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Immunology and Infection

बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

लिस्टेरिया monocytogenes अक्सर intracellular सुस्ती के अध्ययन के लिए एक प्रमुख मॉडल के रूप में इस्तेमाल एक ग्राम पॉजिटिव जीवाणु रोगज़नक़ है. देर एल इमेजिंग छोटे दखल शाही सेना स्क्रीन के संदर्भ में संक्रमण चरणों monocytogenes लक्ष्य मेजबान कोशिकाओं के जीवाणु संक्रमण के लिए आवश्यक सेलुलर रास्ते की वैश्विक अध्ययन के लिए अनुमति देता है.

Abstract

बैक्टीरियल intracellular रोगज़नक़ों exquisitely हेरफेर और मेजबान लक्ष्य ऊतकों के संक्रमण के लिए आवश्यक हैं जो सेल कार्यों नाश करने के लिए अपनी क्षमता की वजह से सेलुलर संकेत Cascades काटना आणविक उपकरणों के रूप में कल्पना की जा सकती है. इन बैक्टीरिया रोगज़नक़ों के अलावा, लिस्टेरिया monocytogenes सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लक्षण वर्णन में intracellular सुस्ती के लिए एक प्रतिमान के रूप में इस्तेमाल किया गया है कि एक ग्राम सकारात्मक सूक्ष्मजीव है, और cytoskeletal और झिल्ली तस्करी गतिशीलता को नियंत्रित आणविक रास्ते की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई भूमिका निभाई है जो. इस अनुच्छेद में, हम एल की देर सेलुलर संक्रमण चरणों का पता लगाने के लिए एक मजबूत अति सूक्ष्म परख का वर्णन monocytogenes InlC, संक्रमित कोशिकाओं के cytoplasm में जम जाता है, जो एक स्रावित बैक्टीरियल प्रोटीन की फ्लोरोसेंट लेबलिंग पर आधारित है, यह परख चार के क्रम में स्वचालित उच्च throughput छोटे दखल शाही सेना स्क्रीन के लिए युग्मित किया जा सकता हैसंक्रमण के ऊपर या नीचे विनियमन में शामिल सेलुलर संकेत दे रास्ते acterize.

Introduction

ग्राम पॉजिटिव जीवाणु लिस्टेरिया monocytogenes, मेजबान कोशिकाओं पर हमला इसकी internalization रिक्तिका बाधित और मेजबान कोशिकाओं 1 के cytoplasm में replicates कि एक खाद्य जनित रोगज़नक़ है. एल सेलुलर और पशु मॉडल में मनाया बैक्टीरियल डाह लक्षण के हठ के साथ जुड़े प्रयोगशाला संदर्भ (तेजी से विकास, स्वस्थ व्यक्तियों के लिए कम विषाक्तता) में हेरफेर की आसानी monocytogenes (रक्तलायी गतिविधि, leukocytosis) के लिए एक प्रमुख मॉडल के रूप में 1960 के दशक में अपनी आरंभिक उपयोग की अनुमति दी intracellular सुस्ती की और संक्रमण 2 के खिलाफ सेलुलर प्रतिरक्षा के सैद्धांतिक नींव की स्थापना के लिए अध्ययन. देर से 1980 के दशक और 1990 के दशक में, बैक्टीरियल intracellular चक्र 3 के साथ ही सबसे महत्वपूर्ण बैक्टीरियल डाह के आणविक लक्षण वर्णन के विच्छेदन 4-7 एल के उपयोग इष्ट कारकों जोड़ - तोड़ और संवर्धन के लिए एक महत्वपूर्ण आणविक उपकरण के रूप में monocytogenesमेजबान सेल कार्यों के y. लिस्टेरिया जीनस में असंक्रामक की उपस्थिति (एल innocua) और ज़हरीले (एल monocytogenes) प्रजाति तुलनात्मक जीनोमिक अध्ययन 8 के लिए मार्ग प्रशस्त किया है कि, एक साथ पूरा एल की हाल ही में स्थापना के साथ monocytogenes एल के विकास की हमारी समझ में वृद्धि हुई है, 9 Transcriptome एक मानव रोगज़नक़ के रूप में और संक्रमण के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप monocytogenes 10 अध्ययन करता है.

