Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Имитация поджелудочной Нейропластичность: Published: April 14, 2014 doi: 10.3791/51049
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

Summary

Нейронов пластичность более широкое признание, но недостаточно понимать особенность желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Здесь, в примере поджелудочной железы человека, приведены в пробирке нейропластичности анализа для изучения нейрональной пластичности в желудочно-кишечном тракте на обоих морфологической и функциональной уровне.

Abstract

Нейропластичность является неотъемлемой особенностью кишечной нервной системы и желудочно-кишечного (GI) иннервации при патологических состояниях. Тем не менее, патофизиологическая роль нейропластичности при расстройствах ЖКТ остается неизвестной. Новые экспериментальные модели, которые позволяют моделирования и модуляцию GI нейропластичностью может включить расширенное оценку вклада нейропластичности в частности GI заболеваний, таких как рак поджелудочной железы (РПЖ) и хронического панкреатита (ХП). Здесь мы приводим протокол для моделирования поджелудочной нейропластичности в условиях в пробирке с использованием новорожденного крысы ганглии задних корешков (DRG) и мышечной оболочки кишечника сплетение нейронов (MP). Эта двойная-нейрон подход не только позволяет осуществлять мониторинг как орган-внутренняя и внешняя-нейропластичности, но и представляет собой ценный инструмент для оценки нейронов и глиальных морфологию и электрофизиологии. Кроме того, она позволяет функциональную модуляцию поставляемых микроокружения содержания для изучения их Impacт на нейропластичности. После создания, настоящее нейропластичность анализ несет потенциал быть применимо к изучению нейропластичности в любой GI органа.

Introduction

Изменения в желудочно-кишечном (GI) нерва морфологии и плотности привлекли внимание гастроэнтерологов и патологоанатомов в течение длительного времени, но их актуальность для патофизиологии GI заболеваний остается неизвестной 1-3. Действительно, несколько весьма распространенных расстройств ЖКТ, такие как гастрит, рефлюкс-эзофагит, колит, дивертикулит, и аппендицита связаны с повышенной плотностью иннервации в воспаленные участки ткани 1. Однако ни подлинной внимание до сих пор не было уделено механизмам и значении нейропластичности в желудочно-кишечном тракте. У морфологически измененные нервы GI отличаются от нормальных нервов GI, то есть нормального состояния кишечной нервной системы, с точки зрения их функции? Каковы последствия измененным содержанием нейропептида / нейромедиатора в пластиковых кишечных нервов? Ли периферийная нейропластичность всегда влечет за собой измененную сигнализации для центральной нервной системы? А где центральные проекции пластиковой EXTRINSIC Г.И. нервные пути? Длинный ряд таких ключевых вопросов может быть легко сгенерирована при взгляде на малочисленность наших знаний о функциональных аспектах GI нейропластичности.

Изучение GI нейропластичностью на функциональном уровне требуется действительные, воспроизводимые и до сих пор легко применимые экспериментальные модели. В эпоху большую популярность и признание генно-инженерных условных мышиных моделях (GECoMM), таких в настройках естественных условиях располагают потенциалом для выяснения ранее неизвестных аспектов GI нейропластичности в реалистической моды 1. Тем не менее, разработка и производство GECoMM остается дорогостоящим, трудоемким и, особенно, отнимает много времени. Кроме того, они требуют априорной выбор цели для условно модулированного в генетически измененной мыши (например, трансгенные суперэкспрессии фактора роста нервов / ФРН в кишечных эпителиальных клеток). Следовательно, для DESIGN успешного GECoMM, исследователи должны некоторые показатели (например, предыдущие экспериментальные данные) из стоящей цели, то есть, что молекула представляет интерес (здесь NGF), по крайней мере можно ожидать оказывать некоторые биологически соответствующие эффекты на ЖКТ нервов.

Такие показатели могут быть легко получены из адекватным в пробирке моделей, в которых выделенные клеточные подтипы от комплексной микроокружении в естественных условиях системы могут быть выборочно совместно культивировали в гетеротипичной образом 4-7. Модуляция молекулярных мишеней в таком гетеротипичной обстановке культуры в среднем технически менее громоздким, быстрее, и, следовательно, может помочь в Префильтрация из достойных целей для проверки в естественных условиях исследования в.

Недавно мы представили в пробирке Нейропластичность анализа, которая была разработана для имитации повышенную нервную плотность и гипертрофию intrapancreatic пеРВЭС в человеческой рака поджелудочной железы (РПЖ) и хронического панкреатита (CP) тканей. Здесь, нейроны, полученные из новорожденных крыс ганглиях задних корешков (DRG) или мышечной оболочки кишечника сплетения (МП) подвергали воздействию тканевых экстрактах из хирургически удаленных РПЖ или CP тканей образцов и по сравнению с теми культивировали в нормальной человеческой поджелудочной железы (NP) тканевых экстрактах 5. Вместо того, чтобы тканевые экстракты, можно также использовать клеточной линии супернатантами изучить влияние отдельных типов клеток на нейропластичности. В сочетании со стандартизированным измерения морфометрического, представлены нейропластичности анализ позволяет действительный и воспроизводимую оценку нейрональной пластичности в ответ на различные поджелудочной микросреды. В частности, она позволяет моделирование 1) морфологической нейропластичности, то есть изменения в аксонов, разветвления рисунка и размеров нейронов, и 2) функциональной нейропластичности, то есть изменения в возбудимости периферических нейронах. Более того, не только периферические (т.е. (например DRG или второй спинной заказ) нейроны могут быть включены в настоящее анализа для оценки их морфологические и функциональные реакции на различным содержанием Г.И. ткани. В настоящем видео-учебник, мы продемонстрировать техническую протокол для выполнения этого анализа и обсуждения свои преимущества и недостатки. Кроме того, мы обращаем внимание на применимости основного понятия этом анализе к изучению нейропластичности в любой GI органа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все экспериментальные животные процедуры в протоколе следуйте рекомендациям по уходу за животными из Технического университета в Мюнхене, Германия.

1. СМИ / Extract Подготовка

  1. Ткань гомогенизации
    Качество ткани гомогенизации имеет решающее значение для последующего обнаружения neuroplastic изменений в культивируемых нейронах. Здесь, рекомендуется гомогенизатор, который позволяет ткани диссоциации без значительного увеличения температуры тканей.
    1. Передача 5 мм х 5 мм х 5 мм кубики ткани поджелудочной железы непосредственно от -80 ° С до жидкого азота и места в твердой фазе в ткани homogenator. Идеальный homogenator бы отделить ткани достаточно быстро, не позволяя ему разморозить.
    2. Сразу после диссоциации, ресуспендируют твердое вещество, порошкообразный гомогената в 300-500 мкл 0,1 × фосфатно-солевом буфере (PBS). Здесь не используют никаких буфер для лизиса (например, RIPA) так как это может лизировать нейронов.
    3. Центрифуга гомогенаты для по крайней мере 15 минут при максимальной скорости вашего скамейке центрифуге (например 21130 мкг). Соберите четкое слой, который представляет выписку ткани.
  2. Клеточной линии надосадочные
    1. Пусть клетки интерес достичь по крайней мере 70 - 80% слияния в нормальной ростовой среды.
    2. Как правило, эти носители содержат компонентов сыворотки и может оказывать неконтролируемые эффекты при роста нейронов. Таким образом, после достижения необходимой плотности клеток, мойте клетки, по крайней мере 3x с класса клеточной культуры PBS и поместить их в среде без сыворотки (SFM) на срок до 48 часов.
      Примечание: Здесь считают, что некоторые клетки (как поджелудочной звездчатых клеток), возможно, потребуется сыворотки в их питательной среды для того, чтобы поддерживать их нормальное состояние и структуру. В таких случаях выполнения последовательных разведений сыворотки в среде клетки интереса для того, чтобы найти самые низкие содержания, что необходимо сыворотки для неповрежденной Functio клетокн.
    3. Измерение концентрации белка в гомогенате ткани или клеточных супернатантах с помощью белкового анализа Брэдфорда. В то время как эти показатели меняются в зависимости от ткани и клеток типа, экстрактов ткани поджелудочной железы, можно было бы ожидать диапазона концентраций между 5-12 мкг / мкл, а для линии клеток супернатантов между 3-8 мкг / мкл.

2. Алиготе Экстракты и Сотовые Супернатанты

В зависимости от концентрации, которые будут использоваться в анализе, конечная концентрация экстракта или надосадочной жидкости в нейронной среде должна быть 100 мкг / мл 5,8.

Примечание: Для анализа с нейроны растет в 500 мкл среды в каждую лунку 24-луночного планшета, необходимо 50 мкг белка от каждого экстракта или надосадочной жидкости на лунку. В типичной концентрации экстракта около 10 мкг / мкл, можно было бы необходимо 5 мкл экстракта / супернатанта для каждой скважины. В каждом SETTINг выполнены в виде трех экземплярах, это будет соответствовать 15 мкл экстракта / супернатанта. Для различных тканей или клеточных типов, выполнять серийные разведения конечного экстракта или концентрации супернатанта и сравнивать наблюдаемые нейротрофические эффекты между различными концентрациями экстракт / супернатант.

3. Выделение нейронов

После того, как коллекция экстракт / супернатант закончил, вести с изоляцией нейронов.

  1. Для DRG нейронов, собирать шейки поясничного DRG новорожденных крыс между послеродовой день (Р) 2-12 после обезглавливания и stereomicroscopic рассечение DRG (рис. 1А). Для того чтобы иметь достаточные нейронов DRG для 24-луночный планшет, собрать все шейные чтобы поясничного DRG одного новорожденных крыс (равной 52 DRG) за тарелку.
    1. Срежьте периферическое (нервные) и центральные проекции (корни) из DRG с помощью microscissors.
      Оставив прогнозы на месте препятствует растирание и увеличивает тон попадания загрязнений риск культуре фибробластов.
  2. Для МП нейронов, срезать брыжейки из тонкой кишки и вручную и тщательно сдирать seromuscular слой тонкой кишки (для детального протокола о изоляции МП, обратитесь к Шефер и др.. 9, рисунок 1b). Для депутата, собрать сплетение от двух крыс на 24-луночного планшета.
    Примечание: Постарайтесь быть как можно ласковее, чтобы избежать слез в seromuscular слоя, так как они препятствуют его успешной отделение от тонкой кишки.
  3. Соберите DRG и seromuscular слой в ледяной минимальной необходимой среде (MEM), поставляемый с гентамицин (20 мг в 500 мл среды) и метронизадолу (2,5 мг в 500 мл среды).
  4. После сбора DRG, инкубировать их в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS), поставляемой с коллагеназы типа II в течение 20-30 мин. Для выделения МП, инкубировать в типа коллагеназы между 1-3 ч, в зависимости от возрастаживотного (рис. 1в).
  5. Для депутата, собрать сетчатой ​​MP куски под стереомикроскопа и трансфер в ледяной MEM.
  6. Тогда растирают DRG и MP через шприцы с уменьшением диаметра.
    Примечание: Чрезмерное растирание может уничтожить нейроны, но за вычетом клетки глии.
  7. После того, как среда, содержащая DRG или MP стало пасмурно, центрифуги суспензию на 93,9 мкг в течение 5 мин, отбросить средних и ресуспендируют в Neurobasal среды (с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0.5 мм L-глютамин и 2% B-27).
  8. Подсчитать общее количество клеток (то есть нейронов и глии) с помощью гемоцитометра.
    Примечание: количество необходимых клеток зависит от параметра измерения. Для количественной оценки плотности нейритов, необходимо более плотные культур и, следовательно, большее количество клеток, чем для измерения нейритов, perikaryonal размераи ветвление образец отдельных нейронов. Для измерения плотности аксонов, использовать например 10000 клеток (нейронов + глии) / а или 1500 нейронов / а. Для морфометрии отдельных нейронов, краткая (1 минута длиной) трипсинизации клеток и посева 2500 клеток / а или 400 нейронов / хорошо рекомендуется. Типичный выход клеток, полученных из одной крысы составляет около 300,000-500,000 клетки.
  9. Семенной клеток на 13 мм покровные, которые были покрыты в ночь перед и началу скважин с Neurobasal среде (содержащей 100 U / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0.5 мм L-глютамин и 2% B-27) (рис. 1D).
    Примечание: Использование поли-D-лизина (40 мг / м 2) или орнитин-и ламинин покрытием (1 мг / мл каждого) с покрытием покровные стекла. Клетки прикрепляются к поли-D-лизина очень быстро, что делает его пригодным для экспериментов, в которых необходимы многие клетки (т.е. измерения плотности нейритов). Привязанность к ламинином это вообще Зомечто слабее, но ламинином является сильным пропагандистом аксонов. Таким образом, для измерений на нейронной ветвления и длины аксонов, предпочитают орнитин / ламинином покрытие.
  10. Разрешить клетки прикрепляются к скважин на ночь. На следующий день, приготовления экстракта с добавкой носитель (в конечной концентрации экстракт / надосадочной 100 мкг / мл).
  11. Аспирируйте посева среду, а также выполнять дополнительный, очень бережная стирка с PBS, а затем медленно пипетки экстракт / надосадочную-дополняется носителя (Рисунок 1E).
  12. Пусть клетки растут в течение 48 часов. Аспирируйте СМИ и исправить в 4% параформальдегиде для иммуноокрашивания (рис. 1F).
  13. Выполните двойного окрашивания иммунофлюоресценции с использованием специфичные для нейронов (например бета III-тубулина) и глии конкретным (например глиальных fibriallary кислый белок / GFAP) маркеры (рис. 1G).
  14. Для морфометрии, использовать инвертированный светового микроскопа, снабженного ПЗС-камеры в комбинации Wiй автоматизированное программное обеспечение, которое позволяет измерять плотности аксонов (см. таблицу).
  15. Плотность аксонов нейронов культур измеряется на 4-5 представительств микрофотографии на 200-кратное увеличение с 4-х различных регионах плотной роста на каждом покровном при наложении х 50 мкм сетки 50 мкм и подсчета плотность волокон на квадрат измеренного в пересекающихся волокон. Рост нейритов, среднее количество ответвлений на нейрона, средняя длина ветвь и perikaryonal размер может быть измерена с 30 случайно выбранных одиночных нейронов из каждого покровного стекла путем отметки нейритов и perikarya (Рисунок 1H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Морфологические нейропластичность

В указанном возрасте от новорожденных крыс (Р2-12) и плотностей высева, MP и DRG нейроны уже построения плотных нейронные сети после 48 часов (рис. 2А). Сравнение плотности аксонов между нейронами, культивируемых в РПЖ, CP, и NP экстрактов показывает большую плотность аксонов из DRG нейронов в РПЖ или экстрактов СР, чем в НП экстрактов 5 (рис. 2A). Особенно предпочтительно MP нейроны для измерений на отдельных нейронов, так как MP нейроны, как правило, легче отделить от окружающих глиальных клеток, чем DRG нейронов. Здесь MP нейроны, выращенные в РПЖ или СР экстрактов также строить больше нейриты и демонстрируют более сложную разветвленную картину, чем МП нейронов, растущих в NP-экстракта среде, содержащей (рис. 2В) 5. Отсутствие этой разницы в нейронной морфологии индуцируется Н.П., CP, и РПЖ извлекает указывает на технические проблемы в аДни рождения Ssay. В большинстве случаев, это может быть связано с: 1) плохое качество подготовленной экстракта из-за длительного времени обработки или 2) из-за повреждения нейронов, которые произошли в процессе выделения.

Функциональные исследования

Нейропластичности анализ несет достаточно высокую чувствительность для обнаружения изменений, вызванных наличием или отсутствием определенных молекул-мишеней, представляющих интерес в дополненных экстрактов или супернатантов. Например, блокада нейротрофический фактор артемин или фактора роста нервов от РПЖ (ГКП) супернатантов добавление определенных блокирующие антитела к NGF или по dynabead-индуцированного разрушения результатов артемин в затухании нейронов формирования сети (рис. 2в) 10. В недавнем исследовании, мы могли показать очень похожий эффект для вклада нейротрофического фактора Neurturin к нейропластичности в CP в одновременном сравнении с другими нейротрофических факторов, таких как NGF, глиальных-клеточной линии-DERIVред нейротрофический фактор (GDNF), или трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета) 11.

Глия

Тот же самый подход может быть применен для оценки реакции DRG-ассоциированной спутниковых глиальных клеток или кишечной глии в панкреатических микроокружения содержимого. В самом деле, одно из самых мощных эффектов тканевых экстрактах РПЖ на DRG-или MP-ассоциированного глии является заметным увеличение роста глии (рис. 3) 5. Кроме того, этот эффект более выражен в РПЖ, чем в CP. Здесь следует учитывать, что распространение глии не следует судить на основе абсолютного количества глиальных, а от относительной доли глии к нейронов (глии-нейрон-индекс) 5. Это особенно важно учитывать, так как число глиальных клеток в этих культурах более трудно контролировать из-за эффективность пролиферации глии в отличие от нейронов.


Рисунок 1. Принципиальная протокол в пробирке Нейропластичность анализа. Настоящий анализ использует новорожденного крысы ганглиях задних корешков (DRG) и мышечной оболочки кишечника сплетения нейронов (MP) для изучения влияния экстрактов ткани поджелудочной железы или клеточных супернатантах на нейронной и глиальных морфологии. DRG собраны после передней ламинэктомии и MP-содержащего seromuscular слоя после резекции и механической зачистки тонкой кишки (A, B). После типа коллагеназы II пищеварения, нейроны высевают в нужном плотности (подробности в тексте) объявление культивировали в течение 24 часов (C, D). Затем свежеприготовленный поджелудочной железы (или из любого органа желудочно-кишечного интереса) экстракты и клеточные супернатанты добавляют в среду роста нейронов в предварительно определенных концентрациях (E).Через 48 ч культуры зафиксированы в 4% параформальдегида и дважды иммуноокрашиванию против нейронных и глиальных маркеров (F, G). Нейронов морфология, в том числе плотности аксонов, нервной рисунком ветвления и perikaryonal размера измеряются с помощью стандартизованного протокола программного обеспечения (H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Поджелудочной нейропластичность индуцируется человека рака поджелудочной железы (РПЖ) и хронического панкреатита (ХП). Человека экстракты ткани поджелудочной железы хирургическим путем происходит от нормальной поджелудочной железы (NP), CP или РПЖ тканей вызывают заметные различия в плотности аксонов ДРГ пе urons (а) и в нейронной ветвления картина МФ нейронов (б). Здесь, РПЖ и CP экстракты тканей оказывают заметную нейротрофический эффект на DRG и МП нейронов. Как и в тканевых экстрактах, а также супернатантах отдельных типов клеток (здесь клеток рака поджелудочной железы / PCC) также удивительно увеличить плотность нейритов в DRG нейроны (С). Это увеличение, однако, является обратимым, когда выбранные нейротрофические факторы, такие как артемин (ARTN) или фактор роста нервов (NGF) истощены или блокировали этих супернатантов. Все нейроны иммуноокрашиванию против бета-III-тубулина. Все изображения на 100-кратном увеличении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

51049fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Глиальных реакция на поджелудочной микроокружения содержание. Поджелудочной экстракты ткани от РПЖ или ткани CP не только нейротрофическое эффект, но и повысить глиальных рост и рассчитывает глиальных клеток в DRG или MP культур. Глиальных клеток иммуноокрашиванию против глии маркера глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP). Все изображения на 200-кратное увеличение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Настоящий протокол предназначен для иллюстрации методики позади в пробирке поджелудочной Нейропластичность анализа, который был недавно разработанной нашей группой для изучения механизмов нейропластичности в РПЖ и CP 5. Протокол включает в себя процедуру трехдневный которые могут быть легко применены после того, как исполнитель приобрел достаточный опыт в изоляции и культуры DRG и МП нейронов. Кроме того, он представляет собой ценный инструмент для изучения сопутствующей реакцию кишечных и ДРГ-связанного глии к поджелудочной компонентов микроокружения.

На наш взгляд, одним из наиболее интересных особенностей данного анализа является его способность обнаруживать и моделировать изменения, которые происходят во время РПЖ и КП (т.е. нейронная прорастания и гипертрофии) в упрощенном в пробирке обстановке. Действительно, применение тканевых экстрактов или клеточных супернатантах результатов в изменении нейронов морфологии шHICH могут быть обнаружены с достаточной чувствительностью путем систематического анализа морфометрического. Недавно мы могли бы также продемонстрировать, что этот анализ также чувствительны, чтобы обнаружить различия в нейротрофического потенциала несколькими субъектами рака в одновременного сравнения: Когда нейротрофические атрибуты клеточных линий РПЖ сравнивали с клеточных линий колоректального рака, клеточные линии РПЖ индуцированный значительно большую плотность нейритов среди DRG нейронов, чем колоректального линий рака 8. Даже в сравнении ректального против раковых клеток ободочной кишки линии, рак толстой кишки клеточные линии были хуже ректальных опухолевых клеток с точки зрения их потенциального neuroplastic 8.

Одним из ключевых преимуществ этого теста является его легкая доступность не только для морфометрических, но и электрофизиологические анализы. В отличие от в точке нейронов в срезов препаратов, записей из нейронов в нашем анализе в рамках, определенных СМИ или в аbsence / над-наличие определенных факторов технически не требуя и может доставить ценную информацию о роли отдельных молекул в этих микросреды на нейронной активности.

Конечно, представлены тест не должен рассматриваться быть исключительно ограничивается изучением вопросов, связанных с поджелудочной нейропластичности. Нейропластичность является характерной чертой всей желудочно-кишечного тракта при патологических состояниях, таких как воспалительные кишечные невропатии 1-3. Все эти условия, как сообщается, связана с изменениями в иннервации морфологии и измененной активности нейронов 1-3. Таким образом, можно предположить, заменить экстракты ткани поджелудочной железы или клеточные линии те получены из соответствующих тканей и изучить их конкретное воздействие на нейроны и сопроводительной глии. Наши недавние исследования о сравнении поджелудочной и колоректального рака тканей поддерживает это понятие 8. Тем не менее, это также правдоподобно Assumе, что компоненты различных микросреды ткани не может вызвать как чувствительные и представительные изменения, как мы обычно наблюдаем в компонентах ткани поджелудочной железы. Поэтому мы рекомендуем предыдущий обширный оценку нейронной морфологии, вызванную «положительных» управления тканей (т.е. тканей с например гистологически продемонстрировали нервной гипертрофии) по сравнению с «негативным» управления тканей (то есть, не гистологического доказательства нервной гипертрофии).

Наши бывшие анализы на реакцию глии в этом анализе были ограничены определения отсчетов глиальных клеток поджелудочной железы в различных микросреды. Glia клетки обладают возникающих значение в нейробиологии с признанием их нейрогенной потенциала и увеличению интереса к кальция токов вдоль глиальных мембраны 12. Таким образом, клетки глии в этом анализе, также легко доступны для дальнейших функционального анализана новых подходов. Тем не менее, такие дополнительные инновационные подходы нужно предыдущий обширный проверку перед их применения для дальнейших исследований.

Как и любой другой экспериментальной анализа, также представлены нейропластичность анализ имеет некоторое ограниченное сопоставимости образцов тканей человека, полученных из различных пациентов, перенесших операцию. Крайне важно, чтобы эти ткани, которые будут получены из регионов же ткани (например, головки поджелудочной железы, от основной массы опухоли) для надежной анализов 1. Кроме того, даже если это условие выполнено, дальнейшие различия в ткани или биологии опухоли нельзя исключать, учитывая большое изменение в биологической картины реагирования различных лиц 1. Чтобы обойти эти индивидуальные различия тканей, мы рекомендуем выполнения анализа с тканей, полученных из многих пациентов, насколько это возможно, т.е. по крайней мере с 5 - 10 различных пациентов в лица.

В качестве ключевого техническом аспекте, мы хотели бы привлечь внимание к роли покрытия веществ на роста нейронов. Кроме того, как уже упоминалось выше, мы предпочитаем поли-D-лизин для измерений на плотности аксонов, и орнитин / ламинином покрытие для тех, кто на индивидуальной нейронной картины ветвление / вырост. В наших руках, тогда как измерