Summary
Wir beschreiben einen schrittweisen Verfahren zum Bilden von Drucklast und der linksventrikulären Hypertrophie in Wistar-Ratten durch Verengung der aufsteigenden Aorta unter Verwendung einer kleinen Metallclips. Dieses Modell wird weitgehend für das Studium Umbau Veränderungen während der Herzhypertrophie und zur Identifizierung und Bewertung von Strategien für die Regression von solchen Änderungen verwendet.
Abstract
Aufsteigend Aortakonstriktion ist die häufigste und erfolgreiche chirurgische Modell für die Erstellung von Drucküberlastung induzierte Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz. Hier beschreiben wir eine detaillierte chirurgisches Verfahren zum Bilden von Drucklast und Herzhypertrophie bei Ratten durch Verengung der aufsteigenden Aorta unter Verwendung einer kleinen Metallclips. Nach der Anästhesie wird die Luftröhre durch Einführen einer Kanüle durch einen Einschnitt auf halbem Weg zwischen zwei Knorpelspangen der Luftröhre intubiert. Dann wird ein Hautschnitt in der Ebene der zweiten Zwischenrippenraum an der linken Brustwand gemacht und Muskelschichten werden gelöscht, um den aufsteigenden Teil der Aorta zu lokalisieren. Die aufsteigenden Aorta wird auf 50-60% des ursprünglichen Durchmessers durch Anwendung einer kleinen Größe Titanclip verengt. Aortakonstriktion folgenden werden die zweiten und dritten Rippen mit Prolene Fäden angenähert. Die Trachealkanüle wird entfernt, sobald die Spontanatmung wieder hergestellt. Das Tier darf o erholenn die Heizkissen durch die schrittweise Senkung der Anästhesie. Die Intensität der Druckbelastung die durch Verengung der aufsteigenden Aorta wird durch die Aufnahme der Druckgefälle unter Verwendung von trans-Thorax zweidimensionalen Doppler-Echokardiographie bestimmt. Insgesamt ist dieses Protokoll ist sinnvoll, die Umgestaltung Veranstaltungen und kontraktilen Eigenschaften des Herzens während der allmählichen Entstehung und Progression von kompensierten Herzhypertrophie zu Herzversagen Bühne zu studieren.
Introduction
Kleintiermodelle sind die am meisten bevorzugten Werkzeuge für die Untersuchung der chronischen Veränderungen in der Entwicklung von Herzhypertrophie und seiner Progression von Herzinsuffizienz. Herzinsuffizienz Modelle von chirurgischen Methoden wurden ursprünglich entwickelt, wie bei Ratten diese Tiere sind am besten geeignet für die offene Brust chirurgische Verfahren, Echokardiographie und Bewertung der hämodynamischen Parameter. Sie bieten auch ausreichende post mortem Gewebeproben für die, zellulärer und molekularer Ebene Studien ein. Verengung der aufsteigenden Aorta ist eine der häufigsten und erfolgreiche chirurgische Modelle für die Erstellung von Drucküberlastung Herzinsuffizienz 2, 3. Dieses Modell ist gut geeignet, um die zellulären und subzellulären Umbau Veranstaltungen und kontraktilen Eigenschaften des Herzens während des Übergangs von Hypertrophie zur Herzinsuffizienz 4 studieren.
Ein großer Vorteil dieses Modells ist der schrittweise Beginn der Druckbelastung auf das Herz 5, </ Sup> 6. Dieses Modell ist aufgrund seiner langsamen, aber stetigen Fortschritt von Herzhypertrophie ausgeglichen zu dekompensierten Phase und schließlich zum Herzversagen Stadium klinisch relevant. Die Dauer für die Progression der Herzhypertrophie zu Herzversagen und den damit verbundenen physiologischen Veränderungen werden vor allem durch den Grad der Stenose beeinflußt 7 hergestellt. Aufsteigend Aortakonstriktion kann auf zwei Arten entweder mit Nähten oder durch Aufbringen von Metallklammern 8, 9 durchgeführt werden. Der Hauptvorteil der Verwendung einer metallischen Klammer für Aortakonstriktion ist, dass die chirurgische Verfahren weniger kompliziert. In diesem Verfahren muss man den überKlappenaufsteigenden Aorta zu lokalisieren und legen Sie den Clip um die Aorta, um gewünschte Niveau der Verengung zu erhalten. Eine Brust Retraktor ist nicht notwendig in dieser Prozedur. Aortenbandierung durch Vernähen benötigt mehrere chirurgische Manipulationen zum Platzieren der Nadel neben dem aufsteigenden Aorta und Vernähen um esproduzieren das gewünschte Niveau der Aortakonstriktion. Die letztere Technik ist zeitaufwendig, wenn sie mit der Verwendung von metallischen Clips für Aortakonstriktion verglichen. Die in diesem Video beschriebenen Methode veranschaulicht, die chirurgische Verfahren für die aufsteigenden Aorta Verengung in Ratten, die Bildung von Drucklastet linksventrikuläre Hypertrophie-Modell ermöglicht.
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Protocol
In Tierversuchen wurden nach Einholung der Bewilligung der Institutional Animal Ethikkommission durchgeführt. Wistar-Ratten wurden unter einem 12-Stunden-Zyklus dunkel zu hell, konstante Raumtemperatur (24 ± 2 ° C) mit Futter und Wasser ad libitum (nach den Richtlinien CPCSEA) untergebracht.
1) Pre-operative Pflege und Anästhesie
- Halten Ratte (ca. 200 g Körpergewicht) unter antibiotischer Dach 24 Stunden vor der Operation durch die Gabe von Amoxicillin oral (Dosis: 500 mg / L Wasser).
- Sterilisieren aller chirurgischen Instrumente (wie Scheren, Zangen, Clip-Applikator, Nähnadeln und Nadelhalter) durch Autoklavieren bei 121 ° C für 15 min.
- Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Tierkörpertemperatur um 37 ° C zu halten, um eine rasche Abnahme der Herzfrequenz zu vermeiden.
- Achten Sie darauf, um Austrocknung des Tieres vor und während der Operation zu vermeiden.
- Anesthetize die Ratte in einem Induktionskammer mit 3% Isofluran gemischt mit0,5 bis 1,0 l / min 100% Sauerstoff; Aufrechterhaltung einer Narkose mit Isofluran 1,5%.
- Überprüfen Sie das Pedal Reflex auf erfolgreiche Anästhesie bestätigen.
2) Herstellung der Operationsstelle
- Halten Sie die Ratte auf einem temperaturgesteuerten Heizkissen in der Rückenlage.
- Positionieren Sie ein Gummiband über Vorderzähne der Ratte, das Tier in Position zu halten, während der Anästhesie mit einer Nase Kegel.
- Entfernen Sie das Fell auf dem Ausschnitt und der linken Brustbereich der Ratte (vorzugsweise unter Verwendung eines Elektrorasierer).
- Desinfizieren Operationsstelle mit Povidon-Jod-Lösung und dann mit 70% igem Alkohol.
- Verwenden Sie eine sterile Abdeckung, um nur die Operationsstelle während des operativen Eingriffs aus.
Hinweis: Als zusätzliche Option für die Pflege der Tiere, können 0,25% Bupivicain ID (2,5 mg / kg) vor dem Einschneiden an jedem Einschnitt Website für lokale Anästhesie / Analgesie integriert werden.
3) Trachealintubation im Rat
- Einen kleinen Einschnitt an der Haut parallel zu der Luftröhre mit einem sterilen Skalpell vorsichtig getrennt und das darunter liegende Gewebe, um die Luftröhre freizulegen.
- Tragen Sie eine Krawatte aus Seide 4-0 Faden unterhalb der Luftröhre und hebe die Krawatte nach oben.
- Einen halben Weg Einschnitt zwischen zwei Knorpelspangen und legen Sie die Trachealkanüle in die Luftröhre der Ratte.
- Schließen Sie die Trachealkanüle zu einem Nagetier Ventilator für die Aufrechterhaltung einer Atemfrequenz von 50 Atemzüge / min, Atemvolumen von 1,70 ml und Inspirationszeit von 0,60 sec (für Ratten mit 200 g Körpergewicht).
4) Verengung der Aorta ascendens
- Nach dem Erfassen der Position der Rippen mit den Fingern, einen Hautschnitt von etwa 2 cm auf der linken Brustwand zwischen der zweiten und dritten Rippe.
- Trennen Sie die Zwischenrippenmuskeln und Schicht für Schicht einen Einschnitt etwa 1,5 cm lang zwischen der zweiten und dritten Rippe. (Pflege nehmen sollten, um Verletzungen an der Lunge zu vermeiden und gleichzeitig Einschnitt zwischen den Rippen)
- Fahren Sie die Rippen und suchen Sie den aufsteigenden Teil der Aorta.
- Eine kleine Größe Titan-Clip auf der aufsteigenden Aorta mit Hilfe eines Applikators, wobei genden die Aorta auf 50-60% des ursprünglichen Durchmessers.
- Nach der Aortakonstriktion ungefähr den zweiten und dritten Rippen mit 3,0 Prolene in einem unterbrochenen Naht Muster. Gleichzeitig halten Sie den Ventilator für etwa 2-4 Sekunden, um wieder aufgehen, in die Lunge.
