Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ההדמיה InlC הפרשה לחקר זיהום נייד על ידי פתוגן החיידקים Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

חיידקי ליסטריה הוא פתוגן חיידקים גראם חיובי משמש לעתים קרובות כמודל עיקרי לחקר טפילות תאית. הדמיה מאוחר L. חיידקי לשלבי זיהום בהקשר של מסכי RNA התערבות קטנים מאפשר למחקר העולמי של מסלולים הסלולר נדרשים לזיהום חיידקים של תאי מארח יעד.

Abstract

ניתן לתפוס פתוגנים תאיים חיידקים ככלים מולקולריים לנתח מפלי איתות הסלולר בשל יכולתם לתמרן להפליא ולחתור תחת פונקציות תא הנדרשות להדבקת רקמות יעד מארח. בין החיידקים פתוגנים אלה, חיידקי ליסטריה הוא מיקרואורגניזם גראם חיובי ששמש כפרדיגמה לטפילות תאית באפיון של תגובה חיסונית תאית, ואשר מילאו תפקידים מרכזיים בגילוי מסלולים המולקולריים שליטה דינמיקת סחר cytoskeletal וקרום. במאמר זה, אנו מתארים assay Microscopical חזק לצורך זיהוי של שלבים מאוחרים של זיהום סלולארי L. חיידקי המבוססים על תיוג הניאון של InlC, חלבון מופרש חיידקים שמצטבר בציטופלסמה של תאים נגועים; assay זה יכול להיות בשילוב למסכים אוטומטיים תפוקה גבוהה קטנים מפריעים RNA כדי להשחירacterize מסלולי איתות תאיים מעורבים בוויסות מעלה מטה או לזיהום.

Introduction

החיידק גראם החיובי חיידקי ליסטריה הוא פתוגן שמקורן במזון שפולש לתאי מארח, משבש vacuole ההפנמה ומשכפל בציטופלסמה של תאי מארח 1. L. חיידקי הקלות של מניפולציה בהקשר המעבדה (צמיחה מהירה, הרעילות נמוכה לאנשים בריאים) קשור עם ההתמדה של תכונות ארסיות חיידקים שנצפו בדגמים סלולריים ובעלי חיים (פעילות המוליטית, ריבוי תאי דם לבנים) התירו השימוש הראשוני שלה ב1960s כמודל עיקרי ל המחקר של טפילות תאית ולהקמתן של היסודות התיאורטיים של חסינות הסלולר נגד זיהום 2. בסוף 1980s ותחילת 1990, הנתיחה של מחזור החיידקים תאיים 3, כמו גם האפיון המולקולרי של ארסי חיידקי גורמים החשובים ביותר 4-7 העדיף את השימוש של L. חיידקי ככלי מולקולרי מרכזי למניפולציה וגם החתיךy של פונקציות תא מארחות. נוכחותם של לא אלים (innocua ל ') ומינים ארסיים (חיידקי L.) בסוג ליסטריה סללו את הדרך למחקרים גנומית השוואתיים 8 זה, יחד עם ההקמה האחרונה של L. המלא חיידקי transcriptome 9, גדלו ההבנה של האבולוציה שלנו ל ' חיידקי כהפתוגן אנושי וכמערכת מודל לזיהום לומדים 10.

