परिणामस्वरूप राज्य भूमि को कंपन विश्राम के माध्यम से अतिरिक्त ऊर्जा dissipates है. जैसे पानी विलायकों के लिए, यह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एमसीबी 1021831, जेएम) और जे एंड ई. बायोमेडिकल रिसर्च प्रोग्राम (फ्लोरिडा स्वास्थ्य विभाग, जेएम) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
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