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Summary
李斯特菌是一种革兰氏阳性细菌病原体常作为细胞内寄生的研究的主要模型。后期成像L.菌的小干扰RNA的屏幕范围内感染阶段允许所需的靶宿主细胞的细菌感染的细胞通路的全球研究。
Abstract
细菌细胞内病原体可以设想作为分子工具来剖析，由于其能力，以精美的操纵和颠覆所必需的宿主靶组织感染细胞功能的细胞信号级联。在这些细菌病原体， 李斯特菌是，已被用来作为一个范例为细胞内寄生的细胞免疫应答的表征一种革兰氏阳性微生物，并且其在分子通路控制细胞骨架和膜运输动力学的发现发挥大的作用。在这篇文章中，我们描述了一个强大的显微镜测定法属晚期细胞感染阶段的检测根据InlC的，分泌的细菌蛋白，其存储在被感染细胞的细胞质中的荧光标记的单核细胞 ，该测定可耦合到自动化的高通量小分子干扰RNA的屏幕，以便为characterize涉及的向上或向下调节感染的细胞信号途径。
Introduction
对革兰氏阳性细菌李斯特菌食源性病原体侵入宿主细胞，破坏其内在液泡和复制的宿主细胞1的细胞质。L。菌易于操纵与在细胞和动物模型中观察到细菌毒力性状的持久性相关的实验室环境（快速增长，对健康人低毒性）（溶血活性，白细胞增多）允许在上世纪60年代初期使用作为一个重要的模型研究细胞内寄生，并建立细胞抗感染2免疫力的理论基础。 20世纪80年代末90年代初，细菌细胞内循环3，以及最重要的细菌毒力的分子特性的解剖因素4-7赞成使用L的菌等作为操纵和螺柱的一个关键分子工具Ÿ的宿主细胞的功能。无毒的李斯特菌属的存在（L.英诺克 ）和毒力（ 单增李斯特菌 ）的物种铺平了道路，比较基因组研究8，与最近设立了完整的L.在一起单核细胞转录组9，增加了我们L的进化的理解菌作为一种人类病原体和感染模型系统研究10。
单增李斯特菌在细菌表面的蛋白质INLA和InlB与宿主细胞受体的E-钙粘蛋白和蛋氨酸，分别为11-12之间的相互作用诱导其内化进入宿主细胞。初始候选为基础的研究导致了α/β连环蛋白-肌动蛋白链路的标识作为磷脂酰肌醇3 -激酶（PI3-K）和INLA入侵通路13的作为InlB-关键效应一个显著成分依赖入侵卡斯卡德14-15。蛋白质组学和功能为基础的检测后允许新颖的骨架元素16和所需的宿主细胞侵袭脂质第二信使17的鉴定。转录研究18和质谱为基础的定量蛋白质组学19最近关于棚主信号通路的激活和免疫反应L.在镇压新的光菌感染。系统生物学的方法基础上，大型成套基因（kinomes，完整的基因组）的小干扰RNA失活（RNA干扰）沉默最近已经开始了全球主机在特定的细胞功能，包括细胞吞噬功能的背景下信号通路分析的新途径和病原体内在20。全基因组siRNA筛选此前已进行调查所需的L的感染细胞级联在果蝇吞噬单核细胞增生 21-22，但还没有在非吞噬细胞来进行这种类型的分析，这代表体内感染的关键目标。
我们已经进行了优化的协议由L.的显微镜检测感染的晚期阶段这适合于上皮细胞内细菌条目的高通量siRNA的研究菌等 。我们的实验需要一个高度侵袭性L的优势菌菌株呈现在PRFA，L的主要转录调节子的点突变菌毒力因子6：这种突变（名为PRFA *）呈现PRFA组成性激活23，并导致入侵的蛋白质INLA和InlB的表达增加，从而有利于在其他不佳感染非吞噬细胞的细菌进入。我们的读出对于感染是基于分泌性细菌蛋白InlC的的细胞质积累的检测：该分子是一个由胞质内L.优先表达一种多效性效应单核细胞增生 9和其参与不仅在细菌细胞至细胞传播24，但它也调节宿主的免疫反应25。 InlC的分泌的胞内细菌的荧光标记不仅可以明确区分感染与非感染的细胞，也代表一个端点的读出，可用于随后解剖感染在其不同的步骤：输入，空泡逃逸，胞浆菌增殖和细胞 - 细胞间传播。这个显微镜为基础的协议可以被耦合到siRNA筛选因此，研究涉及在宿主细胞中的由L.感染细胞途径菌等 。
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Protocol
1。细胞的制备和细菌培养，转染工具和一抗
- 准备一个新鲜的琼脂平板上分离单个L。菌菌落从细菌甘油（50％饱和菌液过夜培养glycerol/50％）保持在-80°C。
- 使用铝框（保持在-80℃），以输送在脑心浸液（BHI）琼脂平板冻结的细菌甘油，条纹细菌。
- 在48小时（或直到单个细菌菌落可被分离）将培养板在37℃。
- 保持这种工作板后，在4℃在1个月（它将被用于接种液体培养物）的最大时间。
