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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes è un batterio patogeno Gram positivi frequentemente usato come modello importante per lo studio di parassitismo intracellulare. Imaging tardi L. monocytogenes fasi di infezione nel contesto di schermi piccole interferenti RNA permette per lo studio globale di vie cellulari necessarie per infezione batterica delle cellule ospiti bersaglio.

Abstract

Patogeni intracellulari batteriche possono essere concepite come strumenti molecolari per sezionare cascate di segnalazione cellulare a causa della loro capacità di manipolare squisitamente e sovvertire le funzioni cellulari che sono necessarie per l'infezione dei tessuti bersaglio ospitanti. Tra questi batteri patogeni, Listeria monocytogenes è un microrganismo Gram positivo che è stato usato come paradigma per parassitismo intracellulare nella caratterizzazione delle risposte immunitarie cellulari, e che ha avuto un ruolo strumentale nella scoperta di percorsi molecolari che controllano citoscheletro e membrana dinamiche di traffico. In questo articolo descriviamo un saggio microscopica robusto per l'individuazione di fasi tardive infezione cellulare di L. monocytogenes basano sulla marcatura fluorescente di InlC, una proteina batterica secreto che si accumula nel citoplasma delle cellule infette; questo dosaggio può essere accoppiato ad alto throughput schermi piccoli RNA interferenti automatizzati per charziazioni che caratterizzano vie di segnalazione cellulari coinvolti nella up o down-regulation di infezione.

Introduction

Il batterio Gram positivi Listeria monocytogenes è un patogeno di origine alimentare che invade cellule ospiti, interrompe la sua vacuolo interiorizzazione e replica nel citoplasma delle cellule ospiti 1. L. monocytogenes facilità di manipolazione nel contesto laboratorio (rapida crescita, bassa tossicità per gli individui sani) associato con la persistenza di tratti di virulenza batterica osservati nei modelli cellulari e animali (attività emolitica, leucocitosi) ha permesso l'uso iniziale nel 1960 come un modello importante per lo studio del parassitismo intracellulare e per l'istituzione dei fondamenti teorici della immunità cellulare contro l'infezione 2. Alla fine del 1980 e all'inizio del 1990, la dissezione del ciclo intracellulare batterica 3, nonché la caratterizzazione molecolare dei più importanti fattori di virulenza batterica 4-7 favorito l'uso di L. monocytogenes come strumento molecolare fondamentale per la manipolazione e studY di funzioni della cellula ospite. La presenza di virulenti (L. innocua) e virulenti (L. monocytogenes) specie del genere Listeria aperto la strada a studi di genomica comparativa 8 che, assieme alla recente istituzione del completo L. monocytogenes trascrittoma 9, hanno aumentato la nostra comprensione dell'evoluzione del L. monocytogenes come agente patogeno umano e come sistema modello per l'infezione Studi 10.

L. monocytogenes induce la sua internalizzazione nelle cellule ospiti su interazione delle proteine ​​di superficie batterica dell'INLA e InlB con i loro recettori della cellula ospite E-caderina e Met, rispettivamente, 11-12. Studi basati candidati-iniziali hanno portato all'identificazione del collegamento catenine-actina α / β come componente significativa del percorso inlA-invasione 13 e del phosphoinositide 3-chinasi (PI 3-K) come effettore critica del InlB- dipendente invasione Cascade 14-15. Analisi proteomica e basati funzionale successivamente consentito l'identificazione degli elementi del citoscheletro nuovi 16 e secondi messaggeri lipidici 17 necessari per l'invasione della cellula ospite. Studi trascrizionali 18 e di massa a base di spettrometria di proteomica quantitativa 19 hanno recentemente gettato nuova luce concernente l'attivazione di accoglienza cascate di segnalazione e la repressione delle risposte immunitarie durante L. monocytogenes infezione. La biologia dei sistemi si avvicina basato sulla inattivazione di grandi insiemi di geni (kinomes, genomi completi) da piccoli RNA interferenti (siRNA) silenziamento hanno recentemente aperto nuove strade per l'analisi di accoglienza globale cascate di segnalazione nel contesto di specifiche funzioni cellulari, tra cui la fagocitosi e patogeno interiorizzazione 20. Schermi siRNA genome-wide sono stati precedentemente eseguiti per studiare cascate cellulari necessarie per l'infezione di L. monocytogenes in phagocytic Drosophila 21-22, ma questo tipo di analisi non è stata eseguita in cellule non fagocitarie, che rappresentano bersagli critici per l'infezione in vivo.

Abbiamo ottimizzato un protocollo per la rilevazione microscopica delle ultime fasi di infezione da L. monocytogenes che è adatto per gli studi high-throughput siRNA di entrata batterica all'interno delle cellule epiteliali. La nostra analisi si avvale di una L. altamente invasiva monocytogenes che presenta una mutazione puntiforme nel PrfA, il regolatore trascrizionale maggiore di L. monocytogenes fattori di virulenza 6: questa mutazione (denominata PrfA *) rende PrfA costitutivamente attivo 23 e porta ad un aumento dell'espressione delle proteine ​​invasione dell'INLA e InlB, quindi favorendo l'ingresso di batteri in cellule non fagocitarie altrimenti poco infetti. La nostra lettura di infezione si basa sulla rilevazione dell'accumulo citosolica della proteina secreta batterica InlC: questa molecola èun effettore pleiotropici che si esprime preferenzialmente da intra-citoplasmatica L. monocytogenes 9 e che partecipa non solo nella cella cellula-batterica distribuite 24, ma che modula anche la risposta immunitaria 25. La marcatura fluorescente di InlC secrezione da batteri intracellulari permette non solo di distinguere chiaramente infetto da cellule non infette, ma rappresenta anche una lettura end-point che può essere utilizzato per analizzare successivamente infezione nelle sue diverse fasi: entrata, fuga vacuolare, citosolica batterica proliferazione e diffusione cellula-cellula. Questo protocollo basato microscopia può essere accoppiato a schermi siRNA quindi studiare vie cellulari coinvolti nella infezione di cellule ospiti di L. monocytogenes.

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Protocol

1. Preparazione di cellulare e batteriche culture, Strumenti di trasfezione e primari Anticorpi

  1. Preparare un piatto fresco agar per isolare singoli L. monocytogenes le colonie da uno stock di glicerolo batterica (50% glycerol/50% satura di cultura durante la notte liquida batterica) conservato a -80 ° C.
    1. Utilizzando un rack in alluminio (conservato a -80 ° C) per il trasporto di un congelati glicerolo batteriche archivi, batteri striscia su un Brain Heart Infusion (BHI) piastra di agar.
    2. Incubare la piastra a 37 ° C durante 48 ore (o fino singole colonie batteriche possono essere isolati).
    3. Tenere questo piano di lavoro in seguito a 4 ° C per un tempo massimo di 1 mese (sarà usato per seminare colture liquide).
    4. Nel nostro protocollo, usiamo la L. monocytogenes sierotipo 1/2a EGDe.PrfA * ceppo, ma come illustrato in Figura 1, il L. monocytogenes sierotipo 4b P14.PrfA * ceppo dà risultati simili.
  2. LuiCellule CCL2 La ATCC sono coltivate in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) in assenza di antibiotici.
  3. Piscine indipendenti strapazzate (controllo) e anti-Met siRNA sono caricati in 384 pozzetti piastre di coltura di cellule al microscopio nero.
    1. Diluire 160 pmol di siRNA in 500 ml di acqua RNase-free e aggiungere 5 ml di questa soluzione per pozzetto (concentrazione finale: 1,6 pmol).
    2. Mantenere questo piatto a -20 ° C per un periodo massimo di 1 anno.
  4. Anticorpi policlonali di coniglio contro la proteina batterica InlC ottenuto mediante immunizzazione utilizzando una proteina ricombinante GST-InlC come descritto in precedenza 25.

2. Reverse siRNA Transfection cellulare

  1. 72 ore prima dell'infezione portare a temperatura ambiente a 384 pozzetti piastra di coltura di cellule al microscopio nero contenente 1,6 pmol siRNA in 5 ml di acqua RNase-free in ogni pozzetto.
  2. Centrifugare la piastra per 3 min a 300RCF a temperatura ambiente per abbattere siRNA che avrebbero potuto essere depositato nelle pareti dei pozzetti.
  3. Preparare temperatura ambiente DMEM supplementato con 0,4% Lipofectamine RNAiMAX.
  4. Aggiungere 25 ml di medium trasfezione DMEM / RNAiMAX a ciascun pozzetto (non incubare il mezzo trasfezione più di 20 minuti prima di aggiungere il siRNA).
  5. Spostare la piastra avanti e indietro per mescolare il siRNA con la soluzione di trasfezione, quindi tenere la piastra per 1 ora a temperatura ambiente per consentire complessi siRNA-Lipofectamine per formare.
  6. Lavare le cellule HeLa da un pallone-confluenti o coltura cellulare sub-confluenti una volta con 10 ml 37 ° C preriscaldata PBS.
  7. Staccare cellule HeLa aggiungendo 1 ml 37 ° C preriscaldata tripsina al pallone di coltura cellulare e incubare per 3 a 5 min a 37 ° C.
  8. Risospendere le cellule in 10 ml 37 ° C preriscaldata DMEM supplementato con 16% FBS.
  9. Contare le celle e preparare una sospensione cellulare di 12.000 cellule per ml in DMEM supplementato con16% FBS.
  10. Aggiungere 50 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto nella piastra a 384 pozzetti.
  11. Spostare la piastra rapidamente avanti e indietro per distribuire le cellule e lasciare che le cellule stabilirsi per 10 minuti a temperatura ambiente.
  12. Sigillare la piastra con Parafilm e tenerlo per 72 ore in un umidificata al 5% CO 2 contenente l'atmosfera a 37 ° C.

3. Infezione cellulare e colorazione

  1. Il giorno prima infezione, prendere una singola colonia di L. monocytogenes dalla piastra BHI agar e risospendere in 5 ml di terreno BHI liquido in provette di polistirene 15 ml.
  2. Incubare per una notte a 37 ° C in un dispositivo Shacking per consentire la crescita batterica.
  3. Il giorno di infezione, lavare 1 ml della notte L. monocytogenes cultura mediante centrifugazione 2 min a 10,600 rcf in una centrifuga da tavolo.
  4. Scartare il surnatante (che contiene il secreto citotossina listeriolysin O) e risospendere il pellet in 1 ml di PBS (ripett la fase di lavaggio altre 3 volte).
  5. Leggere la densità ottica a 600 nm batterica e stimare il numero di batteri (OD = 1 corrisponde a 1E9 batteri / ml).
  6. Preparare l'adeguato L. monocytogenes diluizione in DMEM supplementato con 1% FBS: utilizzando ceppi altamente invasive come EGDe.PrfA *, si consiglia l'uso di batteri 5E4 in 30 ml di mezzo per pozzetto (la molteplicità di infezione è stimato al 25 per 2.000 celle).
  7. Rimuovere il terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto (80 microlitri) e sostituirlo con l'aggiunta di 30 ml di L. monocytogenes contenenti medie.
  8. Centrifugare la piastra a 200 rcf per 5 min a temperatura ambiente per sincronizzare il processo di infezione.
  9. Incubare la piastra per 1 ora in un umidificata al 5% CO 2 contenente atmosfera a 37 ° C su un blocco di alluminio preriscaldata.
  10. Rimuovere la L. monocytogenes contenente medio di ogni bene e aggiungere 30 ml di DMEM preriscaldata supplementato con 10% FBS e40 mg / ml di gentamicina per uccidere extracellulare L. monocytogenes.
  11. Incubare per 4 ore in un CO 2-atmosfera contenente 5% a 37 ° C su un blocco di metallo preriscaldato.
  12. Preparare una soluzione di PBS supplementato con 8% di formaldeide (questa soluzione deve essere preparato fresco in modo che i monomeri formaldeide, piuttosto che i polimeri paraformaldeide, vengono utilizzati).
  13. Senza scartare il mezzo di coltura cellulare, aggiungere 30 ml di PBS addizionato con 8% di formaldeide (concentrazione finale: 4%) e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
  14. Rimuovere il fissativo e lavare le cellule tre volte con 80 ml di PBS per pozzetto (mantenere le cellule in un volume finale di 80 ml di PBS per pozzetto).
  15. Preparare una diluizione 1:250 del coniglio anti-InlC siero in PBS completato con 0,2% di saponina.
  16. Aggiungere 10 ml di soluzione di anticorpo primario a ciascun pozzetto dopo aver rimosso il PBS e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
  17. Scartare il primariosoluzione di anticorpi e lavare quattro volte con 40 ml di PBS per pozzetto.
  18. Diluire il Alexa Fluor 546-coupled anticorpo secondario anti-coniglio (1:250), la soluzione DAPI (1:1,500), e falloidina-Dy647 (1:150) in PBS integrato con 0,2% saponina.
  19. Aggiungere 10 ml di questa soluzione colorante secondario in ciascun pozzetto ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  20. Eliminare la soluzione colorante secondario e lavare quattro volte con 40 ml di PBS per pozzetto (lasciare un volume finale di 40 microlitri in ciascun pozzetto e sigillare la piastra).
  21. La piastra può essere ripreso immediatamente o può essere conservato a 4 ° C al riparo dalla luce (coprire con un foglio di alluminio) per successive analisi.

4. Image Acquisition and Analysis

  1. Acquisire immagini in tre diversi canali (350 nm, 546 nm e 647 nm) con un obiettivo 10X montato su un microscopio automatizzato (acquisire preferenzialmente 9 immagini per bene).
  2. Il segnale InlC può essere misurata con immaginesoftware di analisi come CellProfiler che consente la segmentazione automatica di nuclei e corpi cellulari che utilizzano il DAPI e la colorazione falloidina, rispettivamente.

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Representative Results

Marcatura fluorescente di citoplasmatica InlC fornisce una lettura affidabile per l'infezione delle cellule di L. monocytogenes, come illustrato in Figura 1: la cella centrale nella micrografia è altamente infettati dal ceppo P14.PrfA * 23 come si può osservare l'immagine a contrasto di fase (frecce, figura 1A) e viene confermata dal segnale DAPI dove i singoli batteri possono essere chiaramente distinti (Figura 1B). La colorazione InlC (sovrapposta alla colorazione DAPI in Figura 1C), mostra come questa proteina secreta densamente accumula nel citosol delle cellule infette e permette un rilevamento inequivocabile della infetto morfologia della cellula ospite. La colorazione del citoscheletro di actina con falloidina fluorescente (Figura 1D) fornisce informazioni relative alla morfologia del monostrato cellulare inoculata completo e illustra, inoltre, come vicini non-infettate cellule (nuclei delle cellule contrassegnati con l'asterisco) do non visualizzare qualsiasi etichettatura InlC. Vale la pena ricordare che, poiché i livelli citosolici InlC dipendono dal numero di batteri citoplasmatici, abbiamo osservato una correlazione tra il segnale rilevato dal InlC immunofluorescenza e il numero di L. monocytogenes per cella: come osservato nella Figura 1, le cellule vicine infettate con numeri bassi di batteri mostrano una colorazione InlC ridotto che può essere quantificata. Interessante notare che è anche possibile osservare che InlC è facilmente rilevabile nelle sporgenze formate da batteri catturati nel processo di diffusione da cellula a cellula (Figura 1C) come osservato anche con la colorazione actina (Figura 1D). Di nota, i batteri non sono direttamente macchiati nel nostro protocollo ma poiché il canale 488 nm non viene utilizzato, L. monocytogenes può essere siglati con un siero anti-batterica specifica, altrimenti batteri GFP che esprimono alternativa può essere utilizzato.

Utilizzo di strumenti di analisi di imaging come tegli software pubblico CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), è possibile cellule segmento e misurare il segnale InlC nelle cellule infette singoli, che può essere utilizzato per stimare un indice infezione per una condizione sperimentale specifico. Come mostrato in Figura 2, l'etichettatura dei nuclei con DAPI (Figura 2A) e il citoscheletro actina con falloidina (Figura 2C) forniscono le informazioni necessarie per la segmentazione cellulare: i nuclei sono utilizzati come oggetti di riferimento per l'identificazione delle singole cellule (Figura 2B) e il citoplasma viene successivamente identificato utilizzando una funzione spread dai nuclei che tenga conto del segnale del citoscheletro (Figura 2D). Infine, l'intensità del segnale InlC può essere quantificato per ogni oggetto cellulare identificato (figure 2E e 2F) per stimare il numero dicellule infettate impostando una soglia per l'intensità InlC che consideriamo negativo. L'indice di infezione è calcolato come numero di cellule infette diviso per il numero totale di cellule nella popolazione.

Il nostro protocollo può essere accoppiato a schermi siRNA per studiare la funzione di grandi pannelli di molecole bersaglio nella infezione di cellule ospiti di L. monocytogenes. Controlli sono necessari per convalidare l'efficienza di trasfezione: per esempio, il targeting siRNA Kif11 è un controllo comunemente usato per la trasfezione che porta alla morte cellulare, e quindi l'assenza di cellule al termine del dosaggio è un'indicazione che trasfezione proceduto efficiente. Per affrontare in particolare la L. monocytogenes processo di invasione, siRNA inattivazione del recettore cellulare Met in cellule HeLa, presenta un grave inibizione di entrata batterica nelle cellule ospiti e porta a livelli molto bassi di cellule InlC-positivi in un monostrato cellulare inoculata (Figura3A) rispetto alle cellule trattate con un controllo siRNA criptato (Figura 3B). La funzione di candidati sconosciuti molecole può essere analizzata con la nostra analisi utilizzando questa molecola cellulare conosciuto come standard.

Figura 1
Figura 1. Rilevamento di etichettatura InlC in cellule HeLa infettate con L. monocytogenes ceppo P14.PrfA *. cellule HeLa CCL2 sono stati infettati come descritto nel nostro protocollo, trattati per immunofluorescenza e ripreso con un obiettivo 63x. (A) fase di contrasto immagine, diversi P14.PrfA * batteri sono indicati da frecce. (B) colorazione DAPI (blu), gli stessi batteri individuali come in (A) sono contrassegnati da frecce. (C) Sovrapposizione della colorazione DAPI (blu) e laInlC colorazione (rosso), i nuclei delle cellule non infettate sono contrassegnati da un asterisco. (D) Sovrapposizione del InlC (rosso) e actina segnali (verdi). Bar:. 5 micron Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. Analisi di segmentazione delle cellule HeLa infettate con L. monocytogenes ceppo EGDe.PrfA *. cellule HeLa CCL2 sono stati infettati come descritto nel nostro protocollo, trattati per immunofluorescenza e ripreso con un obiettivo 10X. (A) Segnale DAPI. (B) Sovrapposizione del segnale DAPI (blu) indicato in (A) e segnale di actina (rosso) indicato in (C) mostra la segmentazione dei nuclei (view riquadro ingrandito). (C) Segnale di actina. (D) La stessa immagine (B) mostra la segmentazione delle cellule. (E) Segnale InlC. (F) La stessa immagine (D) con sovrapposizione di colorazione InlC (giallo). Bar:. 50 micron Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3
Figura 3. . Variazione della etichettatura InlC tra le cellule inattivate di Met e cellule di controllo cellule HeLa CCL2 sono stati inizialmente reverse-trasfettate con un pool di quattro siRNA rivolti al recettore della cellula ospite Met, 72 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state infettate come descritto, trattati per immunofluorescenza e fotografato utilizzando un oggetto 10xive. (A) Sovrapposizione della DAPI (blu), actina (rosso) e InlC (giallo) in cellule inattivate per Met. (B) stessi canali in (A) in materia di cellule trattate con un controllo siRNA strapazzate. Bar:. 50 micron Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Diversi parametri sono fondamentali per il successo del nostro protocollo InlC rilevamento, compreso l'uso di linee di cellule sane visualizzazione sufficientemente grande citoplasma per consentire una rilevazione univoca del segnale InlC. Nel saggio che presentiamo in questo articolo vi proponiamo l'uso di cellule HeLa CCL2, che sono particolarmente adatti per la nostra analisi a causa della estensione del loro spazio citosolico; altri cloni HeLa come le cellule HeLa Kyoto mostrano un citoplasma più piccolo, ma può essere utilizzato con il nostro protocollo di infezione (cellule HeLa Kyoto sono particolarmente adatti per l'analisi di segmentazione poiché le cellule non si sovrappongono con le cellule vicine, che è spesso il caso delle cellule HeLa CCL2). Le cellule che presentano una piccola citoplasma come le cellule polimorfonucleati e macrofagi non sono raccomandati da utilizzare in combinazione con il nostro protocollo.

Una limitazione di un protocollo di imaging come quello che presentiamo qui è il fatto che una quantità minima di celle deve essere infeCTED, in un dato monostrato in condizioni di controllo, al fine di fornire al sistema una potenza sufficiente risolutiva: in caso contrario, se poche cellule sono infettate, diventa difficile determinare variazioni nei tassi di infezione, soprattutto quando indagare la funzione di potenziali candidati molecolari che sono prevede di ridurre l'infezione. Questa limitazione rappresenta un vero problema quando si utilizzano cellule HeLa, che esprimono Met come unico recettore di superficie per la L. monocytogenes proteine ​​InlB e sono quindi poco invase dalla maggior L. monocytogenes ceppi. Una alternativa è quella di utilizzare l'alta molteplicità di infezione (MOI> 100) che possono aumentare il numero di batteri invasivi ma aumenta anche il rischio di danni cellulari dovuti a livelli superiori nel mezzo di coltura cellulare del poro batterica formando tossina listeriolysin O ( LLO), che mostra una attività citotossica molto potente. Un'altra alternativa è l'uso di ceppi super-invasive come il ceppo EGDe.PrfA * presentato nel nostro protocollo, Che consente l'utilizzo di un basso MOI (<25) e riduce la quantità di effetti citotossici LLO-dipendente; risultati ottenuti con L. monocytogenes ceppo super-invasiva può essere successivamente convalidato da altri ceppi batterici virulenti meno in altri tipi di analisi (vedi sotto). Una terza alternativa è quella di utilizzare una linea cellulare che esprime sia diversa E-caderina e Met: è il caso per linee cellulari quali i Jeg3 o Bewo cellule trofoblastiche-simili, nonché le cellule LoVo carcinoma del colon, che può essere invasa da entrambi dell'INLA-e le vie di entrata InlB-dipendenti, in queste linee cellulari, più alti tassi di infezione delle cellule può essere raggiunto utilizzando L. monocytogenes ceppi come EGDE, il ceppo parentale di EGDe.PrfA *. Si deve tener conto, tuttavia, che la ridondanza di funzioni in entrambi i percorsi può portare ad effetti di compensazione in una via quando un effettore è inattivata nell'altro percorso, rendendo l'analisi dei risultati difficile. E 'anche importante ricordare thacellule T non deve essere eccessivamente infetto per fornire al sistema una buona gamma dinamica permette la rilevazione di eventi che aumentano infezione: nel nostro particolare protocollo, il MOI porta ad un grado di infezione ottimale del 30%.

Metodi alternativi per studiare l'invasione delle cellule ospiti di L. monocytogenes includono la classica gentamicina invasione dosaggio 26 che si basa sulla uccisione di batteri extracellulari con l'aggiunta di gentamicina al mezzo di coltura cellulare dopo un periodo iniziale di infezione batterica (simile alla procedura presentata nella prima parte del nostro protocollo infezione) e invasione è ottenuto mediante placcatura sopravvissuti batteri intracellulari su piastre di agar e contando il numero di unità formanti colonie (CFU) che crescono su queste piastre. Questo metodo presenta il vantaggio di utilizzare la lettura più diretta per infezione, che è il numero preciso di batteri invasivi che vengono effettivamente protetto dal Cure gentamicinant nello spazio citoplasmatica delle cellule ospiti, tuttavia, questo metodo presenta una singola lettura di infezione e una volta che le cellule ospiti vengono lisate per rilasciare CFU intracellulari, non c'è più un record di ottenere informazioni sullo stato attuale di cellule nel punto finale dell'esperimento. Il nostro protocollo si basa su un metodo indiretto, la rivelazione della proteina secreta InlC, ma come detto in precedenza, i livelli di citoplasmatica InlC correlata al numero di citosolica L. monocytogenes (Figura 1). Inoltre, la natura intrinseca della nostra analisi microscopia permette di stabilire chiaramente lo stato preciso delle cellule alla fine dell'infezione: pertanto è possibile estrarre informazioni sulla morfologia cellulare globale, distribuzione citoscheletro actina, fase del ciclo cellulare, ecc ed eseguire elevato contenuto analisi dell'infezione. Una caratteristica importante che può essere estratto da questo tipo di analisi è il contesto popolazione e la sua influenza sulla infezione: Infatti, un recente lavoro da Pelkmans e collaboratori 27 ha dimostrato che il particolare contesto popolazione di una data cellula (per esempio, la sua posizione dalla periferia all'interno di un gruppo di cellule in un isolotto) colpisce numerose funzioni cellulari tra cui endocitosi e suscettibilità alle infezioni da virus. La nostra analisi presenta quindi il potenziale per l'estrazione di queste informazioni.

Il nostro metodo presenta un ulteriore vantaggio: poiché InlC è una lettura tardiva di infezione a causa della sua secrezione da batteri citoplasmatici, ospite vie di segnalazione che influenzano i livelli di accumulo InlC nelle cellule ospiti potrebbero potenzialmente influenzare non solo voce batterica, ma anche fuga vacuolar, la proliferazione citosolica e infine cella-a spread cella. Quindi, il metodo può essere usato come un visualizzatore primario per l'infezione globale e può essere accoppiato a saggi secondarie a sezionare la fase specifica infezione che è stato perturbato dal colpo primario identificato attraverso schermi siRNA. Infine, è importante ricordare che il metodo può essere upscaled e completamente automatizzato utilizzando dispositivi lavatore, aumentando quindi il numero di campioni analizzati in un singolo esperimento riducendo il livello di risultati variazione rispetto a esperimenti effettuati manualmente.

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Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca in laboratorio P. Cossart è supportata dall'Istituto Pasteur, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, l'Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), l'Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), la Fondazione Louis-Jeantet e la Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK è un destinatario di una borsa di studio dal Pasteur-Parigi Università internazionali Dottorato / Institut Carnot Maladies infectieuses. Ringraziamo Jason Mercer per ottimizzare il protocollo di trasfezione cellulare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologia Numero 79 cellule HeLa Listeria monocytogenes Gram-positivi infezioni batteriche fluorescenza High Throughput Screening saggi RNA Interference Listeria monocytogenes Infezione microscopia piccoli RNA interferenti

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em
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Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

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