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Summary
리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.
Abstract
세균의 세포 내 병원균 절묘하게 조작 및 호스트 대상 조직의 감염에 필요한 세포의 기능을 파괴하는 그들의 능력에 의한 세포 신호 폭포를 해부하는 분자 도구로 생각 될 수있다. 이러한 세균성 병원균 가운데, 리스테리아 균은 세포 면역 반응의 특성에 세포 내 기생에 대한 패러다임으로 사용 된 그람 양성 미생물이며, 세포 골격과 막 인신 매매의 역 동성을 제어하는 분자 경로의 발견에서 쓸모있는 역할을했다한다. 이 문서에서는, 우리는 L. 늦은 세포 감염 단계의 검출을위한 강력한 현미경 분석을 설명 모노 사이토는 InlC, 감염된 세포의 세포질에 축적 박테리아 분비 단백질의 형광 표지에 근거,이 분석은 숯불하기 위해 자동화 고 처리량 소 간섭 RNA 스크린에 연결될 수있다감염의 상향 또는 하향 조절에 관여 세포 신호 전달 경로를 acterize.
Introduction
그람 양성 세균 리스테리아 균은 숙주 세포에 침입의 국제화 공포를 방해하고 숙주 세포 1의 세포질에서 복제 식품 매개 병원체이다. L. 세포 및 동물 모델에서 관찰 된 세균의 독성 특성의 지속성과 관련된 실험실 컨텍스트 (급속한 성장, 건강한 개인에 대한 낮은 독성)의 조작의 용이성 모노 사이토 겐 (용혈성 활동, 백혈구가)의 주요 모델로 1960 년에 처음 사용 허용 세포 내 기생의 감염 2에 대한 세포 성 면역의 이론적 기초의 설립을위한 연구. 1980 년대 후반과 1990 년대 초반, 세균의 세포주기 3뿐만 아니라 가장 중요한 세균의 독성의 분자 특성의 해부는 4-7 L.의 사용을 선호하는 요인 조작 및 스터드의 핵심 분자 도구로 모노 사이토 제네스숙주 세포 기능의 Y. 리스테리아 속에서 무독성의 존재 (L.의 innocua)과 악성 (L. monocytogenes에) 종 비교 게놈 연구 8 도로를 포장하는, 함께 완전한 L.의 최근 설립과 함께 모노 사이토는 L.의 진화에 대한 우리의 이해를 증가, 9 사체 인간 병원체 등의 감염을위한 모델 시스템으로 모노 사이토는 10 연구.
L. monocytogenes에 자신의 숙주 세포 수용체 각각 E-cadherin의와 메트로, 11 ~ 12과 박테리아 표면 단백질 InlA 및 InlB의 상호 작용에 따라 숙주 세포로의 내면화를 유도한다. 초기 후보 기반 연구의 InlB - 중요한 음향과 InlA 침략의 통로 (13)와 phosphoinositide 3 - 키나제 (PI 3-K)의 중요한 구성 요소로서 α / β의 catenins - 굴지 링크의 식별에지도 의존 침공 casca데 14 ~ 15. 프로테오믹스 및 기능 기반의 분석 이후에 허용 된 새로운 골격 요소 (16)와 숙주 세포의 침공에 필요한 지질 두 번째 메신저 (17)의 식별. 전사 연구 (18)와 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스 (19)는 최근 호스트 신호 폭포의 활성화와 L. 동안 면역 반응의 억제에 관한 새로운 빛을 발산했다 감염 모노 사이토 겐. 시스템 생물학은 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 (kinomes, 전체 게놈)의 큰 세트의 불 활성화에 기반 접근 (siRNA의) 침묵은 최근 식균 작용을 포함한 특정 세포 기능의 컨텍스트에서 폭포 신호 글로벌 호스트의 분석을위한 새로운 길을 열고있다 병원체 내면화 20. 게놈 전체의 siRNA 화면은 이전에 L.의 감염에 필요한 세포의 계곡을 조사하기 위해 수행 된 식세포 초파리 모노 사이토 제네스 21 ~ 22 만, 이러한 유형의 분석은 비 식세포로 수행되지 않은, 생체 내에서 감염을위한 중요한 표적을 나타낸다.
우리는 L.에 의해 감염의 후반 단계의 현미경 검출을위한 프로토콜을 최적화 한 상피 세포 내 세균 항목의 높은 처리량의 siRNA 연구에 적합 모노 사이토 제네스. 우리의 분석은 매우 침습적 L. 활용 PRFA, L.의 주요 전사 조절에 점 돌연변이를 제시 변형 모노 사이토 겐 독성이 6 요인 리스테리아 모노 사이토 겐 (PRFA * 이름)이 돌연변이는 23 PRFA는 구조적으로 활성 렌더링 때문에, 그렇지 않으면 제대로 감염된 비 식세포의 세균 항목을 호의를 침공 단백질 InlA 및 InlB의 발현 증가로 연결됩니다. 감염에 대한 우리의 판독은 분비 된 세균의 단백질 InlC의 세포질 축적의 검출을 기반으로이 분자는내 세포질 L.에 의해 우선적으로 발현되는 형질 발현 이펙터 모노 사이토 9 참여는 박테리아 세포에 세포 24를 전파뿐만 아니라, 호스트 면역 반응 25을 변조하는뿐만 아니라. 세포 내 세균에 의해 InlC 분비의 형광 표시가 명확하게 감염되지 않은 세포에서 감염과 구별 할 수 있지만, 또한 엔드 포인트 이후의 여러 단계에서 감염을 해부하는 데 사용할 수있는 판독 나타냅니다뿐만 아니라 : 항목, 액포 탈출, 세포 내 세균을 증식과 세포 간 확산. 이 현미경 기반 프로토콜 따라서 L. 의한 숙주 세포의 감염에 관련된 세포 경로를 연구하는 siRNA를 스크린에 연결될 수있다 모노 사이토 제네스.
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Protocol
1. 세포의 준비 및 세균 배양, 형질 도구 및 차 항체
- 개인 L.를 분리 신선한 한천 플레이트를 준비 C. -80 °로 유지 세균 글리세롤 (세균의 액체 배양 물을 포화 glycerol/50 % 50 %)에서 식민지 모노 사이토 겐
- 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트에 고정 된 세균 글리세롤, 줄무늬 박테리아를 전송 (-80 ° C 유지) 알루미늄 랙을 사용.
- 48 시간 (또는 개별 박테리아의 식민지가 고립 될 수있을 때까지) 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- (액체의 문화를 시드하는 데 사용됩니다) 1 개월 최대 시간 동안 4 ° C에서, 그 후이 작업 판을 보관하십시오.
- 우리의 프로토콜에서는, 우리는 L.를 사용 혈청보기 1/2A EGDe.PrfA * 균주 모노 사이토 겐 만도 1에 예시 된 바와 같이 L. P14.PrfA 4B monocytogenes의 혈청 형은 * 변형은 유사한 결과를 제공합니다.
- 그라 ATCC CCL2의 셀은 항생제의 부재 하에서 10 %의 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 성장된다.
- 스크램블 (제어) 및 안티 메트로 된 siRNA는 블랙 384도 현미경 세포 배양 접시에로드 된 독립 풀.
- RNase가없는 물 500 μL에 siRNA를 160 pmol의 희석 잘 당이 솔루션의 5 μL (최종 농도 1.6 pmol의)를 추가합니다.
- 1 년을 최대 -20 ° C에서이 판을 보관하십시오.
- 이전 25 설명한대로 InlC-GST 재조합 단백질을 사용하여 예방 접종에 의해 얻어졌다 InlC 세균의 단백질에 대한 다 클론 토끼 항체.
2. siRNA를 세포 형질 반전
- 감염 전에 72 시간 실온 아니라 각각의 RNase없는 물 5 μL에서 1.6 pmol의 siRNA에 포함 된 블랙 384도 현미경 세포 배양 접시에 가져다.
- 300에서 3 분 동안 접시를 원심 분리기우물의 벽에 입금 된 수의 siRNA를 가지고 실온에서 RCF.
- 0.4 % 리포 펙 타민 RNAiMAX 보충 실내 온도 DMEM을 준비합니다.