एल monocytogenes अपने मेजबान सेल रिसेप्टर्स क्रमशः ई cadherin और मेट, 11-12 से बैक्टीरियल सतह प्रोटीन InlA और InlB की बातचीत पर मेजबान कोशिकाओं में इसकी internalization लाती है. प्रारंभिक उम्मीदवार आधारित अध्ययन के InlB एक महत्वपूर्ण प्रेरक के रूप में InlA-आक्रमण मार्ग 13 का और phosphoinositide 3 kinase (पीआई 3 कश्मीर) का एक महत्वपूर्ण घटक के रूप में α / β catenins actin के लिंक की पहचान करने के लिए नेतृत्व निर्भर आक्रमण cascaडी 14-15. प्रोटिओमिक और कार्यात्मक आधारित assays बाद में अनुमति दी उपन्यास cytoskeletal तत्वों 16 और मेजबान सेल आक्रमण के लिए आवश्यक लिपिड दूसरा दूत 17 की पहचान. Transcriptional पढ़ाई 18 और मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स 19 हाल ही में मेजबान cascades संकेत की सक्रियता और एल दौरान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन के विषय में नया प्रकाश डाला है संक्रमण monocytogenes. सिस्टम्स बायोलॉजी छोटे दखल शाही सेना द्वारा जीन (kinomes, पूरा जीनोम) के बड़े सेट की निष्क्रियता पर आधारित दृष्टिकोण (siRNA) मुंह बंद हाल ही में phagocytosis सहित विशिष्ट सेलुलर कार्यों के संदर्भ में Cascades संकेत वैश्विक मेजबान के विश्लेषण के लिए नए रास्ते खोल दिया है और रोगज़नक़ internalization 20. जीनोम चौड़ा siRNA स्क्रीन पहले से एल के संक्रमण के लिए आवश्यक सेलुलर Cascades जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया है phagocytic ड्रोसोफिला में monocytogenes 21-22, लेकिन विश्लेषण के इस प्रकार के गैर phagocytic कोशिकाओं में प्रदर्शन नहीं किया गया है, vivo में संक्रमण के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं.

हम एल द्वारा संक्रमण की देर चरणों का अति सूक्ष्म का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित है उपकला कोशिकाओं के भीतर बैक्टीरियल प्रविष्टि के उच्च throughput siRNA पढ़ाई के लिए अनुकूल है कि monocytogenes. हमारे परख एक अत्यधिक आक्रामक एल का लाभ लेता है PrfA, एल के प्रमुख transcriptional नियामक में एक बिंदु उत्परिवर्तन प्रस्तुत करता है कि तनाव monocytogenes डाह 6 कारकों monocytogenes: (PrfA * नाम) इस उत्परिवर्तन 23 PrfA अनिवार्यता से सक्रिय renders और इसलिए अन्यथा खराब संक्रमित गैर phagocytic कोशिकाओं में बैक्टीरियल प्रविष्टि के पक्ष में, आक्रमण प्रोटीन InlA और InlB की एक वृद्धि की अभिव्यक्ति की ओर जाता है. संक्रमण के लिए हमारे readout secreted बैक्टीरियल प्रोटीन InlC की साइटोसोलिक संचय का पता लगाने पर आधारित है: इस अणु हैइंट्रा साइटोप्लाज्मिक एल द्वारा रियायत के तौर पर व्यक्त की है कि एक pleiotropic प्रेरक monocytogenes 9 और जो भाग लेता है बैक्टीरियल सेल करने वाली सेल में 24 फैल लेकिन यह भी मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 25 modulates जो न केवल. intracellular बैक्टीरिया द्वारा InlC स्राव के फ्लोरोसेंट लेबलिंग स्पष्ट रूप से गैर संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमित भेद करने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक अंत बिंदु बाद में इसके विभिन्न चरणों में संक्रमण काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि readout का प्रतिनिधित्व करता है न केवल: प्रविष्टि, vacuolar भागने, साइटोसोलिक बैक्टीरियल प्रसार और सेल करने वाली सेल प्रसार. इस माइक्रोस्कोपी आधारित प्रोटोकॉल इसलिए एल द्वारा मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण में शामिल सेलुलर मार्ग का अध्ययन करने के लिए siRNA स्क्रीन के लिए युग्मित किया जा सकता है monocytogenes.

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Protocol

1. सेलुलर की तैयारी और बैक्टीरियल संस्कृतियों, अभिकर्मक उपकरण और प्राथमिक एंटीबॉडी