חיידקי L. גורם הפנמתו לתוך תאי מארח על אינטראקציה של חלבוני פני השטח של חיידקי InlA וInlB עם קולטני תא המארח שלהם E-cadherin והמטרופוליטן, בהתאמה 11-12. מחקרים מבוססי מועמד ראשוניים הובילו לזיהוי של הקישור catenins-אקטין α / β כמרכיב משמעותי של מסלול InlA פלישת 13 ושל phosphoinositide 3-קינאז (PI 3-K) כמפעיל קריטי של InlB- casca פלישה תלויהדה 14-15. מבחני proteomic ומבוססי פונקציונליים אפשרו לאחר מכן את זיהוי של גורמי רומן cytoskeletal 16 ושליחים שני שומנים 17 דרושים לפלישת תא מארח. מחקרי תעתיק 18 ופרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית המסה כמותית 19 לאחרונה שופכים אור חדש בנוגע להפעלה של מפלי מארח איתות והדיכוי של מערכת החיסונית במהלך L. חיידקי לזיהום. ביולוגיה של מערכות המבוססת על גישות איון של קבוצות גדולות של גנים (kinomes, הגנום מלא) על ידי RNA התערבות קטן השתקה (siRNA) לאחרונה פתחה אפיקים חדשים לניתוח המארח הגלובלי איתות מפלים בהקשר של תפקודים תאיים ספציפיים, כולל phagocytosis ו הפנמת הפתוגן 20. מסכי siRNA הגנום כבר בוצעו בעבר לחקור מפלים סלולריים הנדרשים לזיהום של L. חיידקי בדרוזופילה phagocytic 21-22, אבל זה סוג של ניתוח לא שבוצע בתאים שאינם phagocytic, המייצגים מטרות קריטיות לזיהום בגוף חי.

יש לנו אופטימיזציה פרוטוקול לזיהוי Microscopical של שלבים מאוחרים של זיהום על ידי ל חיידקי שמתאימים ללימודי siRNA תפוקה גבוהה של כניסת חיידקים בתוך תאי אפיתל. assay שלנו מנצל L. פולשני מאוד חיידקי לזן שמציג מוטציה נקודתית בPrfA, רגולטור תעתיק העיקרי של L. חיידקי ארסי גורמי 6: מוטציה זו (בשם PrfA *) הופכת PrfA פעיל 23 constitutively ומובילה לביטוי מוגבר של חלבוני פלישת InlA וInlB, ולכן העדפת כניסת חיידקים בתאים שאינם phagocytic אחרת גרוע נגועים. קריאת הנתונים שלנו לזיהום מבוסס על זיהוי של הצטברות cytosolic של InlC חלבון החיידקים המופרש: מולקולה זו היאמפעיל pleiotropic שבא לידי ביטוי באופן מועדף על ידי ל 'התוך cytoplasmic חיידקי 9 ובו משתתף לא רק בתא תא אל החיידקים להתפשט 24 אך גם מודולציה תגובות חיסונית מארח 25. ניאון התיוג של הפרשת InlC ידי חיידקים תאיים לא רק מאפשר להבחין נגוע מהתאים שאינם נגועים באופן ברור, אלא גם מייצג readout נקודת סיום שיכול לשמש כדי לנתח לאחר מכן זיהום בשלבים השונים שלה: כניסה, בריחת vacuolar, חיידקי cytosolic ריבוי והתפשטות תא אל התא. פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה זה יכול להיות בשילוב למסכי siRNA לכן ללמוד מסלולי הסלולר מעורבים בזיהום של תאי מארח של ל ' חיידקי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבויות הכנת נייד וחיידקיים, כלים Transfection ונוגדנים ראשוניים

  1. הכן צלחת אגר טרי לבודד ל בודד חיידקי ממושבות חיידקי מניית גליצרול (50% glycerol/50% רוויים תרבות לילה נוזלית חיידקים) המשיכו ב -80 ° C.
    1. שימוש במתלת אלומיניום (שמרה ב -80 מעלות צלזיוס) להובלת מניית גליצרול חיידקים, חיידקי פס קפוא בלב עירוי מוח (BHI) צלחת אגר.
    2. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במהלך 48 שעה (או עד שניתן לבודד מושבות חיידקים בודדים).
    3. שמור על צלחת עבודה זו לאחר מכן על 4 מעלות צלזיוס בזמן מרבי של 1 חודש (זה ישמש לזרע תרבויות נוזליים).
    4. בפרוטוקול שלנו, אנו משתמשים בL. חיידקי סרוטיפ 1/2a EGDe.PrfA * מתח, אבל כפי שמודגם באיור 1, ל ' סרוטיפ חיידקי 4b P14.PrfA * זן נותן תוצאות דומות.
  2. הואתאי CCL2 La ATCC גדלים בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) בהיעדר האנטיביוטיקה.
  3. בריכות עצמאיות של מקושקשת (שליטה) ואנטי Met-siRNAs נטענים בצלחות תרבית התאים במיקרוסקופ 384 גם שחורות.
    1. לדלל 160 pmol של siRNA ב500 μl מים RNase חינם ולהוסיף 5 μl של פתרון זה לכל טוב (ריכוז סופי: 1.6 pmol).
    2. שמור על צלחת זה ב -20 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של השנה 1.
  4. נוגדני ארנב polyclonal נגד חלבון חיידקי InlC התקבלו על ידי חיסון באמצעות חלבון רקומביננטי InlC-GST כפי שתואר לעיל 25.

2. הפוך transfection תא siRNA

  1. 72 שעה לפני הדלקת מביאה לטמפרטורת חדר צלחת תרבית התאים במיקרוסקופ שחורה 384 גם מכילה 1.6 pmol siRNA ב5 μl מים RNase חינם בכל טוב.
  2. צנטריפוגה את הצלחת במשך 3 דקות ב300RCF בטמפרטורת חדר כדי להפיל siRNA שהיה יכול להיות מופקד בקירות של הבארות.
  3. הכן DMEM טמפרטורת חדר בתוספת 0.4% RNAiMAX Lipofectamine.
  4. הוסף 25 μl של מדיום transfection DMEM / RNAiMAX היטב כל אחד (לא דגירה בינונית transfection זמן רב יותר מאשר 20 דקות לפני הוספתו לsiRNA).
  5. הזז את הצלחת קדימה ואחורה כדי לערבב את siRNA עם פתרון transfection, ואז לשמור את הצלחת במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר כדי לאפשר קומפלקסי siRNA-Lipofectamine לטופס.
  6. שטוף תאי הלה מבקבוק ומחוברות או תרבית תאים תת מחוברות אחת עם 10 מיליליטר 37 ° PBS מראש חימם C.
  7. ניתוק תאי הלה על ידי הוספת 1 מיליליטר 37 ° C prewarmed טריפסין לבקבוק תרבית תאי דגירה במשך 3 עד 5 דקות ב37 ° C.
  8. תאי Re-להשעות ב10 מיליליטר 37 ° C prewarmed DMEM FBS בתוספת 16%.
  9. ספירת תאים ולהכין את השעיה תא של 12,000 תאים לכל מיליליטר DMEM בתוספתFBS 16%.
  10. הוסף 50 μl של ההשעיה התא היטב כל אחד בצלחת 384 גם.
  11. הזז את הצלחת במהירות קדימה ואחורה כדי להפיץ את התאים ולתת תאים להתיישב ל10 דקות בטמפרטורת חדר.
  12. חותם את הצלחת עם Parafilm ולשמור אותו ל72 שעות באווירה של 5% CO 2 humidified המכילה ב37 ° C.

3. זיהום סלולארי ומכתים

  1. היום לפני הזיהום, לקחת מושבה אחת של L. חיידקי מהצלחת אגר BHI ו resuspend את זה ב 5 מיליליטר של מדיום BHI נוזל בצינור קלקר 15 מיליליטר.
  2. דגירה הלילה בשעה 37 מעלות צלזיוס במכשיר יתביית על מנת לאפשר להתפתחות חיידקים.
  3. היום של הזיהום, לשטוף 1 מיליליטר של ל 'הלילה חיידקי לתרבות על ידי צנטריפוגה 2 דקות ב 10,600 RCF בצנטריפוגה בטבלה העליונה.
  4. בטל supernatant (המכיל O listeriolysin cytotoxin המופרש) מחדש להשעות גלולה ב 1 מיליליטר של PBS (repeat שלב הכביסה 3 פעמים נוספות).
  5. קרא את הצפיפות האופטית בקטריאלי ב600 ננומטר ולהעריך את מספרם של החיידקים (OD = 1 הוא שווה ערך למ"ל / חיידקי 1E9).
  6. הכן ל נאות חיידקי לדילול DMEM בתוספת 1% FBS: באמצעות זנים פולשני מאוד כמו EGDe.PrfA *, אנו ממליצים על השימוש בחיידקי 5E4 ב30 μl של מדיום בכל טוב (הריבוי של זיהום נאמדת 25 ל2,000 תאים).
  7. הסר את המדיום הסלולרי התרבות בכל טוב (80 μl) ולהחליף אותו על ידי הוספת 30 μl של L. חיידקי המכילים בינוני.
  8. צנטריפוגה את הצלחת ב200 RCF במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי לסנכרן את תהליך ההדבקה.
  9. דגירה את הצלחת לשעה 1 באווירת 5% humidified CO 2 המכילה על 37 מעלות צלזיוס בבלוק אלומיניום prewarmed.
  10. הסר את L. חיידקי המכילים בינוני מכל טוב ולהוסיף 30 μl של DMEM prewarmed תוספת 10% FBS ו40 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין להרוג את L. תאי חיידקי.
  11. דגירה של 4 שעות באווירה של 5% CO 2 המכילה על 37 מעלות צלזיוס בגוש מתכת prewarmed.
  12. הכן פתרון של PBS בתוספת פורמלדהיד 8% (פתרון זה צריך להיות מוכן טרי, כך שמונומרים פורמלדהיד, ולא הפולימרים paraformaldehyde, נמצאים בשימוש).
  13. בלי לזנוח את מדיום תרבית תאים, להוסיף 30 μl של PBS בתוספת פורמלדהיד 8% (ריכוז סופי: 4%) ו דגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר.
  14. הסר את מקבע ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 80 μl של PBS לכל טוב (לשמור על התאים בנפח סופי של μl 80 של PBS לכל טוב).
  15. הכן 1:250 דילול של הסרום אנטי InlC הארנב בPBS בתוספת saponin 0.2%.
  16. הוסף 10 μl של פתרון הנוגדן הראשוני לכל אחד גם לאחר הסרת PBS ו דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  17. מחק את עיקריפתרון נוגדן ולשטוף ארבע פעמים עם 40 μl של PBS לכל טוב.
  18. לדלל את הנוגדנים משני אלקסה פלואוריד 546 בשילוב נגד ארנב (1:250), פתרון DAPI (1:1,500) וphalloidin-Dy647 (1:150) בPBS בתוספת saponin 0.2%.
  19. הוסף 10 μl של פתרון מכתים המשני זו לכל היטב דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
  20. מחק את הפתרון מכתים המשני ולשטוף ארבע פעמים עם 40 μl של PBS לכל טוב (להשאיר נפח סופי של μl 40 בכל טוב ולאטום את הצלחת).
  21. הצלחת יכולה להיות צילמה מייד או יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס המוגנת מפני אור (מכסה ברדיד אלומיניום) לניתוח שלאחר מכן.

4. תמונת רכישה וניתוח

  1. לרכוש תמונות בשלושה ערוצים שונים (350 ננומטר, 546 ננומטר ו647 ננומטר) באמצעות מטרת 10X רכוב על מיקרוסקופ אוטומטי (לרכוש מעדיף 9 תמונות בכל טוב).
  2. אות InlC ניתן למדוד באמצעות תמונהתוכנה כמו CellProfiler המאפשר פילוח אוטומטי של גרעינים וגופי תא באמצעות DAPI ומכתים phalloidin, בהתאמה ניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניאון תיוג של InlC cytoplasmic מספק readout חזק לזיהום תא על ידי ל ' חיידקי, כפי שמודגמים באיור 1: התא המרכזי במיקרוסקופ נגוע מאוד על ידי זן P14.PrfA * 23 כפי שניתן לראות בתמונה בניגוד השלב (ראשי חץ, איור 1 א) והוא אושר על ידי אות DAPI בי חיידקים בודדים ניתן להבחין בבירור (איור 1). מכתים InlC (superposed למכתים DAPI באיור 1C) מתאר כיצד חלבון מופרש זה צפוף מצטבר בcytosol של תאים נגועים ומאפשר זיהוי חד משמעי של המורפולוגיה של תאי מארח הנגוע. הכתמה של שלד התא אקטין עם phalloidin ניאון (איור 1D) מספקת מידע לגבי המורפולוגיה של monolayer הסלולרי המחוסן המלא וממחישה עוד יותר עד כמה שכנות שאינן נגוע בתאים (גרעין תא מסומן בכוכבית) דo לא יציג כל תיוג InlC. ראוי להזכיר כי, מאז רמות cytosolic InlC תלויות במספר חיידקי cytoplasmic, שציינו מתאם בין אות InlC זוהתה על ידי immunofluorescence ומספר ל ' חיידקי לכל תא: כפי שנצפה בתרשים 1, תאי שכנים נגועים במספרי חיידקים נמוכים מציגים מכתים InlC מופחת שניתן לכמת. מעניין, אפשר גם לצפות שInlC הוא זוהה בקלות בבליטות שנוצרו על ידי חיידקים נתפסו בתהליך של התפשטות תא אל התא (איור 1 ג) כפי שנצפה גם עם הכתמים אקטין (1D איור). ראוי לציין, חיידקים אינם מוכתמים ישירות בפרוטוקול שלנו, אבל מאז לא נעשה שימוש בערוץ 488 ננומטר, ל יכול להיות מתויג חיידקי לשימוש בסרום אנטי בקטריאלי ספציפי, אחרת, יכולים לחלופין לשמש חיידקים-GFP-לבטא.

שימוש בכלי ניתוח הדמיה כגון tCellProfiler תוכנה ציבורית שהוא (Broad Institute, www.cellprofiler.org), ניתן לתאי מגזר וכדי למדוד את אות InlC בתאים נגועים בודדים, אשר ניתן להשתמש בם כדי להעריך מדד זיהום לתנאי ניסוי ספציפי. כפי שניתן לראות בתרשים 2, התיוג של הגרעינים עם DAPI (איור 2 א) ושלד התא אקטין עם phalloidin (איור 2C) לספק את המידע הנדרש בפילוח סלולארי: הגרעינים המשמשים כאובייקטי התייחסות לזיהוי של תאים בודדים (איור 2B) וציטופלסמה היא לאחר מכן זוהתה באמצעות פונקצית התפשטות מהגרעינים שלוקח בחשבון את אות cytoskeletal (איור 2 ד). לבסוף, עוצמת אות InlC ניתן לכמת עבור כל אובייקט מזוהה סלולארי (2E דמויות ו2F) כדי להעריך את מספרתאים נגועים על ידי קביעת סף לעוצמת InlC שאנו רואים כשליליים. מדד הזיהום מחושב כמספר תאים הנגועים מחולקים במספר הכולל של תאים באוכלוסייה.

הפרוטוקול שלנו יכול להיות יחד למסכי siRNA לחקור את הפונקציה של לוחות גדולים של מולקולות מטרה בזיהום של תאי מארח של ל ' חיידקי. בקרה נדרשות כדי לאמת את היעילות של transfection: למשל, siRNA Kif11 מיקוד היא שליטה בשימוש נפוץ עבור transfection שמובילה למוות של תאים, ולכן ההיעדרות של תאים בסוף assay היא אינדיקציה לכך שtransfection המשיך ביעילות. כדי לטפל באופן ספציפי ל חיידקי לתהליך פלישה, איון siRNA של הקולטן הסלולרי פגש בתאים הלה מוביל לעיכוב משמעותי של כניסת חיידקים לתאי מארח ומוביל לרמות נמוכות מאוד של תאי InlC החיוביים בmonolayer הסלולרי מחוסן (איור3A) בהשוואה לתאים שטופלו בשליטת siRNA מקושקשת (איור 3 ב). הפונקציה של מולקולות לא ידועות מועמד יכולה להיחקר עם assay שלנו באמצעות מולקולת תא ידוע זה כסטנדרט.

איור 1
איור 1. איתור של תיוג InlC בתאים הלה נגוע בL. חיידקי להתאמץ P14.PrfA *. תאי הלה CCL2 נדבקו כפי שתוארו בפרוטוקול שלנו, מעובד לimmunofluorescence וצלם באמצעות אובייקטיבי 63X. (א) תמונה בניגוד שלב, כמה P14.PrfA * חיידקים מסומנים על ידי ראשי חץ. (ב) מכתים DAPI (כחול), אותו החיידקים בודדים כמו ב() מסומנים על ידי ראשי חץ. סופרפוזיציה (C) של מכתים DAPI (הכחול) ומכתים InlC (אדום), הגרעינים של תאים נגוע מסומנים על ידי כוכבית. סופרפוזיציה (ד ') של InlC (אדום) ויקטין אותות (ירוקים). בר:. 5 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2
איור 2. ניתוח פילוח של תאים הלה נגוע בL. חיידקי להתאמץ EGDe.PrfA *. תאי הלה CCL2 נדבקו כפי שתואר בפרוטוקול שלנו, מעובד לimmunofluorescence וצלם באמצעות מטרת 10X. (א) אות DAPI. (ב) סופרפוזיציה של אות DAPI (הכחול) מוצגת ב() ואות אקטין (אדום) מוצגת ב( ג) מראה את הפילוח של הגרעינים (view מוגדל הבלעה). (ג) אות אקטין. (ד) את תמונה כ( ב ') מראה את הפילוח של התאים. אות InlC (E). תמונה (F) זהה (ד ') עם סופרפוזיציה של מכתים InlC (הצהוב). בר:. 50 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 3
איור 3. . וריאציה של תיוג InlC בין התאים מומת לMet ותאי שליטת תאי הלה CCL2 היו בתחילה הפוך transfected עם בריכה של ארבעה siRNAs מיקוד קולטן התא המארח פגש; 72 שעות לאחר transfection, תאים היו נגועים כפי שתוארו, מעובד לimmunofluorescence ו צילם באמצעות אובייקט 10xive. סופרפוזיציה (א) לDAPI (הכחול), אקטין (אדום) וInlC (צהוב) בתאים מומת להמטרופוליטן. (ב) אותו ערוצים כמו ב( א) בתאים הנוגעים למטופלים עם שליטת siRNA מקושקשת. בר:. 50 מיקרומטר לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר פרמטרים הם קריטיים להצלחתו של פרוטוקול InlC איתור שלנו, כוללים השימוש בשורות תאים בריאים מוצגות ציטופלסמה גדולה מספיק כדי לאפשר זיהוי חד משמעי של אות InlC. ב assay אנו מציגים במאמר זה אנו מציעים את השימוש בתאי הלה CCL2, שהם גם מתאימים במיוחד עבור assay שלנו בעקבות ההארכה של מרחב cytosolic; שיבוטים הלה אחרים כגון תאי הלה קיוטו להציג הציטופלסמה קטנה יותר, אך ניתן להשתמש בם עם פרוטוקול הזיהום שלנו (תאי הלה קיוטו הם במיוחד מותאמים היטב לניתוח פילוח שכן תאים אינם חופפים עם תאי שכנים, שהוא לעתים קרובות במקרה של תאי הלה CCL2). תאי מציגי הציטופלסמה קטנה מאוד, כגון תאי polymorphonuclear או מקרופאגים אינם מומלצים לשימוש בשילוב עם הפרוטוקול שלנו.

הגבלה של פרוטוקול הדמיה כאחד אנו מציגים כאן היא העובדה שכמות מינימאלית של תאים צריכה להיות infected, בשכבה הניתנת בתנאי בקרה, על מנת לספק את המערכת עם כוח resolutive מספיק: אחרת, אם מספר תאים נגועים, הוא הופך להיות קשה להבחין בשינויים בשיעורי זיהום, במיוחד כאשר חוקרים את הפונקציה של מועמדים מולקולריים פוטנציאליים שהם צפוי להפחית את הזיהום. מגבלה זו מהווה בעיה אמיתית בעת שימוש בתאי הלה, שמבטאים פגש כקולט פני השטח רק לL. חיידקי חלבון InlB ולכן הם פלשו בצורה גרועה ביותר על ידי ל ' חיידקי לזנים. חלופה אחת היא להשתמש בריבוי גבוה מאוד של זיהום (משרד הפנים> 100) אשר עשוי להגדיל את מספר החיידקים פולשניים, אלא גם מגביר את הסיכון לניזק לתאים עקב רמות גבוהות יותר במדיום תרבית תאים של החיידקים נקבוביות להרכיב O listeriolysin רעלן ( Llo), המציג את פעילות ציטוטוקסיות חזקה מאוד. חלופה אחרת היא השימוש בזני סופר פולשנית כגון מתח EGDe.PrfA * מוצג בפרוטוקול שלנו, המאפשר שימוש במשרד הפנים נמוכים (<25) ומפחית את כמות ההשפעות רעילות llo תלוי; תוצאות שהושגו עם L. זן סופר פולשנית חיידקי יכול להיות תוקף לאחר מכן באמצעות זני חיידקים אלימים פחות אחרים בסוגים אחרים של מבחני (ראה בהמשך). חלופה שלישית היא להשתמש בשורת תאים שונה המבטאת את שני E-cadherin וMet: זה במקרה של שורות תאים כגון Jeg3 או BeWo תאים כמו trophoblast, או תאי LoVo קרצינומה של המעי הגס, שיכול להיות פלשו על ידי שני InlA ומסלולי כניסת InlB התלויים; בשורות תאים אלה, ניתן להגיע לשיעורים גבוהים יותר של זיהום תא באמצעות L. חיידקי לזנים כגון EGDe, את המתח של ההורים של EGDe.PrfA *. זה צריך להילקח בחשבון, עם זאת, כי יתירות של פונקציות בשני המסלולים יכולה להוביל להשפעות פיצוי במסלול אחד, כאשר מפעיל הוא מובטל במסלול האחר, והופך את הניתוח של תוצאות קשה. כמו כן, חשוב להזכיר thaתאי T לא צריכים להיות נגוע על מנת לספק את המערכת עם טווח דינמי טוב המאפשר זיהוי של אירועים המגבירים את הזיהום: בפרוטוקול המסוים שלנו, משרד הפנים שלנו מובילים לשיעור זיהום אופטימלי של 30%.

שיטות אלטרנטיבית כדי ללמוד את הפלישה של תאי מארח של ל ' חיידקי כוללים assay הקלאסי גנטמיצין פלישת 26 המבוסס על הריגתם של חיידקים תאיים על ידי התוספת של גנטמיצין למדיום תרבית תאים לאחר תקופה ראשונית של זיהום חיידקים (בדומה להליך שהוצג בחלקו הראשון של פרוטוקול הזיהום שלנו) ו פלישה היא הבקיע על ידי ציפוי החיידקים תאיים ששרדו על צלחות אגר וסופרים את מספר יחידות מושבה להרכיב (CFUs) הגדלים על צלחות אלה. שיטה זו מציגה את היתרון של שימוש בקריאת הנתונים הישיר ביותר לזיהום, המהווה את מספרם המדויק של חיידקים פולשניים שהם בעצם מוגנים ממבני ניקוי גנטמיציןNT במרחב cytoplasmic של תאי מארח, עם זאת, שיטה זו מציגה קריאת נתונים יחידה לזיהום וברגע שתאי המארח lysed לשחרר CFUs תאיים, אין עוד שיא כדי להשיג מידע בנוגע למעמד בפועל של תאים בנקודת הסיום של הניסוי. הפרוטוקול שלנו מבוסס על שיטה עקיפה, זיהוי של החלבון המופרש InlC, אבל כאמור, רמות InlC cytoplasmic לתאם עם מספר ל 'cytosolic חיידקי (איור 1). יתר על כן, טבעו המהותי של assay מיקרוסקופיה שלנו מאפשר להקים באופן ברור את מעמדם המדויק של התאים בסוף לזיהום: לכן אנו יכולים לחלץ מידע לגבי מורפולוגיה תאית העולמית, הפצת שלד תא אקטין, שלב מחזור התא, וכו 'ולבצע תכולה גבוהה ניתוח של הזיהום. תכונה אחת חשובה שאפשר להפיק מניתוח מסוג זה היא בהקשר האוכלוסייה והשפעתה על זיהום: אכן, העבודה האחרונה מPelkmans ועמיתים לעבודה 27 הוכיחה כי הקשר אוכלוסייה המסוים של תא נתון (לדוגמא, את עמדתה מהפריפריה בתוך קבוצה של תאים באיון) משפיעה על כמה תפקודים תאיים כולל אנדוציטוזה ורגישות לזיהום בנגיף. assay שלנו מציג אפוא את הפוטנציאל להפקת של מידע זה.

השיטה שלנו מציגה יתרון נוסף: מאז InlC היא קריאת נתונים מאוחרות של זיהום כתוצאה מהפרשתו על ידי חיידקי cytoplasmic, מסלולי מארח איתות המשפיעים על הרמות של הצטברות InlC בתאי מארח, עשויים להשפיע על כניסה לא רק חיידקים, אלא גם בריחת vacuolar, התפשטות cytosolic ו סופו של דבר התא אל תא התפשטות. לפיכך, השיטה שלנו יכולה לשמש כקריאת נתונים עיקריות לזיהום הגלובלי ויכולה להיות יחד למבחנים שני לנתח את צעד הזיהום הספציפי שכבר מוטרד הלהיט העיקרי שזוהה באמצעות מסכי siRNA. לבסוף, חשוב להזכיר כי השיטה שלנו ניתן לשדרג ואוטומטית לחלוטין באמצעות מכשירי מכונת כביסה צלחת, הגדלת לכן מספר הדגימות נותחו בניסוי אחד ובמקביל להקטין את רמת הווריאציה תוצאות בהשוואה לניסויים שבוצעו באופן ידני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgments

מחקר במעבדה פ Cossart נתמך על ידי מכון פסטר, Institut National de la סנטה et de la משוכלל ונדיר Médicale, Institut National de la משוכלל ונדיר Agronomique, ERC Advanced Grant (233,348), Nationale de la משוכלל ונדיר סוכנות הידיעות (גרנט מ.י.- SignRupVac), קרן לואי ז'נטה וFondation Le Roch Les Mousquetaires. AK הוא נמען של מלגה מInfectieuses פסטר בפריז הבינלאומית באוניברסיטה לתואר השלישי תכנית / Institut החוליים קרנו. אנו מודים ג'ייסון מרסר לייעול פרוטוקול transfection הסלולרי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Tags

אימונולוגיה תאי הלה חיידקי ליסטריה הקרינה RNA גיליון 79 זיהומים חיידקיים גראם חיוביים מבחני תפוקה גבוהה הקרנה התערבות RNA חיידקי ליסטריה זיהום מיקרוסקופיה קטן מפריע

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter