Summary
Descriviamo una procedura graduale per la creazione di sovraccarico di pressione e ipertrofia ventricolare sinistra in ratti Wistar dalla costrizione dell'aorta ascendente con una piccola clip metallica. Questo modello è ampiamente utilizzato per studiare i cambiamenti di rimodellamento durante l'ipertrofia cardiaca e per identificare e valutare le strategie per la regressione di tali cambiamenti.
Abstract
Crescente costrizione aortica è il modello chirurgica più comune e di successo per la creazione di sovraccarico di pressione indotta ipertrofia cardiaca e insufficienza cardiaca. Qui, descriviamo una procedura chirurgica dettagliata per la creazione sovraccarico di pressione e ipertrofia cardiaca in ratti mediante costrizione dell'aorta ascendente con una piccola clip metallica. Dopo l'anestesia, la trachea è intubato inserendo una cannula attraverso un'incisione a metà strada tra due anelli di cartilagine trachea. Poi una incisione cutanea viene effettuata a livello del secondo spazio intercostale sulla parete toracica sinistra e strati muscolari vengono cancellati per identificare la parte ascendente dell'aorta. L'aorta ascendente viene costretto a 50-60% del suo diametro originale mediante applicazione di una piccola clip titanio dimensioni. A seguito di costrizione aortica, la seconda e terza costola vengono approssimate con punti di sutura prolene. La cannula tracheale viene rimossa la respirazione spontanea una volta è stata ristabilita. L'animale è permesso di recuperare on per il rilievo di riscaldamento abbassando gradualmente anestesia. L'intensità del sovraccarico di pressione creata dalla costrizione dell'aorta ascendente è determinato registrando il gradiente di pressione utilizzando transtoracica bidimensionale Doppler-ecocardiografia. Nel complesso questo protocollo è utile per studiare gli eventi di rimodellamento e le proprietà contrattili del cuore durante la graduale insorgenza e la progressione da compensata ipertrofia cardiaca allo stadio di insufficienza cardiaca.
Introduction
Modelli piccoli animali sono gli strumenti più preferite per lo studio dei cambiamenti cronici nello sviluppo di ipertrofia cardiaca e la sua progressione a insufficienza cardiaca. Modelli di insufficienza cardiaca con metodi chirurgici sono stati originariamente sviluppati in ratti in quanto questi animali sono più adatti per interventi chirurgici al torace aperto, ecocardiografia e la valutazione dei parametri emodinamici. Essi forniscono inoltre adeguate campioni post mortem di tessuti, cellule e gli studi a livello molecolare 1. Costrizione dell'aorta ascendente è uno dei modelli chirurgiche più comuni e di successo per la creazione di sovraccarico di pressione insufficienza cardiaca 2, 3. Questo modello è adatto per studiare gli eventi rimodellamento cellulare cellulari e sub e le proprietà contrattili del cuore durante la transizione da ipertrofia ad infarto 4.
Un importante vantaggio di questo modello è la graduale insorgenza di sovraccarico di pressione sul cuore 5, </ Sup> 6. Questo modello è clinicamente rilevante a causa della sua lenta ma costante progressione da ipertrofia cardiaca compensata a fase scompensata e infine alla fase insufficienza cardiaca. La durata per la progressione dell'ipertrofia cardiaca per insufficienza cardiaca e cambiamenti fisiologici associati sono influenzati principalmente dal grado di stenosi prodotto 7. Ascendente costrizione aortica può essere eseguita in due modi, sia utilizzando suture o mediante l'applicazione di clips metalliche 8, 9. Il principale vantaggio di utilizzare un clip metallico per costrizione aortica è che le procedure chirurgiche sono meno complicati. In questo metodo si deve individuare la sovra valvolare dell'aorta ascendente e inserire la clip attorno l'aorta per ottenere il livello desiderato di costrizione. Un divaricatore petto non è necessario in questa procedura. Banding aortico da sutura richiede manipolazioni più chirurgici per posizionare l'ago calibro accanto alla aorta ascendente e sutura intorno aprodurre il livello desiderato di costrizione aortica. Quest'ultima tecnica è più tempo rispetto all'uso di clips metalliche per costrizione aortica. Il metodo descritto in questo video mostra la procedura chirurgica per crescente costrizione aortica in ratti che permette la creazione di pressione sovraccarico ventricolare sinistra ipertrofia modello.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti dopo aver ottenuto l'approvazione del Comitato Etico Animal Istituzionale. Ratti Wistar sono stati alloggiati in un buio 12 ore al ciclo di luce, temperatura costante (24 ± 2 ° C), con cibo e acqua ad libitum (secondo le linee guida CPCSEA).
1) Assistenza pre-operatoria e anestesia
- Tenere rat (circa 200 g di peso corporeo), sotto antibiotico ombrello 24 ore prima dell'intervento chirurgico con la somministrazione di amoxicillina per via orale (dose: 500 mg / L di acqua).
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici (come forbici, pinze, clip applicatore, aghi da sutura, e porta-aghi) in autoclave a 121 ° C per 15 min.
- Utilizzare una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea degli animali intorno ai 37 ° C per evitare una rapida diminuzione della frequenza cardiaca.
- Fare attenzione ad evitare la disidratazione dell'animale, prima e durante l'intervento chirurgico.
- Anestetizzare ratto in una camera di induzione con 3% isoflurano miscelato con0,5-1,0 L / min 100% di ossigeno; mantenere l'anestesia con il 1,5% isoflurano.
- Controllare il riflesso pedale per confermare l'anestesia successo.
2) Preparazione del sito chirurgico
- Mantenere il topo sopra un cuscinetto riscaldante temperatura controllata in posizione supina.
- Posizionare un elastico sopra denti anteriori del ratto di mantenere l'animale in posizione mantenendo anestesia con un'ogiva.
- Rimuovere la pelliccia dal collo e lasciato regione toracica del ratto (preferibilmente con un rasoio elettrico).
- Disinfettare sito chirurgico con soluzione di povidone-iodio e poi con il 70% di alcol etilico.
- Utilizzare un telino sterile per esporre solo il sito chirurgico durante la procedura operativa.
Nota: Come opzione aggiuntiva per la cura degli animali, 0,25% bupivicaine ID (2,5 mg / kg) può essere incorporato prima di incidere in ogni sito di incisione per l'anestesia locale / analgesia.
3) tracheale intubazione in Rat
- Fare una piccola incisione sulla pelle parallela alla trachea con una lama chirurgica sterile e separare accuratamente il tessuto sottostante al fine di esporre la trachea.
- Applicare una cravatta di seta 4-0 filo di sutura sotto la trachea e sollevare delicatamente la cravatta verso l'alto.
- Effettuare una incisione a metà strada tra due anelli cartilaginei e inserire la cannula tracheale nella trachea del ratto.
- Collegare la cannula tracheale di un ventilatore roditore per mantenere una frequenza respiratoria di 50 respiri / min, volume corrente di 1.70 ml di tempo e l'ispirazione di 0,60 sec (per ratto con 200 g di peso corporeo).
4) La costrizione dell'aorta ascendente
- Dopo rilevando la posizione delle nervature con le dita, fare una incisione cutanea di circa 2 cm sulla parete toracica sinistra tra il secondo e terzo costole.
- Separare lo strato muscolare intercostale dopo strato e fare un'incisione lungo circa 1,5 cm tra il secondo e terzo costole. (Si deve essere rimessan per evitare lesioni ai polmoni rendendo incisione tra le costole)
- Ritrarre le costole e individuare la porzione ascendente dell'aorta.
- Posizionare una piccola clip titanio dimensioni intorno l'aorta ascendente con l'aiuto di un applicatore quale costrizione dell'aorta al 50-60% del diametro originale.
- Seguendo la costrizione aortica, ravvicinare secondo e terzo costole con 3.0 prolene in un modello sutura interrotta. Allo stesso tempo, mettere in pausa il ventilatore per circa 2-4 secondi al fine di ri-gonfiare i polmoni.
- Appose gli strati muscolari con 3.0 punti di sutura prolene e la pelle con 4,0 punti di sutura in seta in un modello di sutura interrotta. Sintetici suture non assorbibili possono essere utilizzati al posto di seta per sutura della pelle.
- Rimuovere cannula tracheale dal ratto respirazione spontanea una volta viene ristabilita.
- Chiudere l'apertura tracheale con 3.0 punti di sutura prolene e lo strato di pelle con 4.0 punti di sutura in seta.
- Lasciare che l'animale di recuperare il tegli riscaldamento pad abbassando gradualmente la anestesia e ventilazione respirazione assistita.
- In animali di controllo sham pari età, eseguire la tracheotomia e la toracotomia senza costrizione dell'aorta ascendente.
5) assistenza post-operatoria
- Disinfettare area chirurgica con una soluzione di povidone-iodio.
- Come analgesia post-operatoria, iniettare tramadol intra-peritoneale (10 mg / kg di peso corporeo / giorno) per 1 settimana.
- Iniettare sterile normale soluzione fisiologica intra-peritoneale se i segni di disidratazione appaiono dopo l'intervento chirurgico (circa 1 ml).
- Somministrare amoxicillina per via orale, miscelato con acqua potabile, per sette giorni (dose: 500 mg / L di acqua).
- Rimuovere eventuali punti di sutura in seta rimanenti dalla pelle dopo 10 giorni di intervento chirurgico sotto anestesia per inalazione.
6) Conferma della costrizione di successo di aorta ascendente
- Eseguire un trans-toracica bidimensionale Doppler-ecocardiografia per determinare l'intensitàtà del sovraccarico di pressione prodotta dalla costrizione dell'aorta ascendente.
- Anestetizzare i ratti uno settimane post-chirurgia come descritto in precedenza (passo 1.5)
- Posizionare il trasduttore di ultrasuoni nella posizione sternale supra registrare il gradiente di pressione attraverso la porzione ristretta dell'aorta ascendente.
Nota: Ratti con un gradiente di pressione di circa 60 mm di Hg sul sito costrizione aortica si svilupperà una grave ipertrofia cardiaca di circa 8-10 settimane dopo l'intervento chirurgico.
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Representative Results
Nei nostri esperimenti siamo in grado di raggiungere oltre il 80% i tassi di sopravvivenza. L'efficacia di costrizione aortica è stata confermata eseguendo ecocardiografia Doppler. Ratti (n = 6) con un gradiente di pressione di circa 60 mm di Hg nel sito ristretta aortica sono stati osservati per 8 settimane e sacrificato per analizzare lo sviluppo di ipertrofia cardiaca (Figura 1). Dopo 8 settimane di valutazione ecocardiografica post-chirurgia ha rivelato un significativo aumento dei parametri ventricolare sinistra, come tra lo spessore del setto interventricolare, ventricolo sinistro spessore della parete posteriore e diminuzione fianco diametro interno ventricolare diastolica stato, in animali sottoposti a costrizione aortica, rispetto a sham operati controlli (Tabella 1, Figura 2). Un aumento significativo del cuore peso / body rapporti di peso e ventricolari rapporti di peso peso / corpo di sinistra sono stati osservati nei ratti con costrizione aortica (Tabella 2, Figura 3). Questi datisuggeriscono che i ratti 8 settimane dopo chirurgia con costrizione aortica sviluppano un livello significativo di ipertrofia cardiaca, rispetto ai controlli sham operati.
Figura 1. Ecocardiogramma nei ratti rappresentano il gradiente di pressione attraverso l'aorta ascendente. Aa) L'ecocardiogramma rappresentante di un ratto con la costrizione dell'aorta e con un gradiente di pressione di 63,0 millimetri di Hg e Ab rappresenta eco color Doppler del sito attraverso l'aorta dove gradiente di pressione è stata misurata. Ba) L'ecocardiogramma rappresentante di una farsa operato di controllo ratto avente un gradiente di pressione di 2,86 millimetri di Hg e Bb rappresenta color doppler eco del sito attraverso l'aorta in cui il gradiente di pressione era misura d. Questo aumento di gradiente di pressione indica successo banding dell'aorta nei ratti che hanno subito parziale ascendente aortica costrizione.
. Figura 2 M-mode ecocardiogramma del ventricolo sinistro nei ratti con costrizione aortica (A) e ratti (B) raffiguranti le dimensioni del ventricolo sinistro, al momento del sacrificio 8 settimane dopo l'intervento chirurgico IVST = tra spessore del setto ventricolare controllo.; LVPWT = ventricolo sinistro spessore della parete posteriore; LVID = diametro interno del ventricolo sinistro in diastole. In ratti con costrizione aortica un aumento significativo tra lo spessore del setto ventricolare, si possono osservare ventricolare sinistra spessore della parete posteriore e diminuzione del diametro interno del ventricolo sinistro allo stato diastolica.
Figura 3. Immagini dei cuori interi di un topo che sottoposti a costrizione aortica (A) e una farsa operavano ratto di controllo (B) 8 settimane post-operatorie. Il ratto con la costrizione aortica ha una significativa ipertrofia cardiaca rispetto a sham operato il controllo.
Tabella 1 M-mode parametri ecocardiografici di cardiaca del ventricolo sinistro, al momento del sacrificio, 8 settimane dopo l'intervento chirurgico IVST = tra lo spessore del setto ventricolare..; LVPWT = ventricolo sinistro spessore della parete posteriore; LVID = diametro interno del ventricolo sinistro allo stato diastolica; AAC = crescente costrizione aortica.
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Discussion
Ci sono diversi modelli chirurgici per l'induzione di sovraccarico di pressione e ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco. In piccoli animali, Lorell e colleghi hanno sviluppato il modello che abbiamo descritto qui ed hanno segnalato la comparsa di ipertrofia cardiaca compensata 8 settimane dopo banding aortico 5. Alterazioni cardiache gradualmente progredire a uno stato scompensata e poi portare a insufficienza cardiaca. Il vantaggio principale di questo modello è la graduale insorgenza di aumento della pressione ventricolare sinistra e pertanto simile a situazioni cliniche di ipertensione cronica. E 'anche un modello animale adatto per studiare insufficienza cardiaca sinistra associata ipertensione polmonare 10.
Altri modelli animali di insufficienza cardiaca sovraccarico di pressione, come i ratti sensibili Dahl, ratti spontaneamente ipertesi e ratti con la costrizione dell'aorta addominale, sviluppano anche sovraccarico di pressione cronico. Essi, tuttavia, prendere periodi di tempo prolungati per la progressione from ipertrofia cardiaca per insufficienza cardiaca. Il costo di ratti sperimentali manutenzione è quindi anche superiore 1. deAlmeida e colleghi impiegati trasversale costrizione aortica per indurre l'ipertrofia ventricolare sinistra nei topi 11. La tecnica prevede una sternotomia mediana e la scomparsa della sterno e quindi è più difficile.
Garantire un rapido cambiamento di anestesia dal cono naso tracheale prima toracotomia e da intubazione tracheale al cono di naso dopo le procedure operative. Un metodo alternativo per l'intubazione tracheale nei ratti è quello di utilizzare tubo in polietilene per l'intubazione endotracheale invece di tracheotomia. Tuttavia, questa tecnica richiede una sufficiente capacità. Si deve prestare attenzione per evitare lesioni ai polmoni rendendo incisione tra le costole. L'applicazione di clips di titanio sufficienti per produrre costrizione aortica critica per lo stress ventricolare sinistra, ma non abbastanza grave da produrre acuta insufficienza ventricolare sinistra e pedema ulmonary. L'uso di suture prolene per il ravvicinamento delle nervature è un fattore critico per il successo il recupero dell'animale. Durante il ravvicinamento delle costole, mettere in pausa il ventilatore per circa 2-4 secondi al fine di ri-gonfiare i polmoni.
Abbiamo avuto solo il 20% la mortalità operatoria negli animali e non c'erano complicazioni post-operatorie. La tecnica che abbiamo descritto qui è quindi uno strumento efficace e adatto per studiare alterazioni fisiopatologiche croniche in ipertrofia cardiaca e insufficienza cardiaca progressiva.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono Dipartimento di Biotecnologie, Governo dell'India per il sostegno finanziario di questo progetto. Ajith Kumar GS è stato sostenuto con borsa di ricerca senior Consiglio di ricerca scientifica e industriale, Governo dell'India e Binil Raj con assegno di ricerca senior Consiglio indiano di ricerca medica, Governo dell'India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
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