- (siRNA를 추가하기 전에 더 이상 20 분 이상 형질 매체를 배양하지 않는다) 각 웰에 DMEM / RNAiMAX 형질 매체의 25 μl를 추가합니다.
- 형질 감염 용액으로 siRNA를 혼합 앞뒤로 플레이트를 놓은 후 siRNA를 리포 펙 타민 - 복합체 형성하도록 실온에서 1 시간 동안 플레이트를 유지한다.
- 한 10 ㎖ 37 ° C 미리 예열 PBS와 합류 또는 하위 합류 세포 배양 플라스크에서 세척 HeLa 세포.
- 1 ㎖ 37 °를 추가하여 HeLa 세포를 분리 C는 세포 배양 플라스크에 트립신을 데워진 37 ℃에서 3 ~ 5 분 동안 품어
- 10 ㎖ 37 ° C에서 다시 정지 세포는 16 % FBS와 보충 DMEM을 데워진.
- 세포를 계산하고 준비 DMEM의 ML 당 12,000 세포의 세포 현탁액은 보충16 % FBS.
- 384 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다.
- 세포를 배포하고 세포는 실온에서 10 분 동안 정착하게 앞뒤로 빠르게 판을 이동합니다.
- 파라 필름과 플레이트를 밀봉하고 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 함유 분위기에서 72 시간 동안 보관
3. 세포 감염 및 염색
- 감염 전날, L.의 단일 식민지을 BHI 한천 플레이트에서의 monocytogenes 및 15 ml의 폴리스티렌 튜브에서 액체 BHI 배지 5 ㎖에 재현 탁.
- 박테리아의 성장을 허용 동거 장치에서 37 ° C에서 밤새 품어.
- 감염의 날, 하룻밤 L. 1 ㎖를 씻어 테이블 탑 원심 분리기에서 10,600 RCF에서 2 분 원심 분리하여 문화 모노 사이토 겐.
- (분비 세포 독소의리스 테리 O를 포함) 상층 액을 버리고 PBS 1 ㎖ (반복 하오의 펠렛을 다시 일시 중지) 세척 단계 3 더 많은 시간을 t.
- 600 nm에서 세균의 광학 밀도를 읽고 박테리아의 수를 (OD = 1 1E9 박테리아 / ㎖에 해당)으로 추정된다.
- 적절한 L.에게 준비 1 % FBS와 보충 DMEM에 희석 모노 사이토 겐 : EGDe.PrfA *와 같은 고도의 침략 균주를 사용하여, 우리는 잘 당 매체의 30 μL에 5E4 박테리아의 사용을 (감염의 다중성이 2,000 셀 (25)로 추정된다)하는 것이 좋습니다.
- 각 웰의 세포 배양 배지 (80 μL)를 제거하고 L.의 30 μl를 추가하여 교체 매체 모노 사이토 함유.
- 감염 프로세스를 동기화하기 위해, 실온에서 5 분 동안 200 RCF로 플레이트를 원심 분리기.
- 데워진 알루미늄 블록에 37 ° C에서 가습 5 % CO 2 함유 분위기에서 1 시간 동안 접시를 품어.
- L.에게 제거 각 웰로부터 배지를 모노 사이토 겐을 함유하고 10 % FBS 보충 된 DMEM 데워진의 30 μL를 추가40 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신 세포 L.를 죽일 모노 사이토 제네스.
- 데워진 금속 블록에 37 ° C에서 5 % CO 2 함유 분위기에서 4 시간 동안 배양한다.
- 8 %의 포름 알데히드 (오히려 파라 포름 알데히드 폴리머보다 포름 알데히드 단량체가 사용되도록이 솔루션은 신선한 준비를해야합니다)와 보충 PBS의 솔루션을 준비합니다.
- 세포 배양 배지를 폐기하지 않고, 8 % 포름 알데히드 (최종 농도 4 %)으로 보충 된 PBS 30 μL를 추가하고 실온에서 15 분 동안 배양한다.
- 정착액을 제거하고 (물론 당 PBS 80 μL의 최종 볼륨에있는 세포를 유지) 잘 당 PBS 80 μL와 세포를 세 번 씻는다.