- 在我们的协议中，我们使用了L。菌血清型1/2A EGDe.PrfA *应变，但如图1所示 ，L。菌血清型4b的P14.PrfA *应变给出了类似的结果。
- 他拉ATCC CCL2细胞生长在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中在没有抗生素的补充有10％胎牛血清（FBS）。
- 加扰（对照）和抗-Met的siRNA被在黑色384孔显微镜细胞培养板中加载的独立池。
- 稀释160皮摩尔的siRNA在500微升不含RNA酶的水中，加入5微升该溶液以每孔（终浓度：1.6皮摩尔）。
- 保持这种板在-20℃下1年的最长期限。
- 多克隆兔抗InlC的已通过免疫使用InlC的-GST重组蛋白如前面25所描述获得的细菌蛋白。
2。反向的siRNA转染细胞
- 感染前72小时，使至室温含有1.6皮摩尔的siRNA在5微升不含RNA酶的水，每孔一个黑色384孔显微镜细胞培养板。
- 离心板3分钟，在300相对离心力在室温下，以降低的siRNA可能已经沉积在孔的壁上。
- 制备室温下的DMEM补充有0.4％的Lipofectamine RNAiMAX。
- 加25微升DMEM / RNAiMAX转染培养基到每个孔中（将其添加到siRNA的前不孵育转染培养基中时间超过20分钟）。
- 移动板来回以混合的siRNA与转染溶液，然后保持该板1小时，在室温下，以允许的siRNA-脂质体复合物的形成。
- 洗涤HeLa细胞从汇合或亚汇合细胞培养烧瓶一次，用10ml 37℃预热的PBS中。
- 分离HeLa细胞中加入1 ml 37℃预热的胰蛋白酶的细胞培养瓶中，孵育3至5分钟，在37℃下
- 重悬细胞于10毫升37℃预热的DMEM培养液，16％胎牛血清。
- 计数细胞并制备每毫升12000的细胞在DMEM中的细胞悬浮液添加有16％FBS。
- 添加50微升的细胞悬液以每孔中的384孔板中。
- 快速移动板来回分发细胞，让细胞沉淀下来10分钟，室温下。
- 密封该板用封口膜，并保持它为72小时，在湿润的5％CO 2气氛中含有在37℃下
3。细胞感染与染色
- 感染前一天，取L的单菌落从BHI琼脂平板上的单核细胞 ，重悬它在5ml液体BHI培养基的15毫升的聚苯乙烯管中。
- 孵育过夜，在37℃下在甩歌甩屏设备以允许细菌生长。
- 在感染当天，洗将1ml过夜L的通过在台式离心机离心2分钟，10,600 RCF 菌文化。
- 弃去上清液（其中包含分泌毒素李斯特菌O），并重新悬浮于1ml的PBS（repea颗粒吨洗涤步骤3次以上）。
- 读出的细菌的光密度在600nm处，并估计细菌的数量（OD = 1相当于1E9细菌/ ml）。
- 准备充足的L。菌稀释于DMEM补充有1％FBS的：使用高度侵袭性菌株像EGDe.PrfA *，我们建议在30μl的培养基，每孔使用5E4细菌（感染复数被估计为25对2000个细胞）。
- 除去各孔中的细胞培养基（80微升），并通过加入30微升的L的更换单核细胞增生含中。
- 离心板上于200相对离心力为5分钟，在室温下以同步的感染过程。
- 在湿润的5％CO 2气氛中含有在37℃的预热铝块孵育板1小时。
- 取出L。单核细胞的含介质从各孔中，加入30微升预热的DMEM补充有10％FBS和40微克/毫升的庆大霉素杀死细胞外L。菌等 。
- 孵育在5％CO 2气氛中含有在37℃的预热的金属块上4小时。
- 制备PBS中的溶液添加有8％的甲醛（该溶液应新鲜制备，使得甲醛的单体，而不是低聚甲醛的聚合物，被使用）。
- 而不丢弃，细胞培养基，加入30微升PBS补充有8％的甲醛（最终浓度：4％），孵育15分钟，在室温下进行。
- 除去固定液，用80μl的PBS中，每孔洗涤细胞三次（保持细胞在80微升PBS中，每孔的终体积）。
- 准备一个1:250稀释在PBS中的兔抗血清InlC的补充有0.2％皂苷。
- 加10μl的第一抗体溶液以每井后除去PBS中孵育30分钟，在室温下进行。
- 丢弃的主抗体溶液和洗涤4次，每孔40微升PBS。
- 稀释的二抗Alexa Fluor 546 - 偶联的抗兔抗体（1:250），在DAPI溶液（1:1,500）和鬼笔环肽-Dy647（1:150）在PBS中添加了0.2％皂苷。
- 加10微升该二次染色溶液的各孔中，孵育30分钟，在室温下进行。
- 丢弃二次染色溶液中，用每孔40微升PBS洗4次（留下40微升在每个终体积以及与密封板）。
- 该板可以立即进行成像，或者可以被存储在4℃下避光保存（用铝箔覆盖），用于随后的分析。
4。图像采集与分析
- 在使用10X物镜安装在自动显微镜（每获得优先以及9张影像）三种不同的通道（350纳米，546纳米和647纳米）获取图像。
- 该InlC的信号可以用图像来测量分析软件，如CellProfiler，允许使用的DAPI和鬼笔环肽染色，分别细胞核和细胞体的自动分割。
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Representative Results
细胞质InlC的荧光标记由L.提供了一个强大的读出对细胞的感染菌 ，如示于图1：在显微照片的中心的细胞是高度感染菌株P14.PrfA * 23，因为它可以在相位对比图像（箭头， 图1A）中可以观察到，它是由DAPI信号确认其中个别的细菌可以清楚地分辨（ 图1B）。该InlC的染色（叠加到DAPI染色在图1C）示出了如何分泌蛋白密集堆积在受感染细胞的胞质溶胶中，并允许一个明确的检测被感染的宿主细胞的形态。肌动蛋白细胞骨架的荧光鬼笔环肽（ 图1D）的染色提供关于完整的接种细胞单层的形态信息，并进一步示出了非感染如何相邻的细胞（用星号标记的细胞核）DO不显示任何InlC的标签。值得一提的是，由于InlC的胞质水平依赖于细胞质的细菌数量，我们注意到通过免疫荧光和L的数量检测出的InlC的信号之间的相关每个细胞的单核细胞 ：如在图1中观察到的，感染了低细菌数目邻近细胞显示降低的InlC的染色可以量化。有趣的是，也有可能观察到InlC的易于在由细菌捕获在细胞至细胞的传播过程（ 图1C）所观察到也与肌动蛋白染色（ 图1D）所形成的凸部进行检测。值得注意的是，细菌不直接染色在我们的协议，但由于不使用的488nm的信道，L。菌可使用特定的抗细菌血清进行标记，否则，表达GFP的细菌也可以被使用。
利用成像分析工具，如T他公共软件CellProfiler（Broad研究所， www.cellprofiler.org ），能够到段细胞和测量InlC的信号在单个受感染的细胞，它可以用于估计针对特定实验条件下的感染指数。如示于图2中 ，用DAPI对细胞核的标记（ 图2A）和肌动蛋白细胞骨架用鬼笔环肽（ 图2C）提供所需的蜂窝分割的信息：细胞核被用作参考的对象为个体细胞的识别（ 图2B）和细胞质随后确定使用从考虑到细胞骨架信号（ 图2D）的原子核的扩频功能。最后，InlC的信号的强度可以被量化为每个识别的对象的细胞（ 图2E和2F）来估计的数目通过设置一个阈值，我们认为作为负的InlC的强度受感染的细胞。感染指数被计算为被感染的细胞通过细胞的总数在人口划分的数目。
我们的协议可以被耦合到siRNA筛选研究的目标分子的大型面板的在宿主细胞中的由L.感染的功能菌等 。控制是必需的，以验证转染效率：例如，siRNA的靶向KIF11是一种常用的控制进行转染，导致细胞死亡，并且因此不存在细胞在测定结束的迹象表明转染效率地进行。具体处理L。单核细胞浸润的过程中，失活的siRNA蛋氨酸在HeLa细胞中的细胞受体导致细菌进入宿主细胞的一个主要的抑制，并导致InlC的阳性细胞的非常低的水平在接种细胞单层（ 图图3A）相比，与加扰的siRNA对照（ 图3B）处理的细胞。候选未知分子的功能可以使用这种已知的细胞分子作为标准我们的测定法进行研究。
图1。检测感染L. HeLa细胞InlC的标签菌菌株P14.PrfA *。在我们的协议中所述，处理进行免疫荧光，并使用63X物镜成像的HeLa细胞CCL2已经被感染。 （ 一 ）相衬图像，几个P14.PrfA *细菌是由箭头表示。 （二）DAPI染色（蓝色），同一个体的细菌如（A）由箭头标示。在DAPI染色（蓝色）（C）叠加和InlC的染色（红色），未感染细胞的细胞核中由星号标示。该InlC的（红色）（四）叠加和肌动蛋白（绿色）信号。酒吧：5微米点击这里查看大图 。
图2。感染L. HeLa细胞的细分分析菌菌株EGDe.PrfA *。在我们的协议中所述，处理进行免疫荧光，并使用10X物镜成像的HeLa细胞CCL2被感染。 （ 一 ）DAPI信号。 （ 二）DAPI信号（蓝色）的叠加显示在（A）和肌动蛋白信号（红色）显示在（C）显示细胞核的分割（VIEW放大小图）。 （ 三）肌动蛋白的信号。 （D）相同的图像（B）中示出的单元的分割。 （ 五）InlC的信号。 （F）相同的图像（d）与InlC的染色（黄色）的叠加。酒吧：50微米点击这里查看大图 。
图3。 。细胞灭活的Met和对照细胞之间的InlC的标记的变化的HeLa细胞CCL2最初反向转染的4的siRNA靶向蛋氨酸宿主细胞受体池; 72小时转染后，细胞感染如所述，处理用于免疫荧光和使用10倍对象成像香港专业教育学院。 （ 一 ）叠加的DAPI（蓝色）的，肌动蛋白（红色）和InlC的（黄色）在细胞中失活的满足。 （B）相同的途径，在（A）和一个炒的siRNA对照治疗有关的细胞。酒吧：50微米点击这里查看大图 。
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Discussion
几个参数是我们InlC的检测协议的成功，包括使用健康细胞系显示一个足够大的胞质，以允许一个明确的检测InlC的信号是至关重要的。在试验中，我们提出本文中，我们提议使用的HeLa细胞的CCL2的，这是特别适合于我们的测定法由于其细胞内空间的延伸中，其他的HeLa克隆诸如海拉京都细胞显示出更小的细胞质中，但可用于与我们的感染协议（京都的HeLa细胞，特别适合于分割的分析，因为细胞不与邻近的细胞，这常常是对的HeLa细胞的CCL2的情况下重叠）。细胞呈现出非常小的细胞质中，如多形核细胞或巨噬细胞，不建议使用，结合我们的协议。
成像协议作为1，我们提出在这里的一个限制是，细胞的最小量应INFECTED，在控制条件下给定的单分子膜，以便为系统提供足够的resolutive功率：否则，如果一些细胞被感染，它以确定的变化感染率调查潜在的候选分子的功能，特别是当变得困难，这是预期为减少感染。这种限制代表了真正的问题用HeLa细胞，其中明确遇见作为属的唯一表面受体时， 菌蛋白InlB和最L.因此入侵不佳菌菌株。一个替代方案是使用感染的一个非常高的复数（MOI> 100），其可提高浸润性细菌的数量，但是也增加了细胞损伤的风险，由于较高水平的细菌成孔毒素李斯特菌澳细胞培养基（ LLO），其中显示了一个非常有效的细胞毒活性。另一种方法是采用超侵袭性菌株如EGDe.PrfA *菌株在我们提出的协议，它允许使用低的MOI（<25），并降低了LLO-依赖的细胞毒性作用的量;用L.得到的结果菌超侵袭性菌株可以使用其它毒性较弱的细菌菌株在其他类型的测定随后验证（见下文）。第三种方法是使用哪两种表达E-cadherin和会见不同的细胞系：它是细胞系，如滋养般JEG3或BEWO细胞，或结肠癌LoVo细胞，它可以由两个被入侵的情况下该INLA-和InlB依赖性输入通路，在这些细胞系中，细胞感染的比率较高，可以使用L。达到菌菌株如EGDE，EGDe.PrfA的亲本菌株*。应当考虑到，然而，在这两个路径的功能，冗余可导致补偿效应在一个通道时的效应是失活的其他途径，渲染结果的分析困难。同样重要的是要提到THAT细胞不应该过度感染，以便为系统提供良好的动态范围，允许该增加感染事件的检测：在我们的特定协议，我们的教学语言导致了30％的最佳感染率。
替代方法由L.研究入侵宿主细胞的单核细胞增生包括其基于胞菌的细菌感染的初始期间（类似于在我们的感染协议的第一部分中介绍的过程）后的杀伤通过加入庆大霉素的细胞培养基和经典庆大霉素侵袭实验26入侵是得分由电镀幸存的细胞内细菌的琼脂平板计数菌落形成单位数（CFU的）对这些板块的成长。这种方法提出了采用最直接读出的感染，这是细菌侵入的精确数目实际上免受庆大霉素treatme的优势核苷酸在宿主细胞的胞质空间，然而，这种方法提出了对感染的单一读出，一旦宿主细胞裂解以释放胞内的CFUs，不再有关于在终点处小区的实际状态的记录来获取信息实验。我们的协议是基于一种间接的方法，所述分泌InlC的蛋白质的检测，但如前面提到的，细胞质InlC的的水平与细胞内L的数单核细胞 （ 图1）。此外，我们的显微镜测定的内在性质允许在感染的结尾明确建立了细胞的确切状态：因此，我们可以提取关于全球细胞形态学信息，肌动蛋白细胞骨架分布，细胞周期等 ，并进行高含量分析感染。可以从这种类型的分析被提取的一个重要特征是人口方面及对感染的影响：的确，从Pelkmans和同事27最近的工作表明，在给定小区的特定人口的上下文（例如，从在胰岛内的一组单元的周边的位置）会影响多种细胞功能，包括细胞内吞作用和易感性病毒感染。因此，我们的分析提出了对这些信息的提取的潜力。
我们的方法提供了一个额外的优点：因为InlC的是感染，由于其分泌由胞质菌较晚读出，影响InlC的积累在宿主细胞中的水平主信号通路可能影响不仅细菌条目而且液泡逃逸，胞质和增殖最终细胞到细胞传播。因此，我们的方法可以作为一个初级读出全球感染和可耦合到次级测定法剖析已扰动通过siRNA筛选中确定的初级命中的特定感染步骤。 最后，要提一提，我们的方法可以被粗化，充分利用洗板机设备的自动化，因此增加了在单次实验中分析的样品的数量，同时相比，手动进行的实验结果降低变化的程度是很重要的。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
研究体育科萨特实验室是支持的巴斯德研究所，研究所国家德拉桑特等德拉RECHERCHEMédicale，研究所法国国家农艺，ERC高级格兰特（233348），该法新社国立德拉RECHERCHE（批准MIE- SignRupVac），路易 - Jeantet基金会和基金会乐罗克莱斯Mousquetaires酒店。 AK是从巴斯德 - 巴黎大学国际博士课程/学院卡诺弊端Infectieuses奖学金的获得者。我们感谢杰森 - 美世优化细胞转染协议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 237500 | For liquid BHI preparation |
| Bacto Agar | BD | 214010 | Supplement to liquid BHI for BHI agar plates |
| Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Biowest | 51830-500 | |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-100 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397-10ML | |
| Formaldehyde (16%) | EMS | 15710 | Prepare fresh before each experiment |
| Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A-11035 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| Phalloidin Dy647 | Dyomics | 647-33 | |
| siRNA Scramble | Dharmacon | D-001810-10 | |
| siRNA Met | Dharmacon | L-003156-00-0005 | |
| Black 384-well microscopy cell culture plate | Corning | 3985 | |
| AxioObserver Z1 microscope | Zeiss | 431007 9901 | |
| sCMOS camera | Andor | Neo | |
| Metamorph analysis software | Molecular Devices | 4000 | |
| CellProfiler analysis software | Broad Institute | Public software available at http://www.cellprofiler.org/ |
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Tags
免疫学，第79，HeLa细胞，单核细胞增生李斯特氏菌，革兰氏阳性细菌感染，荧光，高通量筛选分析，RNA干扰，单增李斯特菌，感染，显微镜，小干扰RNAErratum
Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014.
Citeable Link.
A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020
to
Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel
The acknowledgments where update from:
Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.
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Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).