- Aufdach die Muskelschichten mit 3,0 Prolene Nahtmaterial und Haut mit 4,0 Seidenfäden in einer unterbrochenen Naht Muster. Synthetische, nicht absorbierbare Nahtmaterialien können anstelle von Seide zum Vernähen der Haut verwendet werden.
- Entfernen Trachealkanüle aus der Ratte einmal die Spontanatmung wieder hergestellt.
- Schließen Sie die Luftröhrenöffnung mit 3,0 Prolene Nahtmaterial und die Hautschicht mit 4,0 Seidenfäden.
- Lassen Sie das Tier auf T erholener Heizungsauflage durch die schrittweise Senkung der Anästhesie-und Beatmungsgerät unterstützt die Atmung.
- In altersgleichen Scheinkontrolltiere, führen Tracheotomie und Thorakotomie ohne Verengung der aufsteigenden Aorta.
5) Postoperative Pflege
- Desinfizieren OP-Bereich mit PVP-Jod-Lösung.
- Als postoperative Analgesie, injizieren Tramadol intraperitoneal (10 mg / kg Körpergewicht / Tag) für 1 Woche.
- Inject sterile physiologische Kochsalzlösung intraperitoneal, wenn Anzeichen von Austrocknung nach der Operation (ca. 1 ml) angezeigt.
- Amoxicillin oral verabreichen, gemischt mit Trinkwasser, für sieben Tage (Dosis: 500 mg / L Wasser).
- Nehmen Sie die restlichen Seidenfäden von der Haut nach 10 Tagen nach der Operation unter Inhalationsnarkose.
6) Bestätigung der erfolgreichen Verengung der Aorta ascendens
- Führen Sie eine transthorakale zweidimensionale Doppler-Echokardiographie, um die Absicht zu bestimmensität der durch die Verengung der aufsteigenden Aorta erzeugte Drucklast.
- Anesthetize die Ratten eine Woche nach der Operation, wie oben beschrieben (Schritt 1.5)
- Platzieren des Ultraschallwandlers an der suprasternalen Lage, den Druckgradienten über dem verengten Abschnitt der aufsteigenden Aorta aufzunehmen.
Hinweis: Ratten, die mit einem Druckgefälle von etwa 60 mm Hg an der Aorta verengte Website wird schwerer kardialer Hypertrophie von ca. 8-10 Wochen nach der Operation zu entwickeln.
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Representative Results
In unseren Experimenten können wir mehr als 80% Überlebensraten zu erzielen. Die Wirksamkeit der Aortakonstriktion wurde, indem Doppler-Echokardiographie bestätigt. Ratten (n = 6) mit einem Druckgefälle von etwa 60 mm Hg bei der Aorta verengten Stelle wurden für 8 Wochen beobachtet und getötet, um die Entwicklung von Herzhypertrophie (Fig. 1) zu analysieren. Nach 8 Wochen nach der Operation Echokardiographie zeigte einen signifikanten Anstieg der linksventrikulären sind Parameter wie Ventrikelseptumdefekten Dicke, linksventrikulärer hinteren Wanddicke und eine Abnahme der linksventrikulären Innendurchmesser an den diastolischen Zustand, in Tieren, die Aortakonstriktion unterzog, im Vergleich zu scheinoperierten Kontrollen (Tabelle 1, Abbildung 2). Ein signifikanter Anstieg der Herzgewicht / Körpergewicht-Verhältnisse und die linksventrikuläre Gewicht / Körpergewicht-Verhältnisse wurden bei Ratten mit Aorten-Verengung (Tabelle 2, Abbildung 3) beobachtet. Diese Datendeuten darauf hin, dass 8 Wochen nach der Operation Ratten mit Aortakonstriktion entwickeln ein hohes Maß an Herzhypertrophie, im Vergleich zu scheinoperierten Kontrollen.
Fig. 1 ist. Echokardiogramm bei Ratten, die den Druckgradienten über die aufsteigenden Aorta. Aa) Der Vertreter Echokardiogramm von einer Ratte mit Verengung der Aorta und mit einem Druckgefälle von 63,0 mm Hg und Ab stellt Farb-Doppler-Echo der Website über die Aorta, wo Druckgefälle wurde. Ba) aus einer Schein gemessen Der Vertreter Echokardiogramm Bedienung Ratten mit einem Druckgefälle von 2,86 mm Hg und Bb Farbdopplerechos von der Seite in der Aorta, wo der Druckgradient war Maßnahme d. Dieser Druckanstieg Gradienten zeigt die erfolgreiche Streifenbildung der Aorta der Ratte, die teilweise Verengung der Aorta ascendens unterzog.
. 2 M-Modus-Echokardiogramm des linken Ventrikels bei Ratten mit Aortaverengung (A) und Kontrollratten (B) darstellt linksventrikuläre Abmessungen zum Zeitpunkt der Opferung 8 Wochen nach der Operation IVST = inter Ventrikelseptumdefekten Dicke. LVPWT = linksventrikulären Hinterwanddicke; LVID = linksventrikulären Innendurchmesser in der Diastole. Bei Ratten mit Aortakonstriktion eine signifikante Erhöhung der inter Ventrikelseptumdefekten Dicke kann linksventrikulären Hinterwanddicke und eine Abnahme der linksventrikulären Innendurchmesser an den diastolischen Zustand beobachtet werden.
Abbildung 3. Bilder des ganzen Herzen einer Ratte, die Verengung der Aorta (A) unterzogen und eine scheinoperierten Kontrollratte (B) 8 Wochen nach der Operation. Die Ratte mit Aortakonstriktion hat signifikante Herzhypertrophie im Vergleich zu scheinoperierten Kontrolle.
Tabelle 1 M-Mode-Echokardiographie-Parameter der Herz linken Ventrikels zum Zeitpunkt der Opfer, 8 Wochen nach der Operation unter IVST = Ventrikelseptumdefekt Dicke.. LVPWT = linksventrikulären Hinterwanddicke; LVID = linksventrikulären Innendurchmesser an diastolischen Zustand; AAC = aufsteigend Aortakonstriktion.
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Discussion
Es gibt mehrere chirurgische Modelle für die Induktion von Drucküberlastung sowie Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz. In Kleintiere, Lorell und Kollegen entwickelten das Modell haben wir hier beschrieben, und sie berichtet, das Auftreten von kompensierten Herzhypertrophie 8 Wochen nach Aortenbandierung 5. Herz Änderungen allmählich zu einer dekompensierten Zustand Fortschritt und dann bei Herzinsuffizienz führen. Der Hauptvorteil dieses Modells ist der schrittweise Beginn der Zunahme der linksventrikulären Druck und damit ähnlich klinischen Situationen bei chronischen Bluthochdruck. Es ist auch ein geeignetes Tiermodell zur Untersuchung der linken Herzversagen Lungenhochdruck 10.
Andere Tiermodelle für Drucküberlastung Herzversagen, wie Dahl empfindlich Ratten spontan hypertensiven Ratten und Ratten mit Verengung der Bauchaorta, entwickeln auch chronische Druckbelastung. Sie nehmen jedoch längere Zeiträume für die Progression from Herzhypertrophie zu Herzversagen. Die Wartungskosten der Versuchsratten ist daher auch eine höhere 1. deAlmeida und Kollegen beschäftigt Quer Aortakonstriktion zur Induktion der linksventrikulären Hypertrophie bei Mäusen 11. Die Technik umfasst Längssternotomie und Einfahren des Brustbeins und somit ist eine größere Herausforderung.
Achten Sie auf eine rasche Änderung der Anästhesie von Nase bis Intubation vor Thorakotomie und von Intubation nach den operativen Eingriffen an Nase Trachea Kegel. Ein alternatives Verfahren zur Intubation bei Ratten unter Verwendung von Polyethylenrohr für die endotracheale Intubation statt Tracheotomie. Diese Technik erfordert jedoch eine angemessene Fähigkeit. Es sollte darauf geachtet werden, um Verletzungen an der Lunge zu vermeiden und gleichzeitig Einschnitt zwischen den Rippen. Anwendung von Titan-Clips aus, um kritische Aortakonstriktion linken Kammer Stress, aber nicht stark genug, um akute Linksherzinsuffizienz und p produzierenulmonary Ödeme. Verwendung Prolene Nahtmaterial für die Angleichung der Rippen ist entscheidend für die erfolgreiche Wiederherstellung des Tieres. Während der Annäherung der Rippen, halten Sie den Ventilator für ca. 2-4 sec um wieder aufgehen, in die Lunge.
Wir hatten nur 20% operative Sterblichkeit in den Tieren und es gab keine postoperativen Komplikationen. Die Technik, die wir hier beschrieben wird, ist somit ein effizientes und geeignetes Werkzeug zur Untersuchung von chronischen pathophysiologischen Veränderungen in der Herzhypertrophie und progressive Herzinsuffizienz.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken Department für Biotechnologie der indischen Regierung für die finanzielle Unterstützung dieses Projektes. Ajith Kumar GS wurde mit hochrangigen Forschungsstipendium Rat für wissenschaftliche und industrielle Forschung, Regierung von Indien und Binil Raj mit hochrangigen Forschungsstipendium Indian Council of Medical Research, Regierung von Indien unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
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