Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imaging INLC Sekre att undersöka Cellular Infektion av bakteriell patogen Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Listeria monocytogenes är en grampositiv bakteriell patogen som ofta används som en viktig modell för studier av intracellulär parasitism. Imaging sent L. monocytogenes infektionsstadier inom ramen för små interfererande RNA-skärmar tillåter den globala undersökning av cellulära vägar som behövs för bakteriell infektion i målgruppvärdceller.

Abstract

Bakteriella intracellulära patogener kan uppfattas som molekylära verktyg för att dissekera cellulära signaleringskaskader på grund av deras förmåga att utsökt manipulera och undergräva cellfunktioner som krävs för infektion av värd målvävnader. Bland dessa bakteriella patogener, är Listeria monocytogenes en grampositiv mikroorganism, som har använts som ett paradigm för intracellulär parasitism i karakteriseringen av cellulära immunsvar, och som har spelat instrument roller i upptäckten av molekylära vägar som kontrollerar cytoskelettala och membran trafficking dynamik. I den här artikeln beskriver vi en robust mikroskopisk analys för detektion av sena cellulär infektionsstadier L. monocytogenes baseras på den fluorescerande märkningen av INLC, ett utsöndrat bakteriellt protein som ackumuleras i cytoplasman hos infekterade celler; denna analys kan kopplas till automatiserade hög genomströmning små störande RNA-skärmar för att förkolnaacterize cellulära signalvägar som är involverade i upp-eller nedreglering av infektion.

Introduction

Den grampositiva bakterien Listeria monocytogenes är en livsmedelsburen patogen som invaderar värdceller, stör dess intemalisering vakuolen och replikerar i cytoplasman i värdceller 1. L. monocytogenes enkel manipulation i laboratoriet sammanhang (snabb tillväxt, låg toxicitet för friska individer) i samband med ihållande bakteriella virulens drag som observerats i cell-och djurmodeller (hemolytisk aktivitet, leukocytos) får den tas i bruk på 1960-talet som en viktig modell för studier av intracellulär parasitism och för upprättandet av de teoretiska grunderna för cellulär immunitet mot infektion 2. I slutet av 1980 och början av 1990, dissektionen av den bakteriella intracellulära cykel 3 samt molekylär karakterisering av de viktigaste bakteriella virulensfaktorer 4-7 gynnade användningen av L. monocytogenes som en viktig molekylär verktyg för manipulering och study av värdcellfunktioner. Förekomsten av avirulenta (L. innocua) och virulenta (L. monocytogenes) arter i Listeria släktet banade väg för jämförande iska studier 8 som, tillsammans med den nyligen inrättade komplett V. monocytogenes transkriptom 9, har ökat vår förståelse av evolutionen av L. monocytogenes som en mänsklig patogen och som ett modellsystem för infektionsstudier 10.

L. monocytogenes inducerar sin interna i värdceller vid interaktion av de bakteriella ytproteiner INLA och INLB med sina värdcellreceptorer E-cadherin och Met, respektive 11-12. Initiala kandidatbaserade studier ledde till identifieringen av α / β catenins-aktin länk som en viktig komponent i INLA-invasionen vägen 13 och fosfoinositid 3-kinas (PI 3-K) som en kritisk effektor av INLB- beroende invasion cascfrån 14 till 15. Proteomik och funktionell-baserade analyser därefter tillåts identifiering av nya cytoskelettala elementen 16 och lipid andra budbärare 17 som erfordras för värdcellinvasion. Transkriptionella studier 18 och masspektrometri-baserad kvantitativa proteomik 19 har nyligen kasta nytt ljus angående aktivering av värdsignaleringskaskader och undertryckande av immunsvar under L. monocytogenes-infektion. Systembiologiska metoder baserade på inaktivering av stora uppsättningar av gener (kinomes, kompletta genom) med små störande RNA (siRNA) ljuddämpning har nyligen öppnat nya vägar för analys av globala värd signaleringskaskader i samband med specifika cellulära funktioner, inklusive fagocytos och patogen interna 20. Genomvid siRNA skärmar har tidigare utförts för att undersöka cellulära kaskader som krävs för infektion av L. monocytogenes i fagocytiska Drosophila 21-22, men denna typ av analys har inte utförts på icke-fagocyterande celler, som utgör viktiga mål för infektion in vivo.

Vi har optimerat ett protokoll för mikroskopisk upptäcka sena stadier av infektion av L. monocytogenes som är anpassade för hög genomströmning siRNA studier av bakteriell inresa inom epitelceller. Vår analys tar fördel av en mycket invasiva L. monocytogenes stam som uppvisar en punktmutation i PrfA, den huvudsakliga transkriptionsregulator av L. monocytogenes virulensfaktorer 6: denna mutation (uppkallad PrfA *) återger PrfA konstitutivt aktiv 23 och leder till ett ökat uttryck av invasionen proteiner INLA och INLB därför gynnar bakteriell inträde i annars dåligt infekterade icke-fagocytiska celler. Vår avläsning för infektion är baserad på upptäckten av den cytosoliska ackumuleringen av det utsöndrade bakteriella proteinet INLC: Denna molekyl ären pleiotropisk effekt uttrycks företrädesvis genom intra-cytoplasmatisk L. monocytogenes 9 och som deltar inte bara i det bakteriella cell-till-cell sprids 24 men som även modulerar värdimmunsvar 25. Den fluorescerande märkning av INLC utsöndring av intracellulära bakterier inte bara gör det möjligt att tydligt skilja infekterade från icke-infekterade celler, men utgör också en slutpunkt avläsning som kan användas för att senare dissekera infektion i dess olika steg: inresa, vakuolär flykt, cytosoliskt bakterie proliferation och cell-till-cell-spridning. Denna mikroskopebaserat protokoll kan kopplas till siRNA skärmar därför att studera cellulära vägar som är involverade i infektion av värdceller av L. monocytogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelser för Cell-och bakteriekulturer, Transfektionsexperiment Verktyg och Primära antikroppar

  1. Bered en färsk agarplatta för att isolera enskilda L. monocytogenes kolonier från en bakterie-glycerollager (50% glycerol/50% mättat bakteriell flytande odling över natten) som hölls vid -80 ° C.
    1. Med hjälp av en aluminiumställ (förvaras vid -80 ° C) för att transportera en frusen bakterie glycerol lager, strimma bakterier på en Brain Heart Infusion (BHI) agarplatta.
    2. Inkubera plattan vid 37 ° C under 48 h (eller tills enskilda kolonier kan isoleras).
    3. Spara denna arbetsplatta efteråt vid 4 ° C under en maximal tid på 1 månad (det kommer att användas till utsäde flytande kulturer).
    4. I våra protokoll använder vi L. monocytogenes serotyp 1/2a EGDe.PrfA *-stam, men som illustreras i figur 1, L. monocytogenes serotyp 4b P14.PrfA * stam ger liknande resultat.
  2. HanLa ATCC CCL2-celler odlas i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) i frånvaro av antibiotika.
  3. Oberoende pooler av äggröra (kontroll) och anti-Met siRNA lastas i svart 384 brunnar mikroskopi cellodlingsplattor.
    1. Späd 160 pmol siRNA i 500 l av RNas-fritt vatten och tillsätt 5 ìl av denna lösning per brunn (slutlig koncentration: 1,6 pmol).
    2. Spara denna platta vid -20 ° C under en tid av 1 år max.
  4. Polyklonala kaninantikroppar mot bakteriella proteinet INLC har erhållits genom immunisering med användning av ett INLC-GST-rekombinant protein, såsom beskrivits tidigare 25.

2. Omvänd siRNA Cell transfektion

  1. 72 h före infektion bringa till rumstemperatur en svart 384-brunnars mikroskopi cellkultur-platta innehållande 1,6 pmol siRNA i 5 ^ il RNas-fritt vatten i varje brunn.
  2. Centrifugera plattan under 3 min vid 300RCF vid rumstemperatur för att få ner siRNA som kunde ha avsatts på väggarna i brunnarna.
  3. Förbered rumstemperatur DMEM kompletterat med 0,4% Lipofectamine RNAiMAX.
  4. Lägg 25 pl av DMEM / RNAiMAX transfektion medium till varje brunn (inte inkubera transfektion mediet är längre än 20 minuter innan du lägger den till siRNA).
  5. Flytta plattan fram och tillbaka för att blanda den siRNA med transfektion lösning, sedan hålla plattan under 1 h vid rumstemperatur för att tillåta siRNA-Lipofectamine komplex bildas.
  6. Tvätta HeLa-celler från en sammanflytande-eller sub-sammanflytande cellkultur kolv en gång med 10 ml 37 ° C förvärmda PBS.
  7. Drag av HeLa-celler genom att tillsätta 1 ml 37 ° C förvärmd trypsin till cellodlingskolv och inkubera under 3-5 min vid 37 ° C.
  8. Åter suspendera cellerna i 10 ml 37 ° C förvärmd DMEM kompletterad med 16% FBS.
  9. Räkna celler och förbereda en cellsuspension på 12.000 celler per ml i DMEM kompletterad med16% FBS.
  10. Tillsätt 50 | il av cellsuspension till varje brunn i 384-brunnsplatta.
  11. Flytta plattan snabbt fram och tillbaka för att fördela celler och låta cellerna slå sig ner under 10 min vid rumstemperatur.
  12. Täta plattan med Parafilm och hålla den under 72 timmar i en fuktig 5% CO 2-innehållande atmosfär vid 37 ° C.

3. Cellulär infektion och färgning

  1. Dagen före infektion, ta en enda koloni av L. monocytogenes från BHI-agarplatta och återsuspendera den i 5 ml av flytande BHI-medium i ett 15 ml polystyrenrör.
  2. Inkubera över natten vid 37 ° C i en shacking anordning för att medge bakterietillväxt.
  3. Dagen av infektionen, tvätta 1 ml av natten L. monocytogenes kultur genom att centrifugera 2 min vid 10.600 RCF på bordscentrifug.
  4. Kasta bort vätskefasen (som innehåller det utsöndrade cellgift listeriolysin O) och slamma pelleten i 1 ml PBS (repeat tvättsteget tre gånger).
  5. Läs den bakteriella optiska densiteten vid 600 nm och uppskatta antalet bakterier (OD = 1 motsvarar 1E9 bakterier / ml).
  6. Förbered tillräckligt L. monocytogenes utspädning i DMEM kompletterad med 1% FBS: med hjälp av mycket invasiva stammar som EGDe.PrfA *, föreslår vi användning av 5E4 bakterier i 30 l av medel per brunn (den mångfald av infektion uppskattas som 25 för 2.000 celler).
  7. Ta bort cellkulturmedium i varje brunn (80 pl) och ersätta den genom att tillsätta 30 ìl av L. monocytogenes-innehållande medium.
  8. Centrifugera plattan vid 200 RCF i 5 minuter vid rumstemperatur för att synkronisera infektionsprocessen.
  9. Inkubera plattan under 1 timme i en fuktad 5% CO 2-innehållande atmosfär vid 37 ° C på en förvärmd aluminiumblock.
  10. Ta av L. monocytogenes innehållande medium från varje brunn och tillsätt 30 | il förvärmd DMEM kompletterat med 10% FBS och40 | ig / ml gentamicin för att döda extracellulära L. monocytogenes.
  11. Inkubera under 4 h i en 5% CO 2-innehållande atmosfär vid 37 ° C på en förvärmd metallblock.
  12. Bered en lösning av PBS kompletterad med 8% formaldehyd (denna lösning ska beredas på nytt så att formaldehyd-monomerer, i stället för de paraformaldehydpolymerer används).
  13. Utan att kasta cellodlingsmediet, tillsätt 30 | il av PBS kompletterat med 8% formaldehyd (slutlig koncentration: 4%) och inkubera under 15 min vid rumstemperatur.
  14. Avlägsna fixativ och tvätta cellerna tre gånger med 80 | il av PBS per brunn (hålla cellerna i en slutlig volym av 80 | il av PBS per brunn).
  15. Bered en 1:250 spädning av kanin anti-INLC serum i PBS kompletterad med 0,2% saponin.
  16. Tillsätt 10 | il av den primära antikroppslösning till varje brunn efter avlägsnande av PBS och inkubera under 30 min vid rumstemperatur.
  17. Kassera den primäraantikroppslösningen och tvätta fyra gånger med 40 | il av PBS per brunn.
  18. Späd sekundär Alexa Fluor 546-kopplade anti-kanin-antikropp (1:250), DAPI-lösning (1:1,500) och falloidin-Dy647 (1:150) i PBS supplementerat med 0,2% saponin.
  19. Tillsätt 10 | il av denna sekundära färglösningen till varje brunn och inkubera under 30 min vid rumstemperatur.
  20. Kassera den sekundära färglösningen och tvätta fyra gånger med 40 | il av PBS per brunn (lämna en slutlig volym av 40 | il i varje brunn och försegla plattan).
  21. Plattan kan avbildas omedelbart eller kan lagras vid 4 ° C i skydd mot ljus (täck med aluminiumfolie) för efterföljande analys.

4. Bild och analys

  1. Förvärva bilder i tre olika kanaler (350 nm, 546 nm och 647 nm) med en 10X objektiv monterat på ett automatiserat mikroskop (förvärva företrädesvis 9 bilder per brunn).
  2. Den INLC Signalen kan mätas med användning av bildenanalysprogram som CellProfiler som möjliggör automatisk segmentering av kärnor och cellkroppar med hjälp av DAPI och phalloidin färgning, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fluorescerande märkning av cytoplasma INLC ger en robust avläsning för cell infektion av L. monocytogenes, såsom illustreras i Figur 1: den centrala cellen i mikrofoto är starkt infekterade av stammen P14.PrfA * 23 som det kan observeras i faskontrastbilden (pilspetsar, Figur 1A) och det bekräftas genom DAPI-signal där enskilda bakterier kan tydligt urskiljas (Figur 1B). Den INLC färgning (lagras till DAPI-färgning i figur 1C) visar hur denna utsöndrat protein ackumuleras tätt i cytosolen av infekterade celler och tillåter en otvetydig detektion av den infekterade värdcellen morfologi. Färgning av aktin cytoskelettet med fluorescerande phalloidin (figur 1D) ger information om morfologin av hela inokulerade cellmonolager och vidare illustrerar hur grann icke-infekterade celler (cellkärnor som är markerade med en asterisk) do inte visa någon INLC märkning. Det är värt att nämna att, eftersom INLC cytosoliska nivåer är beroende av antalet cytoplasma bakterier, har vi noterat en korrelation mellan INLC signalen detekteras med immunofluorescens och antalet L. monocytogenes per cell: som observeras i figur 1, angränsande celler infekterade med låga bakterie siffror visar en reducerad INLC färgning som kan kvantifieras. Intressant nog är det också möjligt att konstatera att INLC lätt upptäcks i utskotten bildas av bakterier som fångas i processen för cell-till-cell spridning (Figur 1C) som observerats även med aktin färgning (figur 1D). Att notera är bakterierna inte direkt färgas i våra protokoll men eftersom 488 nm kanalen inte används, L. monocytogenes kan märkas med användning av en specifik anti-bakteriell serum, annars kan GFP-uttryckande bakterier alternativt användas.

Använda avbildnings analysverktyg såsom than offentligt program CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), är det möjligt att segmentceller och att mäta INLC signalen i enskilda infekterade celler, som kan användas för att uppskatta en infektion index för en viss experimentell tillstånd. Som visas i figur 2, märkning av kärnorna med DAPI (Figur 2A) och aktin cytoskelettet med phalloidin (figur 2C) tillhandahåller den information som krävs för cellulära segmente: kärnorna används som referensobjekt för identifiering av enskilda celler (Figur 2B) och cytoplasman därefter identifieras med hjälp av en spridningsfunktion från kärnorna som tar hänsyn till den cytoskeletal signalen (Figur 2D). Slutligen kan intensiteten av INLC signalen kvantifieras för varje identifierad cellulär objekt (figurerna 2E och 2F) för att uppskatta antaletinfekterade celler genom att sätta en tröskel för INLC intensitet som vi betraktar som negativ. Infektionen index beräknas som antalet infekterade celler dividerat med det totala antalet celler i populationen.

Vår protokoll kan kopplas till siRNA-skärmar för att undersöka funktionen av stora paneler av målmolekyler i infektion av värdceller av L. monocytogenes. Kontrollerna måste validera effektiviteten i transfektion: till exempel, är siRNA riktar Kif11 en vanligt förekommande kontroll för transfektion som leder till celldöd, och därmed frånvaron av celler i slutet av analysen är en indikation på att transfektion fortsatte effektivt. För att specifikt behandla L. monocytogenes invasion process, siRNA inaktivering av den cellulära receptorn Met i HeLa-celler leder till en större hämning av bakteriell inträde i värdceller och leder till mycket låga nivåer av INLC-positiva celler i en ympade cellmonolager (Figur3A) jämfört med celler behandlade med en kodad siRNA kontroll (Figur 3B). Funktionen för kandidat okända molekyler kan undersökas med vår analys med hjälp av denna kända cell molekyl som standard.

Figur 1
Figur 1. Upptäckt av INLC märkning i HeLa-celler infekterade med L. monocytogenes stam P14.PrfA *. HeLa CCL2 celler har smittats enligt beskrivningen i våra protokoll, behandlas för immunofluorescens och avbildas med en 63x mål. (A) Faskontrast bild, finns flera P14.PrfA * bakterier som indikeras av pilar. (B) DAPI färgning (blå), samma enskilda bakterier som i (A) är märkta med pilspetsar. (C) överlagring av DAPI-färgning (blå) och denINLC färgning (röd), är kärnan i oinfekterade celler märkta med en asterisk. (D) Superposition av INLC (röd) och aktin (grön)-signaler. Bar:. 5 um Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Segmentering analys av HeLa-celler infekterade med L. monocytogenes stam EGDe.PrfA *. HeLa CCL2 celler infekterades enligt beskrivningen i våra protokoll, behandlas för immunofluorescens och avbildas med en 10X objektiv. (A) DAPI-signalen. (B) Överlagring av DAPI-signalen (blå) som visas i (A) och aktin-signal (röd) som visas i (C) visar segmentering av kärnorna (view förstorad infällning). (C) Aktin-signal. (D) Samma bild som (B) som visar segmentering av cellerna. (E) INLC signal. (F) Samma bild som (D) med överlagring av INLC färgning (gul). Bar:. 50 pm Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. . Variation av INLC märkning mellan celler inaktiverade för Met och kontrollceller HeLa CCL2 cellerna initialt omvänd-transfekterade med en pool av fyra siRNA riktade mot värdcellreceptorn Met, 72 h efter transfektion infekterades celler såsom beskrivits, bearbetas för immunofluorescens och avbildas med en 10x objektive. (A) Superposition av DAPI (blå), aktin (rött) och INLC (gul) i celler inaktive för Met. (B) samma kanaler som i (A) om celler som behandlats med en kodad siRNA kontroll. Bar:. 50 pm Klicka här för att visa en större bild .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flera parametrar är avgörande för att lyckas med vår INLC-upptäckt-protokollet, inklusive användning av friska cellinjer visar en tillräckligt stor cytoplasma för att möjliggöra en entydig detektion av INLC signalen. I analysen presenterar vi i denna artikel föreslår vi användning av HeLa CCL2 celler, som är särskilt väl lämpade för vår analys på grund av förlängning av deras cytosolic utrymme, andra HeLa-kloner såsom HeLa Kyoto celler visa ett mindre cytoplasman men kan användas med vårt infektionsprotokoll (är HeLa Kyoto celler särskilt väl anpassad för segmentering analys eftersom cellerna inte överlappar med angränsande celler, vilket ofta är fallet för HeLa CCL2 celler). Celler som utgör en mycket liten cytoplasma såsom polymorfonukleära celler eller makrofager rekommenderas inte att använda i kombination med våra protokoll.

En begränsning av en avbildningsprotokoll som den vi presenterar här är det faktum att en minimal mängd av celler bör InfeCTED, i en viss monolager i kontrollförhållanden, för att förse systemet med tillräckligt resolutivt kraft: annars, om några celler är infekterade, blir det svårt att fastställa förändringar smittade, speciellt när man undersöker funktionen av potentiella molekylära kandidater som är förväntas minska infektion. Denna begränsning utgör ett verkligt problem när du använder HeLa-celler, som uttrycker Met som den enda ytan receptorn för L. monocytogenes protein INLB och är därför dåligt invaderas av de flesta L. monocytogenes-stammar. Ett alternativ är att använda en mycket stor mångfald av infektion (MOI> 100) vilket kan öka antalet invasiva bakterier utan också ökar risken för cellskador på grund av högre nivåer i cellkulturmedium av bakterie por bildar toxin listeriolysin O ( LLO), som visar en mycket potent cytotoxisk aktivitet. Andra alternativ är användningen av super-invasiva stammar såsom EGDe.PrfA * stam presenteras i våra protokoll, Vilket tillåter användning av en låg MOI (<25) och minskar mängden LLO beroende cytotoxiska effekter; resultat som erhållits med en L. monocytogenes super-invasiv stammen kan sedan valideras med hjälp av andra mindre virulenta bakteriestammar i andra typer av analyser (se nedan). Ett tredje alternativ är att använda en annan cellinje som uttrycker både E-cadherin och Met: det är fallet med cellinjer, såsom trofoblaster liknande Jeg3 eller BeWo-celler eller de kolonkarcinom LoVo-celler, som kan invaderas av både den INLA-och INLB-beroende inträdesvägar, i dessa cellinjer, högre cellinfektion kan nås med hjälp av L. monocytogenes-stammar såsom EGDE, moderstammen av EGDe.PrfA *. Det bör beaktas, dock kan det redundans funktioner i båda vägar leda till kompensationseffekter på en bana när en effektor inaktiveras i den andra vägen, vilket gör att analysen av resultaten svåra. Det är också viktigt att nämna thaT-celler bör inte vara över-smittade för att förse systemet med ett bra dynamiskt omfång möjliggör detektion av händelser som ökar infektion: i vår särskilda protokoll, leder vår MOI till en optimal infektion på 30%.

Alternativa metoder för att studera invasion av värdceller av L. monocytogenes inkluderar den klassiska gentamicin invasionen analys 26 som bygger på dödandet av extracellulära bakterier genom tillsats av gentamicin till cellodlingsmediet efter en inledande period av bakteriell infektion (liknande det förfarande som anges i den första delen av vår infektionsprotokoll) och invasion görs av plätering de överlevande intracellulära bakterier på agarplattor och räkna antalet kolonibildande enheter (CFU) som växer på dessa plattor. Denna metod har fördelen av att använda den mest direkta avläsning för infektion, vilket är det exakta antalet invasiva bakterier som faktiskt är skyddade från gentamicin treatment i cytoplasma loppet av värdceller, men ger denna metod en enda avläsning för infektion och när värdcellerna lyseras för att frigöra intracellulära CFU, finns det inte längre en post för att få information om den aktuella statusen för celler vid slutpunkten av experimentet. Vår Protokollet är baserat på en indirekt metod, detektering av den utsöndrade INLC protein, men som tidigare nämnts, nivåerna av cytoplasmatisk INLC korrelerar med antalet cytosoliska L. monocytogenes (Figur 1). Dessutom tillåter den inneboende karaktären av vår mikroskopi analys för att tydligt fastställa den exakta statusen av cellerna i slutet av infektionen: Vi kan därför extrahera information om global cellulär morfologi, aktin cytoskelettet fördelning, cellcykelfasen, etc. och utföra högt innehåll Analysen av infektionen. En viktig funktion som kan utvinnas ur denna typ av analys är befolkningen sammanhang och dess påverkan på infektion: Ja, senaste arbete från Pelkmans och medarbetare 27 visade att viss population ramen för en given cell (till exempel sin position från periferin inom en grupp av celler i en holme) berör flera cellulära funktioner inklusive endocytos och mottaglighet för virusinfektion. Vår analys visar således potentialen för utvinning av denna information.

Vår metod är ytterligare en fördel: eftersom INLC är en sen avläsning av infektion på grund av dess utsöndring av cytoplasma bakterier, kan värdsignalvägar som påverkar nivåerna av INLC ackumulation i värdceller potentiellt påverka inte bara bakterie inresa utan också vakuolär flykt, cytosoliska spridning och småningom cell till cell spridning. Sålunda kan vår metod användas som en primär avläsning för global infektion och kan kopplas till sekundära analyser för att dissekera den specifika infektionen steg som har störts av den primära träff identifieras genom siRNA skärmar. Slutligen är det viktigt att nämna att vår metod kan skalas upp och helt automatiserat med hjälp av plåt bricka enheter, ökar därför antalet prover som analyseras i ett enda experiment och samtidigt minska den nivå av resultat variation jämfört med experiment som utförts manuellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Forskning i P. Cossart laboratorium stöds av Pasteurinstitutet, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233.348), Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE- SignRupVac), Louis-Jeantet Foundation och Fondation Le Roch Les Mousquetaires. AK är en mottagare av ett stipendium från Pasteur-Paris University International Doctoral Program / Institut Carnot Maladies Infectieuses. Vi tackar Jason Mercer för att optimera cell transfektion protokollet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Tags

Immunologi HeLa-celler Listeria monocytogenes grampositiva bakteriella infektioner fluorescens high-throughput screening analyser RNA-interferens Listeria monocytogenes Infektion mikroskopi små störande RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Imaging INLC Sekre att undersöka Cellular Infektion av bakteriell patogen<em&gt; Listeria monocytogenes</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter