Summary
Vi beskriver ett stegvis förfarande för att skapa övertryck och vänsterkammarhypertrofi i Wistar råttor genom förträngning av aorta ascendens med hjälp av en liten metallklämma. Denna modell används flitigt för att studera remodeling förändringar under hjärthypertrofi och för att identifiera och utvärdera strategier för regression av sådana förändringar.
Abstract
Stigande aorta sammandragning är den vanligaste och mest framgångsrika kirurgiska modell för att skapa övertryck inducerade hjärthypertrofi och hjärtsvikt. Här beskriver vi en detaljerad kirurgisk procedur för att skapa trycköverbelastning och hjärthypertrofi hos råttor genom sammandragning av aorta ascendens med användning av en liten metallklämma. Efter anestesi, är luftstrupen intuberades genom att sätta in en kanyl genom en halvvägs snitt mellan två broskringar av luftstrupen. Då en hud snitt görs i nivå med det andra revbensmellanrummet på vänstra bröstkorgen och muskelskikt rensas för att lokalisera den stigande delen av aorta. Den stigande aorta är förträngd till 50-60% av sin ursprungliga diameter genom tillämpning av en liten storlek titan klipp. Efter aorta sammandragning, är den andra och tredje revben approximeras med Prolene suturer. Trakealkanylen tas bort en gång spontanandning återupprättades. Djuret fick återhämta sig on värmedynan genom att gradvis sänka anestesi. Intensiteten av trycköverbelastning skapad av sammandragning av aorta ascendens bestämmes genom registrering av tryck-gradient med användning av trans-thoracic tvådimensionell Doppler-ekokardiografi. Sammantaget är detta protokoll är användbart för att studera remodeling händelser och sammandragande egenskaper för hjärtat under den gradvisa uppkomsten och utvecklingen från kompenserad hjärthypertrofi till hjärtsvikt skede.
Introduction
Små djurmodeller är de mest önskade verktygen för studier av kroniska förändringar i utvecklingen av hjärthypertrofi och dess progression till hjärtsvikt. Hjärtsvikt modeller av kirurgiska metoder utvecklades ursprungligen i råttor eftersom dessa djur är mest lämpade för öppna bröst kirurgiska ingrepp, ekokardiografi och utvärdering av hemodynamiska parametrar. De ger också adekvata efter slakt prover för vävnad, cellulär och molekylär nivå studier 1. Förträngning av aorta ascendens är en av de vanligaste och mest framgångsrika kirurgiska modeller för att skapa övertryck hjärtsvikt 2, 3. Denna modell är väl lämpad för att studera de cellulära och sub cellulära remodeling händelser och sammandragande egenskaper för hjärtat under övergången från hypertrofi till hjärtsvikt 4.
En stor fördel med denna modell är den gradvisa uppkomsten av övertryck på hjärtat 5, </ Sup> 6. Denna modell är kliniskt relevant på grund av sin långsamma men stadiga framsteg från kompenserade hjärthypertrofi till dekompenserad fas och slutligen till hjärtsvikt stadiet. Varaktigheten för progression av hjärthypertrofi till hjärtsvikt och de associerade fysiologiska förändringar i huvudsak påverkas av graden av stenos producerade 7. Stigande aorta sammandragning kan utföras på två sätt, antingen genom att använda suturer eller genom tillämpning av metallklämmor 8, 9. Den främsta fördelen med att använda ett metalliskt klämma för aorta sammandragning är att kirurgiska ingrepp är mindre komplicerat. I denna metod måste man lokalisera supra klaff stigande aorta och sätt klämman runt aorta för att få önskad nivå av sammandragning. En kista upprullningsdon är inte nödvändigt i detta förfarande. Aorta banding av suturering kräver mer kirurgiska manipulationer för nål placeras bredvid aorta ascendens och suturering runt den för attframställning av den önskade nivån av aorta sammandragning. Den senare tekniken är mer tidskrävande jämfört med användningen av metallklämmor för aorta sammandragning. Den metod som beskrivs i denna video visar det kirurgiska ingreppet för stigande aorta sammandragning hos råttor som möjliggör skapandet av tryckbelastad vänsterkammarhypertrofi modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurexperiment utfördes efter att ha inhämtat godkännande från Institutional Animal etikkommitté. Wistar-råttor inhystes under ett 12 h mörker till ljus cykel, konstant rumstemperatur (24 ± 2 ° C) med föda och vatten ad libitum (enligt riktlinjerna CPCSEA).
1) Pre-operativ och anestesi
- Håll råtta (ca 200 g kroppsvikt) under antibiotika paraply 24 timmar innan operation genom att administrera amoxicillin peroralt (dos: 500 mg / l vatten).
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg (t.ex. sax, pincett, klipp applikator, suturnålar och nål) genom autoklavering vid 121 ° C i 15 min.
- Använd en värmedyna för att hålla djurkroppen temperaturen runt 37 ° C för att undvika en snabb sänkning av hjärtfrekvensen.
- Var försiktig för att undvika uttorkning av djuret före och under operationen.
- Söva råttan i en induktionskammare med 3% isofluran blandas med0,5-1,0 l / min 100% syre; upprätthålla anestesi med 1,5% isofluran.
- Kontrollera pedal reflexen att bekräfta framgångsrik anestesi.
2) Framställning av den kirurgiska platsen
- Håll råttan på toppen av en temperaturstyrd värmedyna i ryggläge.
- Placera ett gummiband över råttans framtänder för att hålla djuret på plats samtidigt som anestesi med en noskon.
- Ta päls från halsen och vänster bröst region i råtta (helst med en elektrisk rakapparat).
- Desinficera kirurgiska platsen med povidon-jod-lösning och sedan med 70% etylalkohol.
- Använd en steril duk för att exponera endast det kirurgiska stället under det operativa förfarandet.
Obs: Som ytterligare ett alternativ för djurvård, kan 0,25% Bupivicaine ID (2,5 mg / kg) införlivas före öppning av varje snitt plats för lokalanestesi / analgesi.
3) trakealintubation i råtta
- Gör ett litet snitt på huden parallellt med luftstrupen med användning av ett sterilt kirurgiskt blad och försiktigt separera den underliggande vävnaden för att exponera luftstrupen.
- Applicera en slips med 4-0 silke sutur tråden under luftstrupen och försiktigt höja slips uppåt.
- Gör en halvvägs snitt mellan två broskringar och sätt trakealkanylen i luftstrupen på råtta.
- Anslut trakeal kanyl till en gnagare ventilator för upprätthållande av en andningshastighet av 50 andetag / min, respirationsvolym på 1,70 ml och inandningstid av 0,60 sek (för råtta med 200 g kroppsvikt).
4) Förträngning av Stigande Aorta
- Efter avkänning av läget av ribborna med fingrar, gör ett snitt i huden på ca 2 cm på den vänstra bröstväggen mellan det andra och tredje revben.
- Separera interkostal muskler lager för lager och göra ett snitt ca 1,5 cm långt mellan det andra och tredje revbenen. (Försiktighet bör tan för att undvika skador på lungorna samtidigt som snitt mellan revbenen)
- Fäll revbenen och lokalisera den stigande delen av aorta.
- Placera en liten storlek titanklämma runt aorta ascendens med hjälp av en applikator, varvid bromsande aorta till 50-60% av den ursprungliga diametern.
- Efter aorta sammandragning, approximera den andra och tredje revben med 3,0 prolene i en avbruten sutur mönster. Samtidigt pausa ventilatorn under ca 2-4 sek för att åter blåsa upp lungorna.
- Appose muskellagren med 3,0 Prolene suturer och huden med 4,0 silke suturer i en avbruten sutur mönster. Syntetiska icke absorberbara suturer kan användas i stället för silke för suturering av huden.
- Ta trakealkanylen från råttan en gång spontan andning har återupprättats.
- Stäng luftrör öppning med 3,0 Prolene suturer och huden lagret med 4,0 silke suturer.
- Låt djuret att återhämta sig på tHan uppvärmning pad genom att gradvis sänka anestesi-och ventilations assisterad andning.
- I åldersmatchade sham kontrolldjur, utföra trakeotomi och torakotomi utan förträngning av aorta ascendens.
5) postoperativ vård
- Desinficera kirurgiska området med povidon-jodlösning.
- Som postoperativ smärtlindring, injicera tramadol intraperitonealt (10 mg / kg kroppsvikt / dag) i 1 vecka.
- Injicera steril normal saltlösning intraperitonealt om tecken på uttorkning visas efter operationen (ca 1 ml).
- Administrera amoxycillin oralt, blandat med dricksvatten, i sju dagar (dos: 500 mg / L vatten).
- Ta bort eventuella återstående silkessuturer från huden inlägget 10 dagar av kirurgi under inhalationsanestesi.
6) Bekräftelse av framgångsrik Förträngning av Stigande Aorta
- Utför en trans bröstkorg tvådimensionell Doppler-ekokardiografi för att bestämma avsiktensitet av trycköverbelastning produceras genom sammandragning av aorta ascendens.
- Bedöva råttorna en vecka efter operationen, såsom beskrivits tidigare (steg 1,5)
- Placera ultraljudsomvandlare vid supra sternala position för att registrera tryckgradient över den förträngda delen av aorta ascendens.
OBS: Råttor med en tryckgradient på ca 60 mm Hg vid aorta förträngda platsen kommer att utveckla svår hjärthypertrofi efter ca 8-10 veckor efter operation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I våra experiment har vi möjlighet att uppnå mer än 80% överlevnad. Effektiviteten av aorta sammandragning bekräftades genom att utföra Doppler ekokardiografi. Råttor (n = 6) med en tryckgradient av ca 60 mm Hg vid aorta förträngda platsen observerades under åtta veckor och avlivades för att analysera för utvecklingen av hjärthypertrofi (Figur 1). Efter 8 veckor efter operation ekokardiografisk utvärdering visade en signifikant ökning av vänster kammares parametrar som bland ventricular septal tjocklek, vänster kammares bakre väggtjocklek och minskning av vänsterkammarens inre diameter på diastolisk tillstånd, i djur som genomgick aorta sammandragning, jämfört med skenopererade kontroller (tabell 1, figur 2). En signifikant ökning av hjärtvikt / kroppsvikt nyckeltal och vänster kammare vikt / kropp viktförhållanden observerades hos råttor med aorta sammandragning (Tabell 2, Figur 3). Dessa datatyder på att 8 veckor efter operation råttor med aorta sammandragning utveckla en betydande grad av hjärthypertrofi, jämfört med skenopererade kontroller.
Figur 1. Ekokardiogram hos råtta representerar tryckgradient över aorta ascendens. Aa) Den representativa ekokardiogram från en råtta med förträngning av kroppspulsådern och som har en tryckgradient av 63.0 mm Hg och Ab representerar färgdoppler eko av platsen över aorta där tryckgradienten mättes. Ba) Representations ekokardiogram från en bluff som drivs kontroll råtta som har en tryckgradient av 2.86 mm Hg och Bb representerar färgdoppler eko av platsen över aorta där tryckgradienten var mått d. Denna ökning i tryckgradient indikerar framgångsrik bandning av aorta hos råttor som genomgick partiell uppstigande aorta sammandragning.
. Figur 2 M-mode ekokardiografi av den vänstra ventrikeln hos råttor med aorta sammandragning (A) och kontrollråttor (B) skildrar vänstra ventrikulära dimensioner vid tidpunkten för avlivandet åtta veckor efter operation IVST = inter ventrikulär septal tjocklek. LVPWT = vänster kammares posteriora väggtjocklek; LVID = vänster kammares inre diameter i diastole. I råttor med aorta sammandragning en betydande ökning bland ventricular septal tjocklek, kan observeras vänsterkammar bakre väggtjocklek och minskning av vänsterkammarens inre diameter på diastoliska tillstånd.
Figur 3. Bilder av hela hjärtat hos en råtta som genomled aorta sammandragning (A) och en skenopererade kontrollråtta (B) 8 veckor efter operation. Råttan med aorta sammandragning har signifikant hjärthypertrofi jämfört med skenopererade kontroll.
Tabell 1 M-mode ekokardiografiska parametrar för hjärt vänster kammare vid tidpunkten för offret, 8 veckor efter operation IVST = inter ventricular septal tjocklek..; LVPWT = vänster kammares posteriora väggtjocklek; LVID = vänster kammares inre diameter på diastoliska tillstånd; AAC = stigande aorta sammandragning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns ett flertal operationsmodeller för induktion av trycköverbelastning liksom hjärthypertrofi och hjärtsvikt. I små djur, Lorell och kollegor utvecklat den modell som vi har beskrivit här och de rapporterade förekomsten av kompenserad hjärthypertrofi 8 veckor efter aorta banding 5. Hjärt förändringar gradvis utvecklas till en dekompenserad tillstånd och sedan leda till hjärtsvikt. Den främsta fördelen med denna modell är den gradvisa uppkomsten av ökning av vänster ventrikulära trycket och således liknar kliniska situationer i kronisk hypertoni. Det är också en lämplig djurmodell för att studera vänster hjärtsvikt associerad pulmonell hypertension 10.
Andra djurmodeller för övertryck hjärtsvikt, såsom Dahl känsliga råttor, spontant hypertensiva råttor och råttor med förträngningar i bukaorta, också utveckla kronisk övertryck. De dock ta längre tidsperioder för progression from hjärthypertrofi till hjärtsvikt. Underhållet Kostnaden för försöksråttor är därför också högre 1. deAlmeida och kollegor anställd tvärgående aorta sammandragning för framkallande av vänsterkammarhypertrofi hos möss 11. Tekniken innebär median sternotomi och indragning av bröstbenet och därmed är mer utmanande.
Säkerställa en snabb förändring av anestesi från noskon att trakealintubation före torakotomi och från trakealintubation till noskon efter de operativa rutiner. En alternativ metod för trakealintubation hos råttor är att använda polyetenrör för endotrakeal intubering istället för trakeotomi. Detta kräver dock att tekniken tillräcklig färdighet. Försiktighet bör vidtas för att undvika varje skada till lungorna samtidigt som snittet mellan ribborna. Tillämpning av titan klipp tillräckliga för att ge kritisk aorta sammandragning för vänsterkammar stress, men inte tillräckligt allvarlig för att producera akut vänsterkammarsvikt och pulmonary ödem. Användning av Prolene suturer om tillnärmning av revbenen är avgörande för en lyckad återhämtning av djuret. Under tillnärmning av revben, pausa fläkten i ca 2-4 sekunder för att åter blåsa lungorna.
Vi hade bara 20% operativ mortalitet hos djuren och det fanns inga postoperativa komplikationer. Tekniken vi beskrivit här är alltså ett effektivt och lämpligt verktyg för att studera kroniska patofysiologiska förändringar av hjärthypertrofi och progressiv hjärtsvikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna erkänner Institutionen för bioteknik, Indiens regering om ekonomiskt stöd för projektet. Ajith Kumar GS stöddes med senior forskartjänst från rådet för vetenskaplig och industriell forskning, Indiens regering och Binil Raj med högre forskartjänst från indiska rådet för medicinsk forskning, Indiens regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Maintained at ARF, RGCB | ||
| Inhalation anaesthesia systems | VetEquip | AB19276 | |
| Rodent ventilator | CWE Inc | SAR- 830/AP | |
| Rat tracheal cannula | CWE Inc | 13-21032 | |
| Ultrasound system | Philips | HD7 | |
| Ultrasound transducer | Philips | S 12 | |
| Titanium clip (small) | Horizon | 1204 | |
| Clip applicator | Weck | 137081 | |
| Electric shaver | Vinverth | VBT0817 | |
| BP blade (size:11) | Surgeon | REF10111 | Preparation of surgical site |
| Tramadol | Orchid health care | OCH043 | |
| Amoxycillin Hydrochloride | Ranbaxy | ||
| Isoflurane | Piramal health care | A23M10A | |
| Syringes | BD | 2015-09 | |
| 4-0 braided silk | Diamond | ||
| 3-0 prolene | Johnson&Johnson | NW018 | |
| Surgical tape | Romsons | SH 6301 | |
| Povidone iodine | Win Medicare | ||
| Temp. controlled heating pad | Flamingo | HC1003 |
References
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
- Weinberg, E. O., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition prolongs survival and modifies the transition to heart failure in rats with pressure overload hypertrophy due to ascending aortic stenosis. Circulation. 90, 1410-1422 (1994).
- Schunkert, H., et al. Increased rat cardiac angiotensin converting enzyme activity and mRNA expression in pressure overload left ventricular hypertrophy. Effects on coronary resistance, contractility, and relaxation. J Clin Invest. 86, 1913-1920 (1990).
- Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
- Litwin, S. E., et al. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation. 91, 2642-2654 (1995).
- Miyamoto, M. I., et al. Adenoviral gene transfer of SERCA2a improves left-ventricular function in aortic-banded rats in transition to heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 793-798 (2000).
- Kagaya, Y., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K., Barry, W. H., Lorell, B. H. Long-term angiotensin-converting enzyme inhibition with fosinopril improves depressed responsiveness to Ca2+ in myocytes from aortic-banded rats. Circulation. 94, 2915-2922 (1996).
- Del Monte, F., Butler, K., Boecker, W., Gwathmey, J. K., Hajjar, R. J. Novel technique of aortic banding followed by gene transfer during hypertrophy and heart failure. Physiol Genomics. 9, 49-56 (2002).
- Turcani, M., Rupp, H. Heart failure development in rats with ascending aortic constriction and angiotensin-converting enzyme inhibition. Br J Pharmacol. 130, 1671-1677 (2000).
- Kerem, A., et al. Lung endothelial dysfunction in congestive heart failure: role of impaired Ca2+ signaling and cytoskeletal reorganization. Circ Res. 106, 1103-1116 (2010).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), (2010).
