Summary
Biz küçük bir metalik klip kullanarak çıkan aortun daralması ile Wistar sıçanlarda basınç aşırı ve sol ventrikül hipertrofisi oluşturmak için adım adım bir prosedür açıklanmaktadır. Bu model yaygın olarak kalp büyümesi sırasında yeniden değişiklikleri incelemek için ve bu değişikliklerin regresyonu için stratejiler belirlenmesi ve değerlendirilmesi için kullanılmaktadır.
Abstract
Aort daralma Artan kardiyak hipertrofi ve kalp yetmezliği kaynaklı aşırı basınç oluşturmak için en yaygın ve cerrahi başarılı bir modeldir. Burada, küçük bir metalik klip kullanarak çıkan aortun daralması ile sıçanlarda basınç aşırı ve kardiyak hipertrofisi yaratmak için detaylı bir ameliyat prosedürü tarif. Anestezi sonrasında, trakea trakea iki kıkırdak halkaları arasında yapılan bir yarım kesi yoluyla bir kanül sokularak entübe edilir. Sonra bir cilt kesi sol göğüs duvarında ikinci interkostal alanı düzeyinde yapılır ve kas tabakaları aort artan kısmını bulmak için temizlenir. Aorta, küçük boyutlu titanyum klibi uygulaması ile orijinal çapının% 50-60 daraltılmıştır. Aort daralma sonra, ikinci ve üçüncü prolen kaburga dikiş ile yaklaştırılır. Trakeal kanül çıkarıldıktan sonra spontan solunum yeniden kurulmuştur. Hayvan o geri bırakılıryavaş yavaş anestezi düşürerek ısıtma pedi n. Çıkan aort daralma yarattığı basınç yüklenmesinin yoğunluğu trans-torasik iki boyutlu Doppler-ekokardiyografi ile basınç degrade kayıt tarafından belirlenir. Genel olarak bu protokol, kalp yetmezliği aşamasına telafi kardiyak hipertrofinin arasındaki aşamalı başlangıcı ve gelişimi sırasında yeniden etkinliklerle kalbin kasılma özelliklerini incelemek için yararlıdır.
Introduction
Küçük hayvan modelleri, kardiyak hipertrofisi, kalp yetmezliği olan ilerleme gelişiminde kronik değişikliklerin çalışma için en çok tercih edilen araçlardır. Bu hayvanların açık göğüs cerrahi işlemler, hemodinamik parametreler ekokardiyografi ve değerlendirilmesi için en uygun olduğu gibi cerrahi yöntemlerle kalp yetmezliği modelleri orijinal olarak, sıçanlarda geliştirilmiştir. Onlar da hücresel doku ve moleküler düzeyde çalışmalar için 1 yeterli otopsi örnekleri sağlar. Çıkan aort darlığı basınç yüklenmesi kalp yetmezliği 2, 3 oluşturmak için en yaygın ve başarılı cerrahi modellerinden biridir. Bu model de hipertrofisi, kalp yetmezliği 4 geçiş sırasında hücresel ve alt hücresel yeniden olaylar ve kalbin kasılma özelliklerini incelemek için uygundur.
Bu modelin önemli bir avantajı, kalp 5 üzerindeki basınç yüklenmesinin kademeli başlangıcıdır </> 6 sup. Bu model, telafi kalp hipertrofiden dekompanse safhada ve nihayet kalp yetmezliği aşamasına yavaş ama istikrarlı bir ilerleme klinik olarak önemlidir. Kalp yetersizliği ve ilgili fizyolojik değişikliklere kardiyak hipertrofisi ilerlemesi için süresi esas olarak 7 üretilen stenoz derecesine etkilenmektedir. Artan sıkışma aort dikiş kullanarak ya da metal klipler 8, 9 uygulanmasıyla ya da iki şekilde yapılabilir. Aort daralma için bir metalik klip kullanmanın ana avantajı cerrahi daha az karmaşık olmasıdır. Bu yöntemde bir supra kapak çıkan aort bulmak ve daralma istenen seviyede elde etmek aort etrafında klibi eklemek zorundadır. Bir göğüs ekartör Bu prosedürde gerekli değildir. Dikiş ile aort bağlama çıkan aort yanında iğne yerleştirerek ve çevresinde dikilmeye daha fazla cerrahi manipülasyonlar gerektiriraort daralma istenilen düzeyde üretir. İkinci teknik aort daralması için metalik klip kullanımı ile karşılaştırıldığında, daha zaman alıcı olan. Bu video açıklanan yöntem oluşturma basıncı aşırı sol ventrikül hipertrofisi modeli sağlar: farelerde aort daralma artan için cerrahi prosedür gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri Kurumsal Hayvan Etik Kurul onayı alındıktan sonra yapıldı. Wistar sıçanları, ışık çevriminin (CPCSEA yönergelere göre) yiyecek ve su ad libitum ile sürekli oda sıcaklığında (24 ± 2 ° C) ile, 12 saat karanlık altında muhafaza edilmiştir.
1) Ameliyat öncesi Bakım ve Anestezi
- (: Su 500 mg / L doz) oral amoksisilin uygulanması ile ameliyattan önce antibiyotik şemsiye 24 saat sıçan altında (yaklaşık olarak 200 g vücut ağırlığı) tutun.
- 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav ile (örneğin makas, forseps, klip aplikatör, dikiş iğneleri ve iğne tutucu gibi) tüm cerrahi aletleri sterilize edin.
- Kalp hızında hızlı bir düşüş önlemek için 37 ° C civarında hayvanlar vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi kullanın.
- Ameliyat öncesi ve sırasında hayvanın dehidratasyonu önlemek için özen gösterin.
- Ile karıştırılmış% 3 izofluran ile bir indüksiyon odası içindeki sıçan anestezisi0.5-1.0 L / dk% 100 oksijen; % 1.5 izofluran ile anestezi korumak.
- Başarılı anestezi onaylamak için pedal refleksini kontrol edin.
Cerrahi Sitenin 2) hazırlanması
- Sırtüstü pozisyonda sıcaklık kontrollü bir ısıtma yastığı üstüne sıçan tutun.
- Bir burun konisi ile anestezi korurken pozisyonda hayvan tutmak için sıçan ön dişlerin üzerine bir lastik bant yerleştirin.
- Yaka kürk çıkarın ve (tercihen bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak) sıçan göğüs bölgesini bıraktı.
- Sonra povidon-iyot solüsyonu ve% 70 etil alkol ile birlikte cerrahi siteyi dezenfekte edin.
- Ameliyat prosedürü sırasında sadece cerrahi sitesini ortaya çıkarmak için steril bir örtü kullanın.
Not: hayvan bakımı için ek bir seçenek olarak,% 0.25 bupivakain ID (2.5 mg / kg) önce lokal anestezi / analjezi için her kesi yerinde incising için dahil edilebilir.
Rat 3) Trakeal Entübasyon
- Steril bir cerrahi bıçak kullanarak trakea cilt paralel küçük bir kesi yapmak ve dikkatle trakea maruz amacıyla altta yatan doku ayırmak.
- Trakea altında 4-0 ipek dikiş ipliğinin bir kravat uygulayın ve nazikçe yukarı kravat yükseltmek.
- İki kıkırdak halkaları arasında bir yarım kesi yapmak ve sıçan trakea içine trakeal kanül takın.
- / Dakika, 1.70 ml tidal hacmi ve (200 g vücut ağırlığına sahip bir sıçan için) 0,60 saniye inspirasyon süresi 50 solukluk bir solunum hızı sağlamak için bir kemirgen vantilatör için trakeal kanülün bağlayın.
Artan Aort 4) daraltma
- Parmaklarıyla kaburga konumunu algılamak sonra, ikinci ve üçüncü kaburga arasındaki sol göğüs duvarı yaklaşık 2 cm'lik bir cilt insizyonu olun.
- Tabakası ile interkostal kaslar tabakanın ayrılması ve ikinci ve üçüncü kaburga arasında yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda bir kesi yapar. (Bakım almak olmalıdırkaburgalar arasında kesi yaparken akciğerlere herhangi bir yaralanmayı önlemek için n)
- Kaburga geri çekin ve aort artan bölümünü bulun.
- Orijinal çapının% 50-60 aortu daraltıcı sayede bir aplikatör yardımıyla çıkan aort etrafında küçük ölçekli titanyum klip yerleştirin.
- Aort daralma sonra kesikli bir dikiş desen 3.0 prolen ile ikinci ve üçüncü kaburga yaklaşmaktadır. Aynı zamanda, akciğerleri yeniden şişirmek için yaklaşık 2-4 saniye boyunca ventilatör duraklama.
- 3.0 prolen sütür ve kesintiye dikiş desen 4,0 ipek dikişlerle deri ile kas tabakaları appose. Sentetik olmayan emilebilir dikişlerle deri dikilmesi için yerine ipek kullanılabilir.
- Bir kez spontan solunum yeniden kurulur sıçan trakeal kanül çıkarın.
- 3,0 prolen dikiş ve 4.0 ipek dikiş ile deri tabakası ile birlikte trakea açıklığı kapatın.
- Hayvan t kurtarmak için izino yavaş yavaş anestezi ve ventilatör destekli solunum düşürerek ped ısıtma.
- Yaştaki sham kontrol hayvanlarında, çıkan aortun daralması yapmadan trakeotomi ve torakotomi gerçekleştirin.
5) post-operatif Bakım
- Povidon-iyot solüsyonu ile cerrahi bölgeyi dezenfekte edin.
- Ameliyat sonrası analjezi için, 1 hafta (10 mg / kg vücut ağırlığı / gün) tramadol intra-peritoneal olarak enjekte edilir.
- Dehidratasyon bulguları cerrahi (yaklaşık 1 ml) sonra ortaya çıkarsa, steril serum fizyolojik intraperitoneal olarak enjekte edilir.
- Yedi gün (: su 500 mg / L doz) için, karışık içme suyu ile ağızdan amoksilin uygulayın.
- Inhalasyon anestezi altında ameliyat sonrası 10 gün, deriden kalan ipek sütür çıkarın.
Artan Aort Başarılı Konstrüksiyon 6) Onayı
- INTEN belirlemek için bir trans-torasik iki boyutlu Doppler ekokardiyografi-gerçekleştirinartan aort daralma tarafından üretilen basınç yüklenmesinin versitesi.
- Daha önce tarif edildiği gibi, dişi bir hafta ameliyat sonrası anestezisi (adım 1.5)
- Çıkan aort tahditli bölümü boyunca basınç gradyanı kaydetmek için yukarıda sternal konumunda ultrason transdüktörü yerleştirin.
Not: aort dar yerinde Hg yaklaşık 60 mm'lik bir basınç gradyanı ile sıçanlar yaklaşık 8-10 hafta ameliyattan tarafından ciddi kardiyak hipertrofisi gelişir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneylerde biz fazla% 80 sağkalım oranları elde edebiliyoruz. Aort daralma etkinliği Doppler gerçekleştirilerek teyit edilmiştir. Fareler (n = 6), aort daralma yerinde Hg ile yaklaşık 60 mm arasında bir basınç gradyanı ile 8 hafta boyunca gözlenmiştir ve kardiyak hipertrofi geliştirilmesi (Şekil 1) analiz etmek için kurban edilmiştir. 8 hafta sonra ameliyat sonrası ekokardiyografik değerlendirme sham ameliyat ile karşılaştırıldığında, bu tür aort daralma uygulanan hayvanlarda inter ventriküler septal kalınlığı, sol ventrikül arka duvar kalınlığı ve diyastolik devlet sol ventrikül iç çapı azalma, sol ventrikül parametrelerinde önemli bir artış göstermiştir kontrol (Tablo 1, Şekil 2). Kalp ağırlığı / vücut ağırlık oranlarında ve sol ventrikül ağırlık / vücut ağırlık oranlarında önemli bir artış aort daralma (Tablo 2, Şekil 3) ile farelerde gözlenmiştir. Bu veriler,sham, aort daralma ile 8 hafta ameliyat sonrası sıçan kalp hipertrofisi önemli bir düzeyde geliştirmek öneririz kontrolleri kullanılamaz.
Çıkan aorta boyunca basınç gradyanı temsil sıçanlarda Şekil 1.. Ekokardiyogram. Aa) aort daralma ve Hg ve Ab 63.0 mm bir basınç gradyanı sahip bir sıçanın temsilcisi ekokardiogram kumanda, basınç gradyan takliti gelen temsilci ekokardiogram. Ba) ölçüldü aort genelinde sitenin renkli Doppler yankı temsil Hg ve Bb 2.86 mm'lik bir basınç gradyanı olan sıçan basınç gradyanı ölçüsü oldu aort genelinde sitenin renkli Doppler yankı temsil d. Basınç gradyanı bu artış, kısmen artan aort daralma uygulanan farelerde aort başarılı bir bant gösterir.
.. Aort daralması (A) ve kontrol kurban zaman 8 hafta ameliyat sonrası IVST = arası ventriküler septal kalınlık sol ventrikül boyutları gösteren sıçanlar (B) ile sıçanlarda sol ventrikül Şekil 2 M-mod ekokardiyografi; LVADK = sol ventrikül arka duvar kalınlığı; Diyastolde LVID = sol ventrikül iç çapı. Aort daralması arası ventriküler septal kalınlığında önemli bir artış ile sıçanlarda, sol ventrikül arka duvar kalınlığı ve diyastolik devlet sol ventrikül iç çapı azalma görülebilir.
Şekil 3.. Aort daralma (A) uygulandı ve sahte kontrol sıçan (B) 8 hafta ameliyat sonrası çalıştırılan bir sıçan bütün kalplerin Görüntüleri. Aort daralması ile sıçan kontrol sham opere kıyasla önemli kardiyak hipertrofisi vardır.
Tablo 1 M-mod, kurban sırasında kalp sol ventrikül ekokardiyografik parametreleri, 8 hafta ameliyat sonrası IVST = arası ventriküler septal kalınlık..; LVADK = sol ventrikül arka duvar kalınlığı; Diyastolik devlet LVID = sol ventrikül iç çapı; AAC = aort daralma artan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basınç yüklenmesinin indüksiyon yanı sıra kalp hipertrofisi ve kalp yetmezliği için çeşitli cerrahi modelleri vardır. Küçük hayvanlarda, Lorell ve arkadaşları burada anlattığımız model geliştirdi ve kompanse kardiyak hipertrofisi 8 hafta sonrası aort bağlama 5 geçtiği bildirildi. Kardiyak değişikliklerin yavaş yavaş bir dekompanse duruma ilerleme ve sonra kalp yetmezliği ile sonuçlanabilir. Bu modelin en büyük avantajı, sol ventrikül basıncı artışı ve hipertansiyon, kronik klinik durumlara ve böylece benzer tedrici başlangıcıdır. Aynı zamanda, sol kalp yetmezliği ilişkili akciğer hipertansiyonu 10 incelemek için uygun bir hayvan modelidir.
Böyle Dahl duyarlı sıçanlarda, spontan hipertansif sıçanlarda ve abdominal aorta daralması ile sıçanlar gibi basınç yüklenmesi kalp yetmezliği için diğer hayvan modelleri, aynı zamanda kronik basınç yüklenmesi gelişebilir. Bununla birlikte, ilerleme f uzun zaman dilimlerini almakKalp yetmezliği rom kardiyak hipertrofisi. Deneysel sıçanların bakım maliyeti 1 nedenle de yüksektir. deAlmeida ve arkadaşları farelerde 11 sol ventrikül hipertrofisi uyarılması için enine aort daralma istihdam. Teknik median sternotomi ve sternum geri çekilmesini gerektirir ve dolayısıyla daha zordur.
Operatif girişimlerden sonra burun konisi için torakotomi öncesi ve entübasyon gelen entübasyon Trakeal burun konisi gelen anestezi hızlı bir değişim sağlamak. Sıçanlarda entübasyon için alternatif bir yöntem, entübasyon için polietilen tüp kullanılarak yerine trakeotomi gereğidir. Ancak, bu teknik yeterli beceri gerektirir. Bakım kaburgalar arasında kesi yaparken akciğerlere herhangi bir yaralanmayı önlemek için alınmalıdır. Sol ventrikül stres, akut sol ventrikül yetmezliği ve p üretmek kadar şiddetli değil, kritik aort daralma üretmek için yeterli titanyum klips uygulamasıulmonary ödem. Kaburga yakınlaştırılması için prolen dikişlerin kullanımı hayvanın başarılı kurtarma için çok önemlidir. Kaburga yaklaşım sırasında, akciğerler yeniden şişirmek için yaklaşık 2-4 saniye boyunca ventilatör duraklama.
Biz hayvanların sadece% 20 operatif mortalite vardı ve hiçbir post-operatif komplikasyonlar vardı. Burada anlatılan teknik böylece kalp hipertrofisi ve ilerleyici kalp yetmezliği kronik patolojik fizyolojik değişiklikleri incelemek için etkin ve uygun bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, bu projenin mali destek için Biyoteknoloji Bölümü, Hindistan Hükümeti kabul. Ajith Kumar GS Bilimsel ve Tıbbi Araştırma, Hindistan Hükümeti Hint Konseyi kıdemli araştırma bursu ile Endüstriyel Araştırma, Hindistan Hükümeti ve Binil Raj Konseyi kıdemli araştırma bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