  1. व्यक्तिगत एल अलग करने के लिए एक ताजा अगर प्लेट तैयार करें सेल्सियस -80 पर रखा एक जीवाणु ग्लिसरॉल स्टॉक (बैक्टीरियल तरल रातोंरात संस्कृति संतृप्त glycerol/50% से 50%) से कालोनियों monocytogenes
    1. एक ब्रेन हार्ट आसव (भी) अगर प्लेट पर एक जमे हुए बैक्टीरियल ग्लिसरॉल स्टॉक, लकीर बैक्टीरिया के परिवहन के लिए (-80 डिग्री सेल्सियस पर रखा) एक एल्यूमीनियम रैक का उपयोग करना.
    2. 48 घंटा (या व्यक्तिगत बैक्टीरियल कालोनियों अलग किया जा सकता जब तक) के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
    3. (यह तरल संस्कृतियों बीज के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) 1 महीने की एक अधिकतम समय के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस पर बाद में यह काम कर थाली में रखें.
    4. हमारे प्रोटोकॉल में, हम एल का उपयोग सीरोटाइप 1/2â EGDe.PrfA * तनाव monocytogenes, लेकिन चित्रा 1, एल में सचित्र P14.PrfA 4b monocytogenes सीरोटाइप * तनाव समान परिणाम देता है.
  2. वहला ATCC CCL2 कोशिकाओं एंटीबायोटिक दवाओं के अभाव में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में बड़े हो रहे हैं.
  3. तले (नियंत्रण) और विरोधी मेट siRNAs काला 384 अच्छी तरह माइक्रोस्कोपी सेल संस्कृति प्लेटों में लोड कर रहे हैं के निर्दलीय ताल.
    1. RNase मुक्त पानी के 500 μl में siRNA के 160 pmol पतला और अच्छी तरह से प्रति इस समाधान के 5 μl (अंतिम एकाग्रता: 1.6 pmol) जोड़ें.
    2. 1 वर्ष की अधिकतम अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इस प्लेट रखें.
  4. पहले 25 में वर्णित के रूप में एक InlC-जीएसटी पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग टीकाकरण द्वारा प्राप्त किया गया है InlC बैक्टीरियल प्रोटीन के खिलाफ पॉलीक्लोनल खरगोश एंटीबॉडी.

2. SiRNA सेल अभिकर्मक रिवर्स

  1. संक्रमण से पहले 72 घंटे कमरे के तापमान में अच्छी तरह से प्रत्येक में RNase मुक्त पानी के 5 μl में 1.6 pmol siRNA युक्त काला 384 अच्छी तरह माइक्रोस्कोपी सेल संस्कृति की थाली ले आओ.
  2. 300 पर 3 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्रकुओं की दीवारों में जमा किया जा सकता था जो siRNA नीचे लाने के लिए कमरे के तापमान पर आरसीएफ.
  3. 0.4% Lipofectamine RNAiMAX के साथ पूरक कमरे के तापमान DMEM तैयार करें.
  4. (SiRNA में जोड़ने से पहले अब 20 मिनट से अभिकर्मक मध्यम सेते नहीं है) एक अच्छी तरह से DMEM / RNAiMAX अभिकर्मक मध्यम के 25 μl जोड़ें.
  5. अभिकर्मक समाधान के साथ siRNA मिश्रण करने के लिए आगे और पीछे की थाली ले जाएँ, तो siRNA की Lipofectamine परिसरों फार्म करने की अनुमति के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए थाली रखने के लिए.
  6. एक बार 10 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म पीबीएस के साथ मिला हुआ या उप मिला हुआ सेल संस्कृति कुप्पी से धो HELA कोशिकाओं.
  7. 1 मिलीलीटर 37 डिग्री जोड़कर HELA कोशिकाओं को अलग सी सेल संस्कृति कुप्पी trypsin prewarmed और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 से 5 मिनट के लिए सेते
  8. 10 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस में पुनः निलंबित कोशिकाओं 16% FBS के साथ पूरक DMEM prewarmed.
  9. कक्षों की गणना और तैयार DMEM में मिलीग्राम प्रति 12,000 कोशिकाओं के एक सेल निलंबन के साथ पूरक16% FBS.
  10. 384 अच्छी तरह से थाली में एक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 50 μl जोड़ें.
  11. कोशिकाओं को वितरित करने और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बसने जाने के लिए आगे और पीछे जल्दी से थाली ले जाएँ.
  12. Parafilm के साथ प्लेट को सील करने और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified 5% सीओ 2 युक्त वातावरण में 72 घंटे के लिए रख

3. सेलुलर संक्रमण और धुंधला

  1. संक्रमण से पहले दिन, एल के एक ही कॉलोनी ले BHI अगर थाली से monocytogenes और एक 15 एमएल polystyrene ट्यूब में तरल BHI माध्यम के 5 मिलीलीटर में यह resuspend.
  2. बैक्टीरियल वृद्धि के लिए अनुमति देने के लिए एक shacking डिवाइस में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
  3. संक्रमण के दिन, रात भर एल के 1 मिलीलीटर धोने एक टेबल टॉप अपकेंद्रित्र पर 10,600 आरसीएफ में 2 मिनट centrifuging द्वारा संस्कृति monocytogenes.
  4. (Secreted cytotoxin listeriolysin हे होता है) पर तैरनेवाला त्यागें और पीबीएस के 1 मिलीलीटर (repea में गोली फिर से निलंबित) धोने कदम 3 गुना अधिक टी.
  5. 600 एनएम पर बैक्टीरियल ऑप्टिकल घनत्व पढ़ें और जीवाणुओं की संख्या (आयुध डिपो = 1 1E9 बैक्टीरिया / मिलीलीटर के बराबर है) का अनुमान है.
  6. पर्याप्त एल तैयार करें 1% FBS के साथ पूरक DMEM में कमजोर पड़ने monocytogenes: EGDe.PrfA * जैसे अत्यधिक आक्रामक उपभेदों का उपयोग कर, हम अच्छी तरह से प्रति मध्यम के 30 μl में 5E4 बैक्टीरिया का उपयोग (संक्रमण की बहुलता 2,000 कोशिकाओं के लिए 25 के रूप में अनुमान लगाया गया है) का सुझाव है.
  7. प्रत्येक कुएं में सेल संस्कृति माध्यम (80 μl) निकालें और एल के 30 μl जोड़कर इसे बदलना मध्यम monocytogenes युक्त.
  8. संक्रमण प्रक्रिया सिंक्रनाइज़ करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 200 आरसीएफ में थाली अपकेंद्रित्र.
  9. एक prewarmed एल्यूमीनियम ब्लॉक पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified 5% सीओ 2 युक्त वातावरण में 1 घंटे के लिए थाली सेते हैं.
  10. एल निकालें अच्छी तरह से प्रत्येक से मध्यम monocytogenes युक्त और 10% FBS के साथ पूरक prewarmed DMEM के 30 μl जोड़ने और40 माइक्रोग्राम / एमएल gentamicin कोशिकी एल मारने के लिए monocytogenes.
  11. एक prewarmed धातु खंड पर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 युक्त वातावरण में 4 घंटे के लिए सेते हैं.
  12. 8% formaldehyde (बल्कि paraformaldehyde पॉलिमर से formaldehyde monomers, उपयोग किया जाता है तो यह समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए) के साथ पूरक पीबीएस के एक समाधान तैयार करें.
  13. सेल संस्कृति माध्यम discarding बिना, 8% formaldehyde (अंतिम एकाग्रता: 4%) के साथ पूरक पीबीएस के 30 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  14. लगानेवाला निकालें और (अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 80 μl के अंतिम मात्रा में कोशिकाओं रखने के लिए) अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 80 μl के साथ कोशिकाओं तीन बार धोएं.
  15. तैयार करें एक 1:250 पीबीएस में खरगोश विरोधी InlC सीरम के कमजोर पड़ने 0.2% सैपोनिन के साथ पूरक.
  16. अच्छी तरह से पीबीएस को हटाने के बाद से प्रत्येक के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 10 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  17. प्राथमिक त्यागेंएंटीबॉडी समाधान और अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 40 μl के साथ चार बार धोने.
  18. पीबीएस में माध्यमिक एलेक्सा Fluor 546 युग्मित विरोधी खरगोश एंटीबॉडी (1:250), DAPI समाधान (1:1,500) और phalloidin-Dy647 (1:150) पतला 0.2% सैपोनिन के साथ पूरक.
  19. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए इस द्वितीयक धुंधला समाधान के 10 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  20. माध्यमिक धुंधला समाधान त्यागें और अच्छी तरह से (प्रत्येक में 40 μl के अंतिम मात्रा को छोड़ और थाली मुहर) अच्छी तरह से प्रति पीबीएस के 40 μl के साथ चार बार धोने.
  21. थाली तुरंत imaged किया जा सकता है या बाद के विश्लेषण के लिए प्रकाश से रक्षा 4 डिग्री सेल्सियस (एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर) पर संग्रहित किया जा सकता है.

4. छवि के अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. एक स्वचालित खुर्दबीन पर घुड़सवार एक 10X उद्देश्य (अच्छी तरह से प्रति रियायत के तौर पर 9 छवियों के अधिग्रहण) का उपयोग करते हुए तीन अलग अलग चैनलों (350 एनएम, 546 एनएम और 647 एनएम) में छवियों मोल.
  2. InlC संकेत छवि का उपयोग करके मापा जा सकता हैक्रमशः DAPI और Phalloidin धुंधला, का उपयोग नाभिक और सेल शरीर के स्वचालित विभाजन की अनुमति देता है कि CellProfiler तरह विश्लेषण सॉफ्टवेयर.

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Representative Results

Cytoplasmic InlC के फ्लोरोसेंट लेबलिंग एल द्वारा सेल संक्रमण के लिए एक मजबूत readout प्रदान करता है monocytogenes, चित्रा 1 में सचित्र: माइक्रोग्राफ में केंद्रीय सेल अत्यधिक P14.PrfA * 23 तनाव से संक्रमित है यह चरण विपरीत छवि (तीर, चित्रा 1 ए) में देखा जा सकता है और यह DAPI संकेत की पुष्टि की है जहां के रूप में व्यक्तिगत बैक्टीरिया स्पष्ट रूप से (चित्रा 1 बी) प्रतिष्ठित किया जा सकता. (चित्रा 1C में DAPI धुंधला करने superposed) InlC धुंधला इस secreted प्रोटीन घनी संक्रमित कोशिकाओं के cytosol में जम जाता है और संक्रमित मेजबान सेल आकारिकी की एक स्पष्ट पता लगाने की अनुमति देता है कि कैसे दर्शाया गया है. फ्लोरोसेंट phalloidin (चित्रा -1) के साथ actin cytoskeleton की धुंधला पूरा टीका सेलुलर monolayer की आकृति विज्ञान के विषय में जानकारी प्रदान करता है और आगे कैसे पड़ोसी गैर संक्रमित कोशिकाओं (एक तारक से चिह्नित सेल नाभिक) डी दिखाता हैओ किसी भी InlC लेबलिंग प्रदर्शित नहीं. यह InlC साइटोसोलिक स्तरों cytoplasmic जीवाणुओं की संख्या पर निर्भर कर रहे हैं के बाद से, हम immunofluorescence और एल की संख्या से पता चला InlC संकेत के बीच एक संबंध का उल्लेख किया है, कि उल्लेख के लायक है सेल प्रति monocytogenes: चित्रा 1 में मनाया के रूप में, कम बैक्टीरियल संख्या से संक्रमित पड़ोसी कोशिकाओं मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जो एक कम InlC धुंधला प्रदर्शित करते हैं. दिलचस्प बात यह InlC आसानी से सेल करने वाली सेल प्रसार की प्रक्रिया (चित्रा 1C) actin धुंधला (चित्रा -1) के साथ भी मनाया के रूप में पकड़ा बैक्टीरिया द्वारा गठित protrusions में पता चला है कि निरीक्षण करने के लिए भी संभव है. 488 एनएम चैनल नहीं किया जाता है के बाद से ध्यान से, जीवाणु सीधे एल, हमारे प्रोटोकॉल में दाग, लेकिन नहीं कर रहे हैं monocytogenes एक विशिष्ट विरोधी बैक्टीरियल सीरम का उपयोग लेबल किया जा सकता है, अन्यथा, GFP-व्यक्त बैक्टीरिया वैकल्पिक रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

ऐसी टी के रूप में इमेजिंग विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करनावह जनता सॉफ्टवेयर CellProfiler (ब्रॉड संस्थान, www.cellprofiler.org ), यह खंड कोशिकाओं के लिए संभव है और एक विशिष्ट प्रयोगात्मक हालत के लिए एक संक्रमण सूचकांक का अनुमान किया जा सकता है जो व्यक्ति के संक्रमित कोशिकाओं में InlC संकेत, को मापने के लिए. चित्रा 2 में दिखाया गया है, DAPI साथ नाभिक की लेबलिंग (2A चित्रा) और phalloidin साथ actin cytoskeleton (चित्रा -2) सेलुलर विभाजन के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान: नाभिक व्यक्ति की कोशिकाओं की पहचान (चित्रा के लिए संदर्भ वस्तुओं के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं 2 बी) और कोशिका द्रव्य बाद में खाते में cytoskeletal संकेत (चित्रा 2 डी) लेता है कि नाभिक से एक फैल समारोह का उपयोग पहचान की है. अंत में, InlC संकेत की तीव्रता संख्या का अनुमान लगाने के लिए प्रत्येक पहचान सेलुलर वस्तु (आंकड़े 2 ई और 2 एफ) के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैहम के रूप में नकारात्मक विचार है कि InlC तीव्रता के लिए एक सीमा निर्धारित करके कोशिकाओं को संक्रमित. संक्रमण सूचकांक जनसंख्या में कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित संक्रमित कोशिकाओं की संख्या के रूप में गणना की है.

हमारे प्रोटोकॉल एल द्वारा मेजबान कोशिकाओं के संक्रमण में लक्ष्य अणुओं की बड़ी पैनल के समारोह की जांच के लिए siRNA स्क्रीन के लिए युग्मित किया जा सकता है monocytogenes. नियंत्रण अभिकर्मक की दक्षता को मान्य करने की आवश्यकता है: उदाहरण के लिए, siRNA को लक्षित Kif11 कोशिका मृत्यु की ओर जाता है कि अभिकर्मक के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया नियंत्रण है, और इसलिए परख के अंत में कोशिकाओं के अभाव अभिकर्मक कुशलतापूर्वक दीं कि एक संकेत है. विशेष रूप से एल के समाधान के लिए आक्रमण प्रक्रिया monocytogenes, HELA कोशिकाओं में मिले सेलुलर रिसेप्टर के siRNA निष्क्रियता मेजबान कोशिकाओं में बैक्टीरियल प्रविष्टि की एक प्रमुख निषेध की ओर जाता है और एक टीका सेलुलर monolayer (चित्रा में InlC पॉजिटिव कोशिकाओं का स्तर बहुत कम करने के लिए सुराग3 ए) एक तले siRNA नियंत्रण (3B चित्रा) के साथ इलाज किया कोशिकाओं की तुलना में. उम्मीदवार अज्ञात अणुओं के समारोह में मानक के रूप में यह जाना जाता सेल अणु का उपयोग हमारी परख के साथ जांच की जा सकती है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एल से संक्रमित HELA कोशिकाओं में InlC लेबलिंग की जांच monocytogenes * P14.PrfA तनाव., हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित immunofluorescence के लिए कार्रवाई और एक 63X उद्देश्य का उपयोग imaged के रूप में हेला CCL2 कोशिकाओं को संक्रमित कर दिया गया है. (ए) चरण विपरीत छवि, कई P14.PrfA * बैक्टीरिया तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. (बी) DAPI धुंधला (नीला), (ए) के रूप में एक ही व्यक्ति बैक्टीरिया तीर से चिह्नित कर रहे हैं. (सी) DAPI धुंधला (नीला) के superposition औरInlC धुंधला हो जाना (लाल), असंक्रमित कोशिकाओं के नाभिक एक तारक से चिह्नित कर रहे हैं. (डी) InlC (लाल) के superposition और actin (हरा) का संकेत है. बार:. 5 माइक्रोन बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. एल से संक्रमित HELA कोशिकाओं के विभाजन विश्लेषण monocytogenes * EGDe.PrfA तनाव., हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित immunofluorescence के लिए कार्रवाई और एक 10x उद्देश्य का उपयोग imaged के रूप में हेला CCL2 कोशिकाओं संक्रमित थे. (ए) DAPI संकेत. (बी) DAPI संकेत (नीला) के superposition (ए) में प्रदर्शित और actin संकेत (लाल) नाभिक विभाजन (vi दिखा (सी) में प्रदर्शितईडब्ल्यू) इनसेट बढ़े. (सी) actin संकेत. (डी) कोशिकाओं के विभाजन दिखा (बी) के रूप में एक ही छवि. (ई) InlC संकेत. InlC धुंधला (पीला) के superposition के साथ (डी) के रूप में (एफ) एक ही छवि. बार:. 50 माइक्रोन बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. . से मुलाकात की और नियंत्रण कक्षों के लिए निष्क्रिय कोशिकाओं के बीच InlC लेबलिंग का रूपांतर हेला CCL2 कोशिकाओं शुरू में मिले मेजबान सेल रिसेप्टर को लक्षित चार siRNAs की एक पूल के साथ रिवर्स ट्रांसफ़ेक्ट थे, के रूप में वर्णित 72 घंटा अभिकर्मक के बाद, सेल, संक्रमित थे immunofluorescence के लिए कार्रवाई और एक 10x वस्तु का उपयोग imagedive. DAPI (नीला) (ए) superposition, actin (लाल) और मेट के लिए निष्क्रिय कोशिकाओं में (पीला) InlC. (बी) एक तले siRNA नियंत्रण के साथ इलाज (ए) के विषय में कोशिकाओं के रूप में ही चैनलों. बार:. 50 माइक्रोन बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

कई मापदंडों InlC संकेत की एक स्पष्ट पता लगाने की अनुमति एक पर्याप्त बड़ी कोशिका द्रव्य प्रदर्शित स्वस्थ कोशिका लाइनों के उपयोग सहित हमारे InlC पता लगाने प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं. परख में हम हम के कारण उनके साइटोसोलिक अंतरिक्ष का विस्तार करने के लिए हमारे परख के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल हैं जो हेला CCL2 कोशिकाओं के उपयोग का प्रस्ताव है, इस लेख में पेश, ऐसे हेला क्योटो कोशिकाओं के रूप में अन्य हेला क्लोन एक छोटे कोशिका द्रव्य प्रदर्शित लेकिन इस्तेमाल किया जा सकता है हमारे संक्रमण प्रोटोकॉल के साथ (कोशिकाओं अक्सर हेला CCL2 कोशिकाओं के लिए मामला है जो पड़ोसी कोशिकाओं, साथ ओवरलैप नहीं है के बाद से हेला क्योटो कोशिकाओं को विशेष रूप से अच्छी तरह से विभाजन के विश्लेषण के लिए अनुकूलित कर रहे हैं). ऐसे polymorphonuclear कोशिकाओं या मैक्रोफेज के रूप में एक बहुत छोटे से कोशिका द्रव्य पेश कोशिकाओं हमारे प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में उपयोग करने के लिए सिफारिश नहीं कर रहे.

हम यहां मौजूद एक के रूप में एक इमेजिंग प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि कोशिकाओं की एक न्यूनतम राशि infe किया जाना चाहिए कि तथ्य यह हैcted, नियंत्रण की स्थिति में एक भी monolayer में, पर्याप्त घोलक शक्ति के साथ प्रणाली प्रदान करने के लिए: कुछ कोशिकाओं को संक्रमित कर रहे हैं अगर नहीं तो, यह संभावित आणविक उम्मीदवारों के समारोह की जांच, खासकर जब संक्रमण दर में परिवर्तन तय कर पाना मुश्किल हो जाता है कि संक्रमण को कम करने की उम्मीद है. एल के लिए केवल सतह रिसेप्टर के रूप में मिले व्यक्त HELA कोशिकाओं का उपयोग कर जब यह सीमा एक वास्तविक समस्या का प्रतिनिधित्व करता है monocytogenes प्रोटीन InlB और इसलिए खराब सबसे एल द्वारा हमला कर रहे हैं उपभेदों monocytogenes. एक वैकल्पिक आक्रामक बैक्टीरिया की संख्या में वृद्धि, लेकिन यह भी कारण (विष listeriolysin हे गठन जीवाणु ताकना की सेल संस्कृति माध्यम में उच्च स्तर के लिए सेल की क्षति का खतरा बढ़ सकता है जो संक्रमण का एक बहुत ही उच्च बहुलता (MOI> 100) उपयोग करने के लिए है एक बहुत शक्तिशाली साइटोटोक्सिक गतिविधि प्रदर्शित करता है जो ल्लो),. अन्य विकल्प जैसे हमारे प्रोटोकॉल में प्रस्तुत EGDe.PrfA * तनाव के रूप में सुपर इनवेसिव उपभेदों का इस्तेमाल होता है, जो एक कम MOI (<25) के उपयोग की अनुमति देता है और ल्लो निर्भर साइटोटोक्सिक प्रभाव की मात्रा कम कर देता है, एक एल के साथ प्राप्त परिणामों monocytogenes सुपर इनवेसिव तनाव बाद में (देखें नीचे) assays के अन्य प्रकारों में अन्य कम विषमय जीवाणु उपभेदों का उपयोग मान्य किया जा सकता. एक तीसरा विकल्प ई cadherin और मौसम दोनों व्यक्त करता है जो एक अलग सेल लाइन का उपयोग करने के लिए है: यह इस तरह दोनों द्वारा हमला किया जा सकता है जो ट्रोफोब्लास्ट तरह Jeg3 या BEWO कोशिकाओं, या पेट कार्सिनोमा lovo कोशिकाओं के रूप में सेल लाइनों के लिए मामला है InlA और InlB निर्भर प्रवेश मार्ग है, इन सेल लाइनों में, सेल संक्रमण की उच्च दर के एल का उपयोग कर पहुंचा जा सकता है ऐसे egde, EGDe.PrfA के पैतृक तनाव * के रूप में उपभेदों monocytogenes. यह एक प्रेरक मुश्किल परिणामों का विश्लेषण प्रतिपादन, अन्य मार्ग में निष्क्रिय है लेकिन, जब दोनों रास्ते में कार्यों की कि अतिरेक एक मार्ग में मुआवजा प्रभाव पैदा कर सकते हैं, ध्यान में रखा जाना चाहिए. यह था उल्लेख करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैटी कोशिकाओं को संक्रमण है कि वृद्धि की घटनाओं का पता लगाने की अनुमति एक अच्छा गतिशील रेंज के साथ प्रणाली प्रदान करने के लिए संक्रमित खत्म होने वाली नहीं होनी चाहिए: हमारे विशेष प्रोटोकॉल में, हमारे MOI 30% की एक इष्टतम संक्रमण दर की ओर जाता है.

एल द्वारा मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन करने के लिए वैकल्पिक तरीकों monocytogenes (हमारे संक्रमण प्रोटोकॉल के पहले भाग में प्रस्तुत प्रक्रिया के समान) बैक्टीरिया के संक्रमण की एक प्रारंभिक अवधि के बाद सेल संस्कृति के माध्यम से gentamicin के अलावा द्वारा बाह्य बैक्टीरिया की हत्या पर आधारित है और जो शास्त्रीय gentamicin आक्रमण परख 26 में शामिल आक्रमण अगर प्लेटों पर जीवित intracellular बैक्टीरिया चढ़ाना और इन प्लेटों पर बढ़ने कि कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या (CFUs) की गणना के द्वारा रन बनाए है. इस पद्धति वास्तव में gentamicin treatme से रक्षा कर रहे हैं कि आक्रामक बैक्टीरिया की सटीक संख्या है, जो संक्रमण के लिए सबसे प्रत्यक्ष readout उपयोग कर के लाभ प्रस्तुत करता हैNT मेजबान कोशिकाओं के cytoplasmic अंतरिक्ष में हैं, लेकिन, इस विधि के संक्रमण के लिए एक एकल readout प्रस्तुत करता है और मेजबान कोशिकाओं intracellular CFUs जारी करने के लिए lysed रहे हैं एक बार, अंत बिंदु पर कोशिकाओं की वास्तविक स्थिति के विषय में जानकारी प्राप्त करने के लिए एक रिकार्ड नहीं रह गया है प्रयोग की. हमारे प्रोटोकॉल एक अप्रत्यक्ष तरीका है, स्रावित InlC प्रोटीन का पता लगाने पर आधारित है, लेकिन जैसा कि पहले उल्लेख, cytoplasmic InlC के स्तर साइटोसोलिक एल की संख्या के साथ सहसंबंधी है monocytogenes (चित्रा 1). इसके अलावा, हमारे माइक्रोस्कोपी परख के स्वभाव को स्पष्ट रूप से संक्रमण के अंत में कोशिकाओं की सटीक स्थिति स्थापित करने के लिए अनुमति देता है: हम इसलिए आदि वैश्विक सेलुलर आकारिकी के विषय में जानकारी, actin cytoskeleton वितरण, सेल चक्र चरण, निकालने और उच्च सामग्री प्रदर्शन कर सकते हैं संक्रमण का विश्लेषण. विश्लेषण के इस प्रकार से निकाला जा सकता है कि एक महत्वपूर्ण विशेषता जनसंख्या संदर्भ और संक्रमण पर अपने प्रभाव है: दरअसल, Pelkmans और सहकर्मियों 27 से हाल ही में काम के लिए एक दिया सेल की विशेष आबादी संदर्भ (उदाहरण के लिए, एक आइलेट में कोशिकाओं का एक समूह के भीतर परिधि से अपनी स्थिति) वायरस के संक्रमण को endocytosis और संवेदनशीलता सहित कई सेलुलर कार्यों को प्रभावित करता है कि प्रदर्शन किया. हमारे परख इसलिए इस जानकारी की निकासी के लिए संभावित प्रस्तुत करता है.

हमारे विधि एक अतिरिक्त लाभ प्रस्तुत करता है: InlC कारण cytoplasmic बैक्टीरिया द्वारा अपने स्राव को संक्रमण की देर readout है के बाद से, मेजबान कोशिकाओं में InlC संचय के स्तर को प्रभावित मेजबान संकेत दे रास्ते संभावित जीवाणु प्रवेश लेकिन यह भी vacuolar भागने, साइटोसोलिक प्रसार और न केवल प्रभावित हो सकता है अंततः सेल के लिए सेल प्रसार. इसलिए, हमारे विधि वैश्विक संक्रमण के लिए एक प्राथमिक readout के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और siRNA स्क्रीन के माध्यम से पहचान की प्राथमिक हिट द्वारा परेशान किया गया है कि विशिष्ट संक्रमण कदम काटना माध्यमिक assays के लिए युग्मित किया जा सकता है. अंत में, यह हमारे विधि upscaled और पूरी तरह से थाली वॉशर उपकरणों का उपयोग कर स्वचालित, मैन्युअल रूप से बाहर किया प्रयोगों की तुलना में जब परिणाम विभिन्नता का स्तर कम है, जबकि इसलिए एक ही प्रयोग में विश्लेषण के नमूनों की संख्या में वृद्धि की जा सकती है कि उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

पी. Cossart प्रयोगशाला में रिसर्च पाश्चर संस्थान, Institut राष्ट्रीय डे ला Sante एट डी ला Recherche médicale, Institut राष्ट्रीय डे ला Recherche Agronomique, ईआरसी उन्नत अनुदान (233348), एजेंस Nationale डे ला Recherche (अनुदान Mie द्वारा समर्थित है SignRupVac), लुइस Jeantet फाउंडेशन और Fondation ले रोच लेस Mousquetaires. एके पाश्चर पेरिस विश्वविद्यालय अंतर्राष्ट्रीय डॉक्टरल कार्यक्रम / Institut कार्नोट बुराइयों Infectieuses से एक छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता है. हम सेलुलर अभिकर्मक प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए जेसन मर्सर धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

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References

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Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 79 HELA कोशिकाओं लिस्टेरिया monocytogenes ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया का संक्रमण प्रतिदीप्ति उच्च throughput स्क्रीनिंग assays शाही सेना हस्तक्षेप लिस्टेरिया monocytogenes संक्रमण माइक्रोस्कोपी छोटे दखल शाही सेना

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

बैक्टीरियल पैथोजन द्वारा सेलुलर संक्रमण की जांच करने के लिए InlC स्राव इमेजिंग<em&gt; लिस्टेरिया monocytogenes</em
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Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

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