- 준비 1:250는 PBS의 토끼 안티 InlC 혈청의 희석은 0.2 % 사포닌.
- 잘 PBS를 제거한 후 각각 차 항체 용액 10 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 차를 폐기항체 용액과 잘 당 PBS 40 μL로 4 회 세척한다.
- PBS에서 보조 알렉사 형석 546 커플 안티 - 토끼 항체 (1:250), DAPI 용액 (1:1,500) 및 phalloidin도 - Dy647 (1:150)을 희석하여 0.2 %의 사포닌.
- 각 웰에이 보조 염색 용액 10 μL를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 차 얼룩 솔루션을 취소하고 (물론 각 40 μL의 최종 볼륨을두고 판을 밀봉) 잘 당 PBS 40 μL로 4 회 세척한다.
- 플레이트는 바로 몇 군데 있습니다 또는 후속 분석을 위해 빛으로부터 보호 4 ° C (알루미늄 호일로 커버)에 저장할 수 있습니다.
4. 이미지 수집 및 분석
- 자동화 된 현미경에 장착 된 10 배 목표를 (물론 당 우선적으로 9 이미지를 얻기)를 사용하여 세 개의 서로 다른 채널 (350 nm의, 546 ㎚, 647 nm의) 이미지를 획득.
- InlC 신호는 화상을 이용하여 측정 할 수있다각각 DAPI와 phalloidin도 염색을 이용하여 핵 및 세포 기관의 자동 분할 할 수 CellProfiler 같은 분석 소프트웨어.
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Representative Results
세포질 InlC의 형광 표지는 L.에 의해 세포 감염에 대한 강력한 판독을 제공합니다 모노 사이토는,도 1에 도시 된 바와 같이 : 현미경의 중앙 셀은 높게 P14.PrfA는 * 23 균주에 의한 감염에는 위상 콘트라스트 화상 (화살촉,도 1a)에서 관찰 될 수 있으며, 이러한 DAPI 신호에 의해 확인 된 것처럼 여기서 개별 박테리아 깨끗이 (도 1b)를 구별 할 수있다. (그림 1C에서 DAPI 염색에 중첩) InlC 염색이 분비 단백질은 밀도가 감염된 세포의 세포질에 축적 감염된 숙주 세포 형태의 명확한 검출 할 수 방법을 보여줍니다. 형광 phalloidin도 (그림 1D)와 액틴 세포 골격의 염색 완전한 접종 세포 단층의 형태에 관한 정보를 제공하고 추가하는 방법 이웃 감염되지 않은 세포 (별표 세포 핵) D 보여O 모든 InlC 라벨을 표시하지. 그것은 InlC 세포질 수준 세포질 균수에 의존하기 때문에, 우리는 면역 형광 및 L.의 개수에 의해 검출 InlC 신호 사이의 상관 관계에 주목 한, 언급 할 가치가있다 셀 당 모노 사이토 : 그림 1에서 관찰로, 낮은 세균 수에 감염된 이웃 세포를 정량화 할 수 감소 InlC 염색을 표시합니다. 흥미롭게도, 그것은 InlC 쉽게 세포 간 확산 공정 (도 1C) 액틴 염색 (도 1D)으로도 관찰에 잡힌 박테리아에 의해 형성된 돌기에 검출되는 것을 관찰하는 것도 가능하다. 488 nm의 채널을 사용하지 않기 때문에 참고로, 박테리아 직접 L., 우리의 프로토콜에 염색되지 않지만 모노 사이토 겐에서는 구체적인 항균 혈청을 사용하여 표시 될 수 있으며, 그렇지 않으면 GFP 발현하는 박테리아는 대안 적으로 사용될 수있다.
이러한 T와 같은 영상 분석 도구를 사용하여그는 공개 소프트웨어 CellProfiler (브로드 연구소 www.cellprofiler.org은 ), 그것은 세그먼트 셀 가능하고 특정 실험 조건에 대한 감염 인덱스를 추정하는 데 사용될 수있는 개별 감염된 세포에서 InlC 신호를 측정하기. 도 2에 도시 된 바와 같이, DAPI와 핵의 라벨링 (도 2A) 및 phalloidin도 함께 액틴 세포 골격 (도 2C) 셀룰러 분할에 필요한 정보를 제공한다 : 핵은 개별 셀의 식별 (도에 대한 참조 객체로 사용 2B) 및 세포질이어서 고려 골격 신호 (도 2D)가 소요 핵으로부터 확산 함수를 사용하여 식별된다. 마지막으로, InlC 신호의 강도의 개수를 추정하기 위해 각 식별 된 셀룰러 개체 (도 2E 및 2F)에 대해 정량화 될 수있다우리가 부정적인 생각 InlC 강도에 대한 임계 값을 설정하여 세포를 감염. 감염 인덱스는 인구의 셀의 총 개수로 나눈 감염된 세포의 수로서 산출된다.
우리 프로토콜 L. 의한 숙주 세포의 감염 표적 분자의 대형 패널의 기능을 조사하기 위하여 siRNA를 스크린에 연결될 수있다 모노 사이토 제네스. 컨트롤은 형질 감염의 효율을 검증해야한다 : 예를 들어, siRNA를 표적 Kif11은 세포 사망에 이르게 형질 전환하기 위해 일반적으로 사용되는 제어, 따라서 분석의 끝에 세포의 부재는 형질 전환을 효율적으로 진행한다는 표시이다. 특히 L.에게 해결하기 위해 침략 과정 모노 사이토 겐, HeLa 세포에서 만난 세포 수용체 siRNA를 불 활성화가 숙주 세포에 세균 항목의 주요 억제에 이르게 접종 세포의 단층 (그림에서 InlC 양성 세포의 매우 낮은 수준에 이르게3A) 스크램블 siRNA의 제어 (도 3b)로 처리 된 세포에 비해. 후보 불명 분자의 기능이 표준으로 알려진 세포 분자를 사용하는 우리의 분석으로 조사 될 수있다.
그림 1. L.에 감염된 HeLa 세포에서 InlC 라벨의 감지 모노 사이토는 * P14.PrfA을 변형., 우리의 프로토콜에 설명 된 면역에 대한 처리 및 63X 목표를 사용하여 몇 군데로 헬라 CCL2 세포가 감염되었다. (A) 위상 콘트라스트 이미지는 여러 P14.PrfA * 박테리아는 화살촉으로 표시됩니다. (B) DAPI의 얼룩 (파란색), (A)에서와 같은 개별 박테리아는 화살촉으로 표시되어 있습니다. (C) DAPI의 얼룩 (파란색)의 중첩과InlC 염색 (빨강)는, 감염되지 않은 세포의 핵은 별표로 표시되어 있습니다. (D) InlC (빨강)의 중첩과 액틴 (녹색) 신호. 바 :. 5 μm의 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. L. 감염된 HeLa 세포의 분할 분석 모노 사이토는 * EGDe.PrfA을 변형., 우리의 프로토콜에 설명 된 면역에 대한 처리 및 10X 목표를 사용하여 몇 군데로 헬라 CCL2 세포가 감염되었다. (A) DAPI 신호. (B) DAPI 신호 (파란색)의 중첩은 (A)를 표시하고 굴지의 신호 (적색) 핵의 분할 (VI를 보여주는 (C)를 표시EW) 삽입을 확대. (C) 액틴 신호. (D) 셀 분할을 나타내는 (B)로서 동일한 이미지. (E) InlC 신호. InlC 염색 (노란색)의 중첩과 (D)로 (F) 같은 이미지. 바 :. 50 μm의 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. . 만난 대조군 세포에 대한 불 활성화 세포 사이 InlC 라벨의 변화는 헬라 CCL2 세포는 처음 만난 숙주 세포 수용체를 표적 사 된 siRNA의 풀과 역 형질 감염시켰다; 바와 같이 72 시간 형질 감염 후, 세포를 감염시켰다 면역을 위해 처리 및 배 객체를 사용하여 몇 군데필자. DAPI (파란색)의 (A) 중첩, 액틴 (빨간색)와 메트로를위한 불 활성화 세포 (노란색) InlC. (B) 스크램블 siRNA를 제어 처리 (A)와 관련된 세포와 동일 채널. 바 :. 50 μm의 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
몇개의 파라미터는 InlC 신호의 명확한 검출을 허용하기 위해 충분히 큰 세포질 표시 건강한 세포주의 사용을 포함하는 트립 InlC 검출 프로토콜의 성공에 중요하다. 분석에서 우리는 우리가 인해 세포질 공간의 확장에 대한 우리의 분석에 특히 적합하다 헬라 CCL2 세포의 사용을 제안하고이 문서에서 제시 등의 헬라 교토 세포와 같은 다른 헬라 클론 작은 세포질을 표시하지만, 사용할 수 있습니다 우리 감염 프로토콜 (세포가 종종 CCL2 헬라 세포의 경우와 이웃하는 셀과 중첩되지 않기 때문에 교토 헬라 세포는 특히 세그멘테이션 분석하도록 구성된다.) 이러한 다형 핵 세포 나 대 식세포와 같은 아주 작은 세포질을 제시 세포는 우리의 프로토콜과 조합에 사용하지 않는 것이 좋습니다.
우리는 여기에 존재하는 것과 같은 이미징 프로토콜의 제한은 세포의 최소한의 양이 infe되어야한다는 사실cted는 제어 조건에 관련 단층으로, 충분히 resolutive 파워 시스템을 제공하기 위해 : 몇 세포가 감염된 경우, 그렇지 않으면, 그것은 잠재적 인 분자 후보의 기능을 조사하고, 특히, 감염 속도의 변화를 결정하는 것이 어렵게된다되었는지 감염을 감소시킬 것으로 예상했다. L.위한 유일한 표면 수용체로서 만난 표현 HeLa 세포를 사용하는 경우이 제한은 실제 문제를 의미 리스테리아 모노 사이토 겐 단백질 InlB 및 따라서 제대로 가장 L.에 의해 침략하는 변종 모노 사이토 겐. 하나의 대안은 침습성 세균의 수를 늘릴뿐만 아니라 (인해 독소리스 테리 O를 형성하는 세균 모공의 세포 배양 배지에서 더 높은 수준으로 세포 손상의 위험이 증가 할 수있는 감염의 매우 높은 다중도 (MOI> 100)을 사용하는 것이다 매우 강력한 세포 독성 활성을 표시 LLO). 다른 대안은 우리의 프로토콜에 제시된 EGDe.PrfA * 변형으로 슈퍼 침략 균주를 사용하는 것입니다어느 낮은 MOI (<25)의 사용을 허용하고 LLO 의존적 세포 독성 효과의 양을 줄여 L. 얻어진 결과 모노 사이토 슈퍼 침략 변형 이후 (아래 참조) 분석의 다른 유형에서 다른 덜 독성 균주를 사용하여 유효성을 검사 할 수 있습니다. 세 번째 대안은 E-cadherin의와 메트로를 모두 표현하는 다른 세포 라인을 사용하는 것입니다 : 그것은 같은 양에 의해 침략 할 수있는 영양막 세포와 같은 Jeg3 또는 BEWO 세포, 또는 대장 암 로보 세포와 같은 세포 라인의 경우와 InlA 및 InlB 의존 진입 경로는 이들 세포주에서 세포 감염의 높은 속도는 L.를 사용하여 도달 할 수 있습니다 이러한 EGDE, EGDe.PrfA의 부모의 변형 *와 같은 변종 모노 사이토 겐. 이것은 이펙터가 어려운 결과 분석 렌더링, 다른 통로에 불 활성화되는 경우에는, 두 경로에서 기능의 중복 한 통로로 보상 영향들을 초래할 수 있으며, 고려되어야한다. 그것은 그쪽을 언급하는 것이 중요하다t 세포는 감염을 증가 이벤트의 검출을 허용하는 양호한 동적 범위로 시스템을 제공하기 위해 감염된 오버이어야한다 : 우리의 특정 프로토콜에서, 우리 MOI 30 %의 최적 감염율에 이르게한다.
L.에 의해 숙주 세포의 침입을 공부하는 다른 방법 모노 사이토 겐은 (우리 감염 프로토콜의 첫번째 부분에서 제시된 절차와 유사한) 세균 감염의 초기 기간 후 세포 배양 배지로 겐타 마이신을 첨가하여 세포 외 박테리아의 살해에 근거하고 고전 겐타 마이신 침윤 분석 (26)를 포함 침략은 한천 플레이트에 남아있는 세포 내 박테리아를 도금하고이 판에 성장 콜로니 형성 단위의 수 (CFUs)를 계산하여 획득된다. 이 방법은 실제로 treatme의 겐타 마이신으로부터 보호된다 침습성 세균의 정확한 개수, 이는 감염에 대한 가장 직접적인 판독을 사용하는 이점을 제시NT 숙주 세포의 세포질 공간에 있지만,이 방법은 감염에 대한 하나의 판독을 제공하지 않으며 숙주 세포는 세포 내 CFUs 발매 용해되면 종점에서 셀의 실제 상태에 관한 정보를 얻을 수있는 기록은 더 이상있어 실험. 우리 프로토콜은 간접법, InlC 분비 단백질의 검출에 기초하지만, 이전에 언급 한 바와 같이, 세포질 InlC의 수준은 세포질 L.의 개수와 상관 관계가있다 모노 사이토 제네스 (그림 1). 더욱이, 우리의 현미경 분석의 본질적인 특성은 명확 감염의 끝에 셀의 정확한 상태를 확립 할 수 : 우리는 따라서 등 해외 셀룰러 형태에 관한 정보, 액틴 세포 골격 분포, 세포주기의 단계, 추출 및 높은 함량을 수행 할 감염의 분석. 이러한 유형의 분석에서 추출 할 수있는 한 가지 중요한 특징은 인구 컨텍스트 및 감염에 미치는 영향이다: 실제로, Pelkmans 및 동료 27 개의 최근 연구는 관련 세포의 특정 집단 컨텍스트 (예를 들어, 아일릿의 셀 그룹 내 주변으로부터 그 위치가) 바이러스 감염에 이입 및 감수성 등 여러 세포 기능에 영향을 미친다는 것을 보여 주었다. 우리의 분석에 따라서 이러한 정보의 추출을위한 가능성을 제공한다.
우리의 방법은 추가적인 장점을 제공합니다 : InlC 인해 세포 내 박테리아의 분비에 감염 늦은 판독하기 때문에, 숙주 세포에 InlC 축적의 수준에 영향을 미치는 호스트 신호 전달 경로는 잠재적으로 세균 항목뿐만 아니라, 액포 탈출, 세포 내 증식뿐만 아니라 영향을 미칠 수 결국 세포에 세포 확산. 따라서, 우리의 방법은 해외 악성 일차 리드로 사용될 수 siRNA의 화면을 통해 확인 된 기본 적중 의해 교란 된 특정 감염 단계를 해부 차 분석에 연결될 수있다. 마지막으로, 우리의 방법은 업 스케일 완전히 와셔 장치를 이용하여 자동화 된 수동 수행 실험에 비해 결과 변형의 레벨을 감소시키면서, 따라서 하나의 실험에서 분석 된 샘플의 수를 증가 할 수 있음은 물론 중요하다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
P. Cossart 실험실에서 연구는 파스퇴르 연구소, 문화원 국립 드 라 상테 외 드 라 공들인 Médicale, 문화원 내셔널 드 라 공들인 Agronomique, ERC 고급 그랜트 (233348), 직원은 국립 드 라 공들인 (부여 MIE-에서 지원 SignRupVac), 루이 Jeantet 재단과 매그 르 로크 레 무 스케 타이. AK는 파스퇴르 파리 대학 국제 박사 과정 / 문화원 카르노 만성 질환 Infectieuses에서 장학금을받는 사람입니다. 우리는 세포의 형질 전환 프로토콜을 최적화 제이슨 머서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
References
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면역학 제 79 HeLa 세포 리스테리아 균 그람 양성 세균 감염 형광 높은 처리량 검열 분석 실험 RNA 간섭 리스테리아 감염 현미경 작은 간섭 RNAErratum
Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014.
Citeable Link.
A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
to
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).
