Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imaging inlc Sekretion at undersøge Cellular Infektion med bakteriepatogen Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes er en grampositiv bakteriel patogen, der ofte anvendes som en vigtig model til undersøgelse af intracellulære parasitter. Imaging sent L. monocytogenes infektion faser i forbindelse med små interfererende RNA skærme giver mulighed for global undersøgelse af cellulære veje er nødvendig for bakteriel infektion af target værtsceller.

Abstract

Bakterielle intracellulære patogener kan opfattes som molekylære værktøjer til at dissekere cellulære signalleringskaskader på grund af deres evne til at udsøgt manipulere og undergrave cellefunktioner, som er nødvendige for infektion af værten målvæv. Blandt disse bakterielle patogener, Listeria monocytogenes er en grampositiv mikroorganisme, der er blevet anvendt som et paradigme for intracellulær parasitisme i karakteriseringen af cellulære immunreaktioner, og som har spillet instrumentale roller i opdagelsen af molekylære mekanismer, der styrer dynamik trafficking cytoskeletale og membran. I denne artikel beskriver vi en robust mikroskopisk analyse til påvisning af sene cellulær infektion stadier af L. monocytogenes er baseret på fluorescerende mærkning af inlc, et udskilt bakterielt protein, som akkumuleres i cytoplasmaet af inficerede celler, og dette assay kan kobles til automatiserede high-throughput små interfererende RNA skærme for at forkulleacterize cellulære signalveje, der er involveret i op-eller nedregulering af infektion.

Introduction

Gram positive bakterie Listeria monocytogenes er en fødevare-patogen, der invaderer værtsceller forstyrrer dets internalisering vacuole og replikerer i cytoplasma værtsceller 1. L. monocytogenes nem manipulation i laboratoriet sammenhæng (hurtig vækst, lav toksicitet for raske individer) i forbindelse med den fortsatte bakterielle virulens træk observeret i cellulære og dyremodeller (hæmolytisk aktivitet, leukocytose) tilladt sin oprindelige brug i 1960'erne som en vigtig model for studiet af intracellulære parasitisme og til etablering af det teoretiske grundlag for cellulær immunitet mod infektion 2. I slutningen af 1980'erne og begyndelsen af 1990'erne, dissektion af den bakterielle intracellulære cyklus 3 samt molekylær karakterisering af de vigtigste bakterielle virulensfaktorer 4-7 foretrak brugen af L. monocytogenes som en vigtig molekylær værktøj til manipulation og study værts cellefunktioner. Tilstedeværelsen af avirulente (L. innocua) og virulente (L. monocytogenes) arter i Listeria slægten banede vejen for komparativ genomisk undersøgelser 8, som sammen med den nylige oprettelse af komplet V. monocytogenes transkriptom 9, har øget vores forståelse af udviklingen af L. monocytogenes som et humant patogen og som et modelsystem for infektion studerer 10.

L. monocytogenes inducerer sin internalisering i værtsceller ved interaktion af de bakterielle overfladeproteiner inla og INLB med deres værtscellereceptorer E-cadherin og mødte henholdsvis 11-12. Indledende kandidat-baserede studier førte til identifikation af α / β catenins-actin link som en væsentlig komponent i den inla-invasion vej 13 og phosphoinositid 3-kinase (PI 3-K) som en kritisk effektor af INLB- afhængig invasion cascade 14-15. Proteom og funktionelle assays efterfølgende tillod identifikation af nye cytoskeletelementer 16 og lipid second messengers 17 kræves for værtscelle invasion. Transkriptionelle undersøgelser 18 og massespektrometri-baserede kvantitative proteomics 19 har for nylig kastet nyt lys om aktivering af værten signalering kaskader og undertrykkelse af immunreaktioner i løbet af L. monocytogenes infektion. Systembiologi tilgang baseret på inaktivering af store sæt af gener (kinomes, komplette genomer) af små interfererende RNA (siRNA) lyddæmpning har for nylig åbnet nye muligheder for analyse af globale vært signalering kaskader i forbindelse med specifikke cellulære funktioner, herunder fagocytose og patogen internalisering 20. Genome-wide siRNA-skærme er tidligere blevet udført for at undersøge cellulære kaskader kræves for infektion af L. monocytogenes i fagocyterende Drosophila 21-22, men denne type analyse er ikke udført i ikke-fagocytceller, der repræsenterer kritiske mål for infektion in vivo.

Vi har optimeret en protokol for mikroskopisk påvisning af sene stadier af infektion med L. monocytogenes, der er velegnet til high-throughput siRNA studier af bakteriel indrejse inden epitelceller. Vores analyse tager fordel af en meget invasiv L. monocytogenes stamme, der præsenterer et punkt mutation i PrfA, de store transkriptionelle regulator af L. monocytogenes virulensfaktorer 6: denne mutation (opkaldt PrfA *) gør PrfA konstitutivt aktiv 23 og fører til en øget ekspression af invasionen proteinerne inla og INLB, derfor begunstige bakteriel post i ellers dårligt inficerede ikke-fagocytceller. Vores udlæsning for infektion er baseret på påvisning af den cytosoliske akkumulering af det secernerede bakterielt protein inlc: dette molekyle eren pleiotrop effektor der udtrykkes fortrinsvis ved intra-cytoplasmatisk L. monocytogenes 9, og som deltager ikke kun i den bakterielle celle-til-celle-spredning 24, men som også modulerer værtens immunresponser 25. Den fluorescerende mærkning af inlc sekretion af intracellulære bakterier ikke kun gør det muligt klart at skelne inficerede fra ikke-inficerede celler, men repræsenterer også et slutpunkt udlæsning, der kan bruges til efterfølgende at dissekere infektion i de forskellige faser: indrejse, vakuolær flugt, cytosol bakteriel spredning og celle-til-celle-spredning. Denne mikroskopi-baseret protokol kan kobles til siRNA skærme derfor at studere cellulære veje, der er involveret i infektion af værtsceller ved L. monocytogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Forberedelse for Cellulær og bakteriekulturer Transfektionsfremgangsmåder Værktøj og primære antistoffer

  1. Forbered en frisk agarplade at isolere enkelte L. monocytogenes kolonier fra en bakteriel glycerol stock (50% glycerol/50% mættet bakteriel flydende kultur natten over), som holdes ved -80 ° C.
    1. Ved hjælp af en aluminium rack (opbevaret ved -80 ° C) til at transportere en frossen bakteriel glycerol stock afsætter bakterier på en Brain Heart Infusion (BHI) agar.
    2. Inkubér pladen ved 37 ° C i løbet af 48 timer (eller indtil individuelle bakteriekolonier kan isoleres).
    3. Hold dette arbejde plade bagefter ved 4 ° C i løbet af en maksimal tid på 1 måned (det vil blive brugt til at pode flydende kulturer).
    4. I vores protokol, vi bruger L. monocytogenes serotype 1/2a EGDe.PrfA * stamme, men som vist i figur 1, L. monocytogenes serotype 4b P14.PrfA * stamme giver lignende resultater.
  2. HanLa ATCC CCL2 celler dyrkes i Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i fravær af antibiotika.
  3. Uafhængige pools af røræg (kontrol) og anti-Met siRNAs er indlæst i sorte mikroskopi cellekulturplader 384 brønde.
    1. Fortynd 160 pmol af siRNA i 500 pi RNase-frit vand og tilsæt 5 mikroliter af denne opløsning per brønd (slutkoncentration: 1,6 pmol).
    2. Opbevar denne plade ved -20 ° C i en periode på 1 år maksimum.
  4. Polyklonale kanin antistoffer mod bakterielt protein inlc er opnået ved immunisering ved hjælp af en inlc-GST rekombinant protein som tidligere beskrevet 25.

2. Reverse siRNA celletransfektion

  1. 72 timer før infektion bringe til stuetemperatur en sort 384-godt mikroskopi cellekultur plade indeholdende 1,6 pmol siRNA i 5 pi RNase-frit vand i hver brønd.
  2. Centrifugér pladen i 3 minutter ved 300rcf ved stuetemperatur for at nedbringe siRNA som kunne have været deponeret i væggene i brøndene.
  3. Forbered stuetemperatur DMEM suppleret med 0,4% Lipofectamin RNAiMAX.
  4. Tilsæt 25 ul af DMEM / RNAiMAX transfektion medium til hver brønd (ikke udruge transfektion medium længere end 20 min, før du tilføjer det til siRNA).
  5. Flyt pladen frem og tilbage for at blande siRNA med transfektion opløsning, og derefter holde pladen i 1 time ved stuetemperatur for at tillade siRNA-Lipofectamin komplekser til at danne.
  6. Wash HeLa-celler fra et sammenflydende-eller sub-sammenflydende cellekultur kolbe gang med 10 ml 37 ° C forvarmet PBS.
  7. Frigør HeLa-celler ved tilsætning af 1 ml 37 ° C forvarmet trypsin til cellekulturen kolbe og inkuberes i 3 til 5 minutter ved 37 ° C.
  8. Genopslæmmes cellerne i 10 ml 37 ° C forvarmet DMEM suppleret med 16% FBS.
  9. Tæl celler og forberede en cellesuspension på 12.000 celler pr ml i DMEM suppleret med16% FBS.
  10. Der tilsættes 50 pi af cellesuspension til hver brønd i 384-brønds plade.
  11. Flyt pladen hurtigt frem og tilbage for at fordele celler og lad celler slår sig ned i 10 minutter ved stuetemperatur.
  12. Forsegle skiltet med Parafilm og holde det i 72 timer i en fugtig 5% CO 2-holdige atmosfære ved 37 ° C.

3. Cellulær Infektion og Farvning

  1. Dagen før infektion, tage en enkelt koloni af L. monocytogenes fra BHI agarplade og resuspendere den i 5 ml flydende BHI-medium i et 15 ml polystyrenrør.
  2. Inkuber natten over ved 37 ° C i en shacking enhed for at muliggøre bakteriel vækst.
  3. Dagen for infektionen, vaske 1 ml af natten L. monocytogenes kultur ved centrifugering 2 minutter ved 10.600 rcf på et bord-top-centrifuge.
  4. Supernatanten (som indeholder det udskilte cytotoxin listeriolysin O) og re-suspendere pellet i 1 ml PBS (repeat vaske trin 3 gange mere).
  5. Læs den bakterielle optiske densitet ved 600 nm og estimere antallet af bakterier (OD = 1 svarer til 1E9 bakterier / ml).
  6. Forbered tilstrækkelig L. monocytogenes fortynding i DMEM suppleret med 1% FBS: ved hjælp af meget invasive stammer som EGDe.PrfA *, foreslår vi brug af 5E4 bakterier i 30 pi medium per brønd (mangfoldigheden af infektion er estimeret som 25 til 2.000 celler).
  7. Fjern celledyrkningsmediet i hver brønd (80 pi), og erstatte det ved tilsætning af 30 ul af L. monocytogenes-holdigt medium.
  8. Centrifugeres pladen ved 200 rcf for 5 min ved stuetemperatur for at synkronisere infektionsprocessen.
  9. Inkubér pladen i 1 time i en befugtet 5% CO2-holdig atmosfære ved 37 ° C på en forvarmet aluminium blok.
  10. Fjern L. monocytogenes-indeholdende medium fra hver brønd, og tilsættes 30 pi forvarmet DMEM suppleret med 10% FBS og40 ug / ml gentamicin for at dræbe ekstracellulære L. monocytogenes.
  11. Der inkuberes i 4 timer i en 5% CO 2-holdig atmosfære ved 37 ° C på en forvarmet metalblok.
  12. Der fremstilles en opløsning af PBS suppleret med 8% formaldehyd (opløsning skal fremstilles frisk, således at formaldehyd monomerer, snarere end paraformaldehyd polymerer, der anvendes).
  13. Uden at kassere celledyrkningsmediet, tilsættes 30 pi PBS suppleret med 8% formaldehyd (slutkoncentration: 4%) og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  14. Fjern fiksativ og vaske cellerne tre gange med 80 pi PBS per brønd (holde celler i et slutvolumen på 80 pi PBS per brønd).
  15. Forbered en 1:250 fortynding af kanin anti-inlc serum i PBS suppleret med 0,2% saponin.
  16. Der tilsættes 10 ul af det primære antistof til hver brønd efter fjernelse af PBS og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
  17. Kassér det primæreantistofopløsning og vaskes fire gange med 40 pi PBS per brønd.
  18. Fortynd den sekundære Alexa Fluor 546-koblet anti-kanin-antistof (1:250), DAPI opløsning (1:1,500) og phalloidin-Dy647 (1:150) i PBS suppleret med 0,2% saponin.
  19. Der tilsættes 10 ul af denne sekundære farveopløsning til hver brønd og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
  20. Kassér det sekundære farveopløsning og vaskes fire gange med 40 pi PBS per brønd (efterlade et slutvolumen på 40 ul i hver brønd og forsegle plade).
  21. Pladen kan afbildes med det samme eller kan opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys (dække med aluminiumfolie) til efterfølgende analyse.

4.. Billede indsamling og analyse

  1. Anskaf billeder i tre forskellige kanaler (350 nm 546 nm og 647 nm) ved hjælp af en 10X objektiv monteret på et automatiseret mikroskop (erhverve efter præference 9 billeder pr godt).
  2. Kan måles ved hjælp af image inlc signalanalyse software som CellProfiler der tillader automatiseret segmentering af kerner og celle organer ved hjælp af DAPI og phalloidin farvning, hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorescerende mærkning af cytoplasmatisk inlc giver en robust udlæsning for celle infektion med L. monocytogenes, som illustreret i Figur 1: den centrale celle i mikrografiet er stærkt inficeret med stammen P14.PrfA * 23, som det kan observeres i fasekontrast billede (pilespidser, figur 1A), og det bekræftes af DAPI signal, hvor enkelte bakterier kan klart skelnes (figur 1B). Den inlc farvning (overlejret til DAPI farvning i figur 1C) viser, hvordan denne secerneret protein tæt akkumuleres i cytosolen af ​​inficerede celler og tillader en utvetydig påvisning af den inficerede værtscelle morfologi. Farvning af aktincytoskelet med fluorescerende phalloidin (figur 1D) indeholder oplysninger om morfologi komplet podede cellulære monolag og videre illustrerer, hvordan nabolandet ikke-inficerede celler (cellekerner markeret med en stjerne) do ikke vise nogen inlc mærkning. Det er værd at nævne, at da inlc cytosole niveauer er afhængige af antallet af cytoplasmatiske bakterier, har vi bemærket en sammenhæng mellem inlc signal detekteres af immunfluorescens og antallet af L. monocytogenes pr celle: som observeret i figur 1, omkringliggende celler inficeret med lave kimtal tal viser en reduceret inlc farvning, som kan kvantificeres. Interessant er det også muligt at overholde inlc nemt detekteres i fremspringene dannet af bakterier fanget i proces ved celle-til-celle-spredning (figur 1C), som også observeret med actin-farvning (figur 1D). Notatet er bakterierne ikke direkte farves i vores protokol, men da der ikke er brugt 488 nm kanal, L. monocytogenes kan mærkes ved hjælp af en specifik anti-bakteriel serum, ellers kan alternativt anvendes GFP-udtrykkende bakterier.

Brug imaging analyseværktøjer såsom than offentlige software CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), er det muligt at opdele cellerne og at måle inlc signal i individuelle inficerede celler, som kan anvendes til at estimere en infektion indeks for en specifik eksperimentel betingelse. Som vist i figur 2, at mærkningen af de kerner med DAPI (figur 2A) og aktincytoskelet med phalloidin (Figur 2C) give de oplysninger, der kræves for cellulære segmentering: kernerne bruges som reference-objekter til identifikation af de enkelte celler (figur 2B) og cytoplasma er efterfølgende identificeret ved hjælp af et spread funktion fra kernerne, der tager hensyn til den cytoskeletal signal (Figur 2D). Endelig kan intensiteten af inlc signal kvantificeres for hver identificeret cellulær objekt (figur 2E og 2F) at estimere antallet afinficerede celler ved at fastsætte en tærskel for inlc intensitet, som vi betragter som negative. Infektionen indekset beregnes som antallet af inficerede celler divideret med det samlede antal celler i populationen.

Vores protokol kan kobles til siRNA skærme til at undersøge funktionen af store paneler af målmolekyler i infektion af værtsceller ved L. monocytogenes. Kontrollen er forpligtet til at validere effektiviteten af ​​transfektion: for eksempel, siRNA rettet Kif11 er et almindeligt anvendt kontrol til transfektion, der fører til celledød, og derfor fraværet af celler i slutningen af ​​analysen er en indikation af, at transfektion forløb effektivt. Til specifikt at tage fat på L. monocytogenes invasion proces, siRNA inaktivering af cellulære receptor Met i HeLa celler fører til en større hæmning af bakteriel indrejse i værtsceller og fører til meget lave niveauer af inlc-positive celler i en podet cellulær monolag (figur3A) i forhold til celler behandlet med en kodet siRNA kontrol (figur 3B). Funktionen af ​​kandidat ukendte molekyler kan undersøges med vores analyse ved hjælp af denne kendte celle molekyle som standard.

Figur 1
Figur 1. Påvisning af inlc mærkning i HeLa celler inficeret med L. monocytogenes stamme P14.PrfA *. HeLa CCL2 celler er blevet inficeret som beskrevet i vores protokol, forarbejdet til immunfluorescens og filmede med et 63X mål. (A) Fase kontrast billede, er flere P14.PrfA * bakterier angivet med pilespidser. (B) DAPI farvning (blå), er de samme individuelle bakterier som i (A) mærket med pilespidser. (C) Overlejring af DAPI farvning (blå) ogInlc farvning (rød), er kernerne i inficerede celler mærket med en asterisk. (D) Overlejring af inlc (rød) og actin (grønne) signaler. Bar:. 5 m Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Segmentering analyse af HeLa-celler inficeret med L. monocytogenes stamme EGDe.PrfA *. HeLa CCL2 celler blev inficeret som beskrevet i vores protokol, forarbejdet til immunfluorescens og filmede med et 10X mål. (A) DAPI signal. (B) superposition af DAPI signal (blå), der vises i (A) og actin signal (rød), der vises i (C), der viser opdelingen af kernerne (VIew forstørret indsat). (C) Actin signal. (D) Samme billede som (B), der viser opdelingen af cellerne. (E) inlc signal. (F) Samme billede som (D) med overlejring af inlc farvning (gul). Bar:. 50 mM Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. . Variation af inlc mærkning mellem celler inaktiveret for Met og kontrol celler HeLa CCL2 celler blev indledningsvis reverse-transficeret med en pulje på fire siRNAs rettet værtscellereceptoren opfyldt; 72 timer efter transfektion blev celler inficeret som beskrevet, forarbejdet til immunfluorescens og afbildet ved hjælp af en 10x objektive. (A) Overlejring af DAPI (blå), actin (rød) og inlc (gul) i celler inaktiveret for Met. (B) samme kanaler som i (a), vedrørende celler behandlet med en kodet siRNA kontrol. Bar:. 50 mM Klik her for at se større figur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere parametre er afgørende for den succes, vores inlc-afsløring protokol, herunder brug af sunde cellelinjer viser en tilstrækkelig stor cytoplasma til at tillade en utvetydig påvisning af inlc signal. I analysen præsenterer vi i denne artikel vil vi foreslå at anvende HeLa CCL2 celler, som er særligt velegnet til vores analyse på grund af udvidelse af deres cytosol rum, andre HeLa-kloner, såsom HeLa Kyoto celler vise et mindre cytoplasma, men kan bruges med vores infektion protokol (HeLa Kyoto celler er særligt godt tilpasset til segmentering analyse, da cellerne ikke overlapper med de omkringliggende celler, hvilket ofte er tilfældet for HeLa CCL2 celler). Celler, der udgør en meget lille cytoplasma såsom polymorfonukleære celler eller makrofager kan ikke anbefales til brug i kombination med vores protokol.

En begrænsning af en billeddannende protokol som den, vi præsenterer her er det faktum, at en minimal mængde celler skal infeCTED i en given monolag i kontrolrum betingelser, for at give systemet med nok resolutiv effekt: ellers, hvis nogle celler er inficeret, bliver det vanskeligt at bestemme ændringer i smittespredningen, især når han undersøger funktionen af ​​potentielle molekylære kandidater, der er forventes at reducere infektion. Denne begrænsning er et reelt problem ved anvendelse af HeLa-celler, som udtrykker Met som den eneste overflade receptor for L. monocytogenes protein INLB og er derfor dårligt invaderet af de fleste L. monocytogenes stammer. Et alternativ er at bruge en meget høj infektionsmultiplicitet (MOI> 100), som kan øge antallet af invasive bakterier, men også øger risikoen for celleskade som følge af højere niveauer i celledyrkningsmediet af den bakterielle poredannende toxin listeriolysin O ( LLO), som viser en meget potent cytotoksisk aktivitet. Andet alternativ er anvendelsen af ​​super-invasive stammer såsom EGDe.PrfA * stammen fremlagt i vores protokol, Som tillader brug af en lav MOI (<25) og reducerer mængden af LLO-afhængige cytotoksiske virkninger opnået med et L. monocytogenes super-invasive stamme kan derefter blive valideret ved hjælp af andre mindre virulente bakteriestammer i andre typer af assays (se nedenfor). Et tredje alternativ er at bruge en anden cellelinie, som udtrykker både E-cadherin og Met: Det er tilfældet for cellelinjer, såsom trofoblast-lignende Jeg3 eller BeWo celler eller coloncarcinom LoVo celler, som kan blive invaderet af både Den inla-og INLB-afhængige entry veje, og i disse cellelinjer, højere celle infektion kan nås ved hjælp af L. monocytogenes-stammer, såsom Edge, forældrenes stamme af EGDe.PrfA *. Det bør tages i betragtning, dog kan der redundans funktioner i begge veje føre til kompensation virkninger i en vej, når en effektor er inaktiveret i den anden vej, hvilket gør analyse af resultater vanskelig. Det er også vigtigt at nævne thaT-celler bør ikke være over inficeret for at give systemet med en god dynamikområde tillader detektion af hændelser, der øger infektion: i vores særlige protokol vores MOI fører til en optimal infektion på 30%.

Alternative metoder til at studere invasion af værtsceller ved L. monocytogenes omfatter den klassiske gentamicin invasion assay 26, der er baseret på drabet af ekstracellulære bakterier ved tilsætning af gentamicin til cellekulturmediet efter en indledende periode af bakteriel infektion (svarende til den procedure, præsenteres i den første del af vores infektion protokol) og invasion scores ved at udplade de overlevende intracellulære bakterier på agarplader og tælle antallet af kolonidannende enheder (CFU'er), som vokser på disse plader. Denne fremgangsmåde viser fordelen ved at anvende den mest direkte udlæsning for infektion, som er det nøjagtige antal af invasive bakterier, der er faktisk beskyttet mod gentamicin treatment i det cytoplasmatiske rum af værtsceller, men denne metode viser en enkelt udlæsning for infektion, og når værtscellerne lyseres til at frigive intracellulære CFU'er, er der ikke længere en post for at få oplysninger om den aktuelle status af celler ved slutpunktet af eksperimentet. Vores Protokollen er baseret på en indirekte metode til påvisning af det udskilte inlc protein, men som tidligere nævnt, niveauerne af cytoplasmatisk inlc korrelerer med antallet af cytosolisk L. monocytogenes (figur 1). Desuden iboende karakter af vores mikroskopi Analysen tillader klart at fastlægge den nøjagtige status af cellerne ved afslutningen af infektionen: Vi kan derfor udtrække information vedrørende global cellemorfologi, aktincytoskelet distribution, cellecyklus fase, etc. og udføre højt indhold analyse af infektionen. Et vigtigt element, der kan udvindes fra denne type analyse er befolkningens kontekst og dens indflydelse på infektion: Ja, seneste arbejde fra Pelkmans og kolleger 27 viste, at det bestemt befolkningsgruppe forbindelse med en bestemt celle (for eksempel sin position fra periferien inden for en gruppe af celler i en holm) påvirker adskillige cellulære funktioner, herunder endocytose og modtagelighed for virus-infektion. Vores analyse viser derfor potentialet for udvinding af disse oplysninger.

Vores metode er en yderligere fordel: da inlc er en sen udlæsning af infektion på grund af dets sekretion af cytoplasmatiske bakterier, kunne værten signalveje, der påvirker niveauet af inlc ophobning i værtsceller potentielt påvirker ikke kun bakteriel indrejse, men også vakuolær flugt, cytosol spredning og sidst celle-til-celle spredning. Derfor kan vores metode kan anvendes som en primær udlæsning for global infektion og kan kobles til sekundære assays at dissekere den specifikke infektion skridt, der er blevet forstyrret af den primære hit identificeret ved siRNA skærme. Endelig er det vigtigt at nævne, at vores metode kan opskaleres og fuldt automatiseret ved hjælp pladevasker enheder, derfor øge antallet af analyserede prøver på et enkelt eksperiment samtidig mindske niveauet af resultater variation i forhold til forsøg udført manuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskning i P. Cossart laboratorium er støttet af Institut Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), Louis-Jeantet Foundation og Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK er en modtager af et stipendium fra Pasteur-Paris University internationale ph.d. Program / Institut Carnot Maladies Infectieuses. Vi takker Jason Mercer for at optimere den cellulære transfektionsprotokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Tags

Immunology HeLa-celler Listeria monocytogenes grampositive bakterieinfektioner Fluorescens High-Throughput Screening Assays RNA-interferens Listeria monocytogenes Infection mikroskopi lille interfererende RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Imaging inlc Sekretion at undersøge Cellular Infektion med bakteriepatogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter