Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Визуализация InlC секрецию по расследованию сотовой инфекции по бактериальным патогеном Published: September 19, 2013 doi: 10.3791/51043
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 4, 5, 5, 1,2,3, 1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich, 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

ERRATUM NOTICE

Summary

Листерий является грамположительных бактериальных патогенов часто используется в качестве основного модель для изучения внутриклеточного паразитизма. Визуализация поздно Л. моноцитогенес инфекции этапы в контексте малых вмешательства РНК экранов позволяет глобального исследования клеточных путей, необходимых для бактериальной инфекции клеток-хозяев целевых.

Abstract

Бактериальные внутриклеточные патогены можно рассматривать как молекулярных инструментов рассекать клеточные сигнальные каскады из-за их способности изысканно манипулировать и подорвать функции клеток, которые необходимы для заражения принимающих тканях-мишенях. Среди этих бактериальных патогенов, листерий является положительным микроорганизм грамм, который был использован в качестве парадигмы для внутриклеточного паразитизма в характеристике клеточного иммунного ответа, и которая сыграла инструментальные роли в открытии молекулярных путей, контролирующих динамику торговли людьми цитоскелета и мембраны. В этой статье мы опишем надежную микроскопическое анализа для обнаружения конце сотовой инфекции этапах L. моноцитогенес на основе флуоресцентного мечения InlC, секретируемого бактериального белка, который накапливается в цитоплазме инфицированных клеток; этот анализ может быть соединен с автоматизированным высокой пропускной малых интерферирующих РНК экранов, чтобы в угольacterize клеточные сигнальные пути, участвующие в до-или понижающей регуляции инфекции.

Introduction

Грамположительные бактерии листерий является пищевого происхождения возбудитель что поражает клетки-хозяева, нарушает его интернализации вакуоль и реплицируется в цитоплазме клетки-хозяева 1. L. моноцитогенес легкость манипуляции в лаборатории контексте (быстрый рост, низкой токсичностью для здоровых людей), связанных с сохранением бактериальных вирулентности черт, наблюдаемых в клеточных и животных моделях (гемолитическая активность, лейкоцитоз) позволил его первоначальное использование в 1960-х в качестве основного модели изучение внутриклеточной паразитизма и для создания теоретических основ клеточного иммунитета против инфекции 2. В конце 1980-х и начале 1990-х годов, рассечение бактериальной внутриклеточной цикла 3, а также молекулярной характеристике наиболее важных бактериальной факторов вирулентности 4-7 благоприятствовали использованию L. моноцитогенес как ключевой молекулярной инструмент для манипуляций и шпилькиу функций клеток-хозяев. Наличие авирулентного (Л. innocua) и сильнодействующие (L. моноцитогенес) видов в роду Listeria проложили путь для сравнительной геномной исследований 8, что, вместе с недавним созданием полного L. моноцитогенес транскриптома 9, увеличились наше понимание эволюции L. моноцитогенес как человека возбудителя и в качестве модельной системы для инфекции изучает 10.

L. моноцитогенес вызывает ее интернационализации в клетки-хозяева при взаимодействии бактериальных поверхностных белков INLA и InlB с их хозяин клеточных рецепторов E-кадгерина и встретился соответственно 11-12. Первоначальные кандидатов на основе исследования привели к идентификации α / β катенины-актина ссылку в качестве важного компонента INLA-путей инвазии 13 и части фосфоинозитидного 3-киназы (PI 3-К) в качестве важнейшего эффектора InlB- зависит вторжение Cascaде 14-15. Протеомные и функционально-основанные анализы впоследствии позволило идентификация новых цитоскелета элементов 16 и липидных вторичных мессенджеров 17, необходимых для вторжения клетки-хозяина. Транскрипции исследования 18 и масс-спектрометрии на основе количественная протеомика 19 недавно пролить новый свет относительно активации принимающих сигнальных каскадов и репрессий иммунных реакций во время L. моноцитогенес инфекции. Системная биология подходы на основе инактивации больших наборов генов (kinomes, полных геномов) по малых интерферирующих РНК (миРНК) молчание недавно открыли новые возможности для анализа глобальной хозяина сигнальных каскадов в контексте специфических клеточных функций, в том числе фагоцитоза и патоген интернализация 20. Генома экраны миРНК были ранее выполнены, чтобы исследовать клеточные каскады, необходимые для заражения L. моноцитогенес в фагоцитарной дрозофилы 21-22, но этот тип анализа не была выполнена в не-фагоцитов, которые представляют важные цели для инфекции в естественных условиях.

Мы оптимизировали протокол для микроскопического выявления поздних стадиях инфекции L. моноцитогенес, который подходит для высокой пропускной миРНК исследований бактериальной вступления в эпителиальных клетках. Наш анализ использует высоко инвазивной L. моноцитогенес штамм, который представляет точечную мутацию в PrfA, основным регулятором транскрипции Л. моноцитогенес факторов вирулентности 6: эта мутация (названный PrfA *) оказывает PrfA постоянно активный 23 и приводит к повышенной экспрессии вторжения белков INLA и InlB, поэтому в пользу бактериальной запись в противном случае плохо инфицированных не-фагоцитов. Наша считывания для инфекции основано на обнаружении цитозольной накопления секретируемого белка бактериальной InlC: эта молекулаплейотропным эффектор, который выражается преимущественно внутри-цитоплазматической L. моноцитогенес 9 и которые не только участвует в бактериальной клетке клетки к распространяться 24, но которые также модулирует иммунного ответа 25. Флуоресцентный маркировка секреции InlC по внутриклеточных бактерий позволяет не только четко различать зараженными от неинфицированных клеток, но также представляет собой конечной точки считывания, который можно использовать в последующем рассекать инфекции в его различных этапов: вход, вакуолярной бежать, цитозольного бактериальной распространение и распространение от клетки к клетке. Этот протокол на основе микроскопии может быть соединен с экранами миРНК поэтому для изучения клеточных путей, участвующих в инфекции клеток-хозяев Л. моноцитогенес.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка Cellular и бактериальных культур, трансфекции Инструменты и первичных антител

  1. Подготовьте свежий агар пластины для обособления отдельных L. моноцитогенес колоний от бактериальной глицерина складе (50% glycerol/50% насыщенных бактериальной жидкости ночной культуры) хранится при -80 ° С
    1. Использование алюминиевого стойку (хранится при -80 ° С) для транспортировки замороженной бактериальной глицерин материал, подряд бактерии на Brain Heart Infusion (BHI) агар пластины.
    2. Инкубировать при 37 ° С в течение 48 часов (или до тех пор, отдельные колонии бактерий не может быть выделен).
    3. Держите этот рабочий тарелку после при 4 ° С в течение максимального времени от 1 месяца (он будет использоваться, чтобы отобрать жидких культур).
    4. В нашем протоколе, мы используем L. моноцитогенес серотипа 1/2А EGDe.PrfA * напряжение, но, как показано на рисунке 1, в L. моноцитогенес серотип 4б P14.PrfA * штамм дает аналогичные результаты.
  2. ОнLa ATCC CCL2 клетки выращивают в Дульбекко модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в отсутствие антибиотиков.
  3. Независимые бассейны яичницы (контроль) и анти-Met миРНК загружаются в черных микроскопии клеточных культур пластин 384-а.
    1. Развести 160 пмоль миРНК в 500 мкл РНКазы свободной воды и добавить 5 мкл этого раствора на лунку (конечная концентрация: 1,6 мкмоль).
    2. Держите эту пластину при -20 ° С в течение не более 1 года.
  4. Поликлональные антитела кролика против бактериального белка InlC были получены путем иммунизации с помощью рекомбинантного белка GST-InlC, как описано выше 25.

2. Реверс миРНК трансфекции клеток

  1. 72 часа до заражения довести до комнатной температуры черный 384-луночный микроскопии культуру клеток пластину, содержащую 1,6 пмоль миРНК в 5 мкл РНКазы свободной воды в каждую лунку.
  2. Центрифуга пластину течение 3 мин при 300RCF при комнатной температуре, чтобы сбить миРНК, которые можно было бы храниться в стенах колодцев.
  3. Подготовка температуры в помещении DMEM с добавлением 0,4% липофектамином RNAiMAX.
  4. Добавить 25 мкл трансфекции среде DMEM / RNAiMAX в каждую лунку (не инкубировать трансфекции среду более 20 мин, прежде чем добавить в миРНК).
  5. Перемещение пластину назад и вперед, чтобы смешать с миРНК трансфекции раствором, а затем сохранить пластину в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы позволить миРНК-Липофектамин формировать комплексы.
  6. Вымойте HeLa клетки из сливной-или суб-сливная культивирования клеток колбу раз с 10 мл 37 ° C подогретого PBS.
  7. Снять HeLa клетки путем добавления 1 мл 37 ° C, предварительно нагретую трипсин к клеточной культуры колбу и выдержать в течение от 3 до 5 минут при температуре 37 ° С.
  8. Повторное приостановить клеток в 10 мл 37 ° С предварительно нагретой DMEM с добавлением 16% FBS.
  9. Граф клеток и подготовить клеточную суспензию из 12000 клеток на мл в DMEM, дополненной16% FBS.
  10. Добавить 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку в пластине 384-луночного.
  11. Перемещение пластины быстро туда и обратно, чтобы распределить клетки и пусть клетки располагаются в течение 10 мин при комнатной температуре.
  12. Уплотнение тарелку парафильмом и держать его в течение 72 ч в увлажненной 5% CO 2-атмосфере, содержащей при 37 ° С

3. Сотовый Инфекция и Окрашивание

  1. За день до инфекции, сделайте один колонию L. моноцитогенес от BHI агаром и ресуспендируют его в 5 мл жидкой среды BHI в 15 мл полистирола трубки.
  2. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С в shacking устройства для обеспечения роста бактерий.
  3. На следующий день от инфекции, мыть 1 мл ночной L. моноцитогенес культуры путем центрифугирования 2 мин при 10600 RCF на настольной центрифуге.
  4. Жидкость над осадком сливают (который содержит секретируемый Цитотоксин листериолизин O) и повторно приостанавливать осадок в 1 мл PBS (repeaт стадию промывки 3 более раз).
  5. Read бактериальной оптической плотности при 600 нм и оценить количество бактерий (OD = 1 эквивалентно 1E9 бактерий / мл).
  6. Подготовка адекватной L. моноцитогенес разбавление в DMEM, дополненной 1% FBS: с использованием высоко инвазивных штаммов, как EGDe.PrfA *, мы предлагаем использовать 5E4 бактерий в 30 мкл среды на лунку (множественность инфекции оценивается как 25 на 2000 клеток).
  7. Снимите среду для культивирования клеток в каждой лунке (80 мкл) и заменить его добавлением 30 мкл L. моноцитогенес содержащих среду.
  8. Центрифуга пластины при 200 RCF в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы синхронизировать инфекционного процесса.
  9. Инкубировать в течение 1 часа в увлажненной 5% CO 2-атмосфере, содержащей при 37 ° С на предварительно нагретой алюминиевого блока.
  10. Снимите L. моноцитогенес содержащих среду из каждой лунки и добавить 30 мкл предварительно нагретой DMEM с добавлением 10% FBS и40 мкг / мл гентамицина убить внеклеточный L. моноцитогенес.
  11. Выдержите в течение 4 часов в 5% СО 2-атмосфере, содержащей при 37 ° С на предварительно нагретой металлической блока.
  12. Приготовьте раствор PBS с добавлением 8% формальдегида (это решение следует приготовить свежую, так что формальдегид мономеры, а не Параформальдегид полимеров, используются).
  13. Без отбрасывания клеточную культуральную среду, добавляют 30 мкл ФСБ с добавлением 8% формальдегида (конечная концентрация: 4%) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  14. Извлеките фиксатор и промыть клетки три раза 80 мкл на лунку PBS (держать клеток в конечном объеме 80 мкл на лунку PBS).
  15. Подготовка 1:250 разбавление анти-кроличьей сывороткой InlC в ФБР с добавкой 0,2% сапонина.
  16. Добавить 10 мкл первичного раствора антител в каждую лунку после удаления PBS и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
  17. Откажитесь от первичнойРаствор антител и мыть четыре раза с 40 мкл на лунку PBS.
  18. Развести вторичного Alexa Fluor 546-сочетании анти-кроличье антитело (1:250) раствор DAPI (1:1,500) и фаллоидином-Dy647 (1:150) в ФБР с добавкой 0,2% сапонина.
  19. Добавить 10 мкл этого раствора вторичного окрашивания в каждую лунку и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
  20. Отменить вторичного красящий раствор и промыть четыре раза с 40 мкл на лунку PBS (оставить конечного объема 40 мкл в каждую лунку и запечатать табличку).
  21. Пластина может быть отображены непосредственно или можно хранить при температуре 4 ° С в защищенном от света месте (покрывают алюминиевой фольгой) для последующего анализа.

4. Приобретение изображений и анализ

  1. Получение изображений в трех различных каналов (350 нм, 546 нм и 647 нм) с использованием 10X цели, установленный на автоматизированном микроскопа (предпочтительно приобретать 9 изображений на лунку).
  2. Сигнал InlC можно измерить, используя изображениеАнализ программного обеспечения, как CellProfiler, что позволяет автоматизированное сегментацию ядер и клеточных тел, используя DAPI и окрашивание фаллоидином соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Люминесцентная маркировка цитоплазматической InlC обеспечивает надежную отсчет для инфекции клеток путем L. моноцитогенес, как показано на рисунке 1: центральная ячейка в микрофотографии сильно инфицированы штаммом P14.PrfA * 23, как это можно наблюдать в контраст изображения фазы (стрелки, рис. 1А), и это подтверждается сигнала DAPI где отдельные бактерии могут быть четко отделены (рис. 1b). InlC окрашивание (накладываются на окрашивание DAPI в фиг.1С) изображает, как это секретируемый белок плотно накапливается в цитозоле инфицированных клеток и позволяет однозначное обнаружение зараженного морфологии клеток-хозяев. Окрашивание актинового цитоскелета с флуоресцентным фаллоидином (рис. 1D) содержит информацию о морфологии полной инокулированной клеточной монослое и дополнительно иллюстрирует, как соседний неинфицированных клеток (клеточные ядра, отмеченные звездочкой) Dо, не выводит маркировки InlC. Стоит отметить, что, поскольку InlC цитозольных уровни зависит от количества цитоплазматических бактерий, мы уже отмечали корреляцию между сигналом InlC обнаруженного с помощью иммунофлуоресценции и количества L. моноцитогенес на клетку: как это наблюдается на рисунке 1, соседние клетки, инфицированные микроорганизмами чисел отображения уменьшенную InlC окрашивания, которые могут быть количественно. Интересно, что можно также заметить, что InlC легко обнаружить в выступов, образованных бактерий, попавших в процессе распространения от клетки к клетке (рис. 1в), как наблюдалось также с окрашиванием актина (рис. 1D). Следует отметить, что бактерии не непосредственно окрашивали в нашей протокола но так как 488 нм канал не используется, L. моноцитогенес могут быть помечены с использованием конкретного антибактериальный сыворотку, в противном случае GFP-экспрессирующих бактерии альтернативно могут быть использованы.

Использование анализа изображений инструменты, такие как тон общественного программное обеспечение CellProfiler (Broad Institute, www.cellprofiler.org ), можно сегментировать клеток и измерить сигнал InlC в отдельных инфицированных клеток, который может быть использован для оценки индекса инфекции для конкретного экспериментальных условиях. Как показано на рисунке 2, маркировка ядер с DAPI (рис. 2А) и актин цитоскелета с фаллоидином (рис. 2С) содержит информацию, необходимую для клеточного сегментации: ядра используются в качестве эталонных объектов для идентификации отдельных клеток (рис. 2B) и цитоплазма впоследствии идентифицированы с помощью спред функцию из ядер, которые принимает во внимание цитоскелета сигнал (рис. 2D). Наконец, интенсивность сигнала InlC может быть определена количественно для каждого идентифицированного сотовой объекта (Цифры 2E и 2F), чтобы оценить количествоинфицированные клетки, задавая порог для InlC интенсивностью, что мы рассматриваем как негативный. Индекс инфекция рассчитывается как число инфицированных клеток, деленное на общее число клеток в популяции.

Наш протокол может быть соединен с экранами миРНК исследовать функцию больших панелей молекул-мишеней в инфицирования клеток-хозяев Л. моноцитогенес. Контроль необходим для проверки эффективности трансфекции, например, миРНК ориентации Kif11 является широко используемым управления для трансфекции что приводит к гибели клеток и, следовательно, отсутствие клеток в конце анализа является показателем того, что трансфекция продолжили эффективно. Конкретно для решения L. моноцитогенес процесс вторжения, миРНК инактивация клеточного рецептора встретились в HeLa клеток приводит к значительному подавлении бактериального вступления в клетках-хозяевах и приводит к очень низкие уровни InlC-положительных клеток в инокулированной сотовой монослоя (рис.3А) по сравнению с клетками, обработанными с зашифрованным контроля миРНК (фиг.3В). Функция кандидатов неизвестных молекул могут быть исследованы с нашим методом с использованием этого известного молекулу клетки в качестве стандарта.

Рисунок 1
Рисунок 1. Обнаружение InlC маркировки в HeLa клеток, инфицированных L. моноцитогенес напрягать P14.PrfA *. HeLa CCL2 клетки были инфицированы, как описано в нашем протоколе, обрабатываются для иммунофлуоресценции и отображаемого использованием объектива 63x. (А) Фаза контраст изображения, несколько P14.PrfA * бактерии обозначены стрелками. (В) DAPI окрашивание (синий), те же индивидуальные бактерии как в (А) помечены стрелками. (С) Наложение окрашивания DAPI (синий) иInlC окрашивание (красный), ядра неинфицированных клеток помечены звездочкой. (D) Наложение на InlC (красный) и актин (зеленый) сигналы. Бар:. 5 мкм Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2
Рисунок 2. Сегментация анализ HeLa клеток, инфицированных L. моноцитогенес напрягать EGDe.PrfA *. HeLa CCL2 клетки были инфицированы, как описано в нашем протоколе, обрабатываются для иммунофлуоресценции и отображаемого использованием объектива 10X. (A) DAPI сигнал. (B) Наложение сигнала DAPI (синий) отображается в (а) и актин сигнал (красный) отображается в (C) показывает сегментацию ядер (VIEW увеличены вставку). (C) актина сигнал. (D) То же изображение, как (В) показывает сегментацию клеток. (Е) сигнал InlC. (F) и то же изображение, как (D) с наложением окрашивания InlC (желтый). Бар:. 50 мкм Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. . Изменение маркировки InlC между клетками инактивированных для Met и контрольных клеток HeLa CCL2 клетки изначально обратного трансфецировали луже четырех киРНК, нацеленных на хост-клеточный рецептор Met; 72 часа после трансфекции клетки были инфицированы, как описано, обрабатываются для иммунофлуоресценции и отображаемого использованием 10-кратным объектив. (А) Наложение на DAPI (синий), актин (красный) и InlC (желтый) в клетках инактивированных для Met. (В) и тем же каналам, что и в (А), касающуюся клеток, обработанных с зашифрованным контроля миРНК. Бар:. 50 мкм Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Некоторые параметры имеют решающее значение для успеха нашего протокола InlC обнаружения, в том числе с использованием здоровых клеточных линий, отображающих достаточно большое цитоплазму, чтобы позволить однозначную обнаружение сигнала InlC. В анализе мы представляем в этой статье мы предлагаем использование HeLa CCL2 клеток, которые являются особенно хорошо подходит для нашего анализа в связи с расширением их цитозольным пространства; другие клоны HeLa, такие как HeLa киотских клеток дисплей меньшего цитоплазму, но может использоваться с нашего протокола инфекции (HeLa Киото клетки особенно хорошо приспособлен для сегментации анализа с клетки не пересекаются с соседними клетками, которые зачастую в случае HeLa CCL2 клеток). Клетки, представляющие очень малую цитоплазму например полиморфноядерных клеток или макрофагов не рекомендуется использовать в комбинации с нашего протокола.

Ограничение протокола изображений как тот, который мы представляем здесь является тот факт, что минимальное количество клеток следует инфеКТИД, в данном монослоя в контрольных условиях, чтобы обеспечить систему с достаточным отменительного равно: в противном случае, если несколько клеток инфицированы, становится трудно определить изменения в уровнях инфекции, особенно при исследовании функцию потенциальных молекулярных кандидатов, которые ожидается снижение инфекции. Это ограничение представляет собой реальную проблему при использовании HeLa-клетки, которые выражают Met в качестве единственного рецептора поверхности для L. моноцитогенес белок InlB и поэтому плохо вторглись большей L. моноцитогенес штаммов. Один из вариантов заключается в использовании очень высокой множественности заражения (МВД> 100), которые могут увеличить количество инвазивных бактерий, но также увеличивает риск повреждения клеток за счет более высоких уровнях в среду для культивирования клеток бактериальной порообразующего токсина листериолизин O ( LLO), который отображает очень мощный цитотоксическую активность. Другой альтернативой является использование супер-инвазивных штаммов, таких как EGDe.PrfA * напряжения, представленного в нашем протоколе, Который позволяет использовать низкой MOI (<25) и уменьшает количество LLO зависит от цитотоксических эффектов; результаты, полученные с L. моноцитогенес супер-инвазивной штамм может быть впоследствии подтверждена с помощью других менее вирулентных штаммов бактерий в других типах анализов (см. ниже). Третий вариант заключается в использовании другой клеточной линии, которая выражает как Е-кадгерина и встретился: это случай для клеточных линий, таких как трофобласта, как Jeg3 или BEWO клеток, или карциномы толстой кишки LoVo клеток, которые могут быть вторглись как INLA-и InlB-зависимые пути входа, в этих клеточных линий, более высокие темпы инфицирования клеток может быть достигнуто с помощью L. моноцитогенес штаммы, такие как EGDE, родительского штамма EGDe.PrfA *. Следует учитывать, однако, что избыточность функций в обоих путей может привести к компенсации эффектов в один путь, когда эффекторный инактивируется в другом пути, что делает анализ результатов трудно. Важно также отметить, тхаТ-клетки не должны быть чрезмерно инфицированы, чтобы обеспечить систему с хорошей динамического диапазона, позволяя обнаружение событий, которые увеличивают инфекции: в нашем конкретном протоколе, наша MOI приводит к оптимальным уровнем инфекции на 30%.

Альтернативные методы для изучения вторжение в клетках-хозяевах на L. моноцитогенес включают классическую гентамицина вторжения анализа 26, который основан на убийства внеклеточных бактерий путем добавления гентамицина к клеточной культуральной среде после начального периода бактериальной инфекции (по аналогии с процедурой, представленной в первой части нашей протокола инфекции) и вторжение оценивается путем посева выживших внутриклеточных бактерий на чашках с агаром и подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ), которые растут на этих пластинах. Этот метод имеет преимущество использования самое непосредственное считывание инфекции, что точное число инвазивных бактерий, которые фактически защищена от гентамицина обработки понт в цитоплазматической пространстве клеток-хозяев, однако этот метод не представляет одну считывания для инфекции и как только клетки-хозяева лизируют, чтобы освободить внутриклеточные КОЕ, что больше нет запись для получения информации относительно фактического состояния клеток в конечной точке из эксперимента. Наш протокол основан на косвенным методом, обнаружение секретируемого белка InlC, но как уже упоминалось ранее, уровни цитоплазматического InlC коррелирует с числом цитозольного L. моноцитогенес (рис. 1). Кроме того, внутренняя природа нашей микроскопии анализа позволяет четко определить точное положение клеток в конце инфекции: поэтому можно извлечь информацию о глобальном клеточной морфологии, актина распределение цитоскелета, фазу клеточного цикла, и т.д. и выполняют высокое содержание Анализ инфекции. Одной из важных особенностей, которые могут быть извлечены из этого типа анализа является контекст населения и его влияние на инфекции: Действительно, последние работы от Pelkmans с сотрудниками 27 показали, что особенности контекста население данной ячейки (например, его позиция из периферии в пределах группы клеток в островке) влияет несколько клеточных функций, включая эндоцитоза и восприимчивости к вирусной инфекции. Наш анализ представляет поэтому потенциал для извлечения этой информации.

Наш метод представляет дополнительное преимущество: поскольку InlC является поздним считывание инфекции из-за его секреции цитоплазматических бактерий, принимающие сигнальные пути, влияющие на уровни накопления InlC в клетках-хозяевах потенциально может повлиять не только бактерий запись, но и вакуолярной побег, цитозольную пролиферацию и в конечном счете от клетки к распространению клеток. Таким образом, наш метод может быть использован в качестве первичного считывания для глобального инфекции и может быть соединен с вторичных анализов рассекать конкретный шаг инфекция, которая была возмущенный первичного попадания определены через экраны миРНК. Наконец, важно отметить, что наш метод может быть широких масштабах и полностью автоматизированы с помощью промывания планшетов устройств, увеличивая таким образом количество проанализированных образцов в одном эксперименте в то время как снижение уровня результатов изменения по сравнению с экспериментов, проведенных вручную.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследования в П. Cossart лаборатории поддерживается Институтом Пастера, Национальным институтом де-ла-Здоровье и де ла Recherche Medicale, Национальным институтом де-ла-Recherche агрономических, ERC Advanced Грант (233348), Национальное агентство по де-ла-Recherche (грант MIE- SignRupVac), Луи-Jeantet фонд и Фонд Ле Рош Les Mousquetaires. АК является получателем стипендии от Пастер-Париж университет международных докторской программы / Institut Карно болезней Infectieuses. Мы благодарим Джейсон Мерсер для оптимизации протокола сотовой трансфекции.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Brain Heart Infusion BD 237500 For liquid BHI preparation
Bacto Agar BD 214010 Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Biowest 51830-500
DMEM Invitrogen 61965-026
Lipofectamine RNAiMax Invitrogen 13778-100
Gentamicin Sigma G1397-10ML
Formaldehyde (16%) EMS 15710 Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546 Invitrogen A-11035
DAPI Invitrogen D-1306
Phalloidin Dy647 Dyomics 647-33
siRNA Scramble Dharmacon D-001810-10
siRNA Met Dharmacon L-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plate Corning 3985
AxioObserver Z1 microscope Zeiss 431007 9901
sCMOS camera Andor Neo
Metamorph analysis software Molecular Devices 4000
CellProfiler analysis software Broad Institute Public software available at http://www.cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
  2. Mackaness, G. B. Cellular resistance to infection. Journal of Experimental Medicine. 116, 381-406 (1962).
  3. Tilney, L. G., Portnoy, D. A. Actin filaments and the growth, movement, and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. Journal of Cell Biology. 109, 1597-1608 (1989).
  4. Mengaud, J., Chenevert, J., Geoffroy, C., Gaillard, J. L., Cossart, P. Identification of the structural gene encoding the SH-activated hemolysin of Listeria monocytogenes: listeriolysin O is homologous to streptolysin O and pneumolysin. Infection and Immunity. 55, 3225-3227 (1987).
  5. Gaillard, J. L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E., Cossart, P. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci. Cell. 65, 1127-1141 (1991).
  6. Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J. A., Milon, G., Cossart, P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. Molecular Microbiology. 5, 2273-2283 (1991).
  7. Kocks, C., Gouin, E., Tabouret, M., Berche, P., Ohayon, H., Cossart, P. L. monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein. Cell. 68, 521-52 (1992).
  8. Glaser, P., et al. Comparative genomics of Listeria species. Science. 294, 849-852 (2001).
  9. Toledo-Arana, A., et al. The Listeria transcriptional landscape: from saprophytism to virulence. Nature. 459, 950-956 (2009).
  10. Cossart, P. Illuminating the landscape of host-pathogen interactions with the bacterium Listeria monocytogenes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19484-19491 (1073).
  11. Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R. -M., Cossart, P. E-cadherin is the receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into epithelial cells. Cell. 84, 923-932 (1996).
  12. Shen, Y., Naujokas, M., Park, M., Ireton, K. InIB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase. Cell. 103, 501-510 (2000).
  13. Lecuit, M., Hurme, R., Pizarro-Cerda, J., Ohayon, H., Geiger, B., Cossart, P. A role for alpha-and beta-catenins in bacterial uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97, 10008-10013 (2000).
  14. Ireton, K., et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion. Science. 274, 780-782 (1996).
  15. Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. Journal of Biological Chemistry. 274, 17025-17032 (1999).
  16. Pizarro-Cerdá, J., Jonquières, R., Gouin, E., Vandekerckhove, J., Garin, J., Cossart, P. Distinct protein patterns associated with Listeria monocytogenes InlA- or InlB phagosomes. Cellular Microbiology. 4, 101-115 (2002).
  17. Pizarro-Cerdá, J., Payrastre, B., Wang, Y. -J., Veiga, E., Yin, H. L., Cossart, P. Type II phosphatidylinositol 4-kinases promote Listeria monocytogenes entry into target cells. Cellular Microbiology. 9, 2381-2390 (2007).
  18. Hamon, M. A., et al. Histone modifications induced by a family of bacterial toxins. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 104, 17555-17559 (2007).
  19. Ribet, D., et al. Listeria monocytogenes impairs SUMOylation for efficient infection. Nature. 464, 1192-1195 (2010).
  20. Rämet, M., Manfruelli, P., Pearson, A., Mathey-Prevot, B., Ezekowitz, R. A. Functional genomic analysis of phagocytosis and identification of a Drosophila receptor for E. coli. Nature. 416, 644-648 (2002).
  21. Agaisse, H., Burrack, L. S., Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N., Higgins, D. E. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
  22. Cheng, L. W., Viala, J. P., Stuurman, N., Wiedemann, U., Vale, R. D., Portnoy, D. A. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, 13646-13651 (2005).
  23. Ripio, M. T., Domínguez-Bernal, G., Lara, M., Suárez, M., Vazquez-Boland, J. A. A Gly145Ser substitution in the transcriptional activator PrfA causes constitutive overexpression of virulence factors in Listeria monocytogenes. Journal of Bacteriology. 179, 1533-1540 (1997).
  24. Rajabian, T., et al. The bacterial virulence factor InlC perturbs apical cell junctions and promotes cell-to-cell spread of Listeria. Nature Cell Biology. 11, 1212-1218 (2009).
  25. Gouin, E., et al. The Listeria monocytogenes InlC protein interferes with innate immune responses by targeting the IκB kinase subinit IKKα. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, 17333-17338 (2010).
  26. Pizarro-Cerdá, J., Lecuit, M., Cossart, P. Measuring and analysing invasion of mammalian cells by bacterial pathogens: the Listeria monocytogenes system. Methods in Molecular Microbiology. 31, 161-177 (2002).
  27. Snijder, B., Sacher, R., Rämö, P., Damm, E. M., Liberali, P., Pelkmans, L. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).

Tags

Иммунологии выпуск 79 HeLa клетки листерий грам-положительные Бактериальные инфекции флуоресценции высокопроизводительного скрининга Анализы РНК-интерференция листерий Инфекция микроскопия малых интерферирующих РНК

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 06/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

Визуализация InlC секрецию по расследованию сотовой инфекции по бактериальным патогеном<em&gt; листерий</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kühbacher, A., Gouin, E.,… More

Kühbacher, A., Gouin, E., Mercer, J., Emmenlauer, M., Dehio, C., Cossart, P., Pizarro-Cerdá, J. Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (79), e51043, doi:10.3791/51043 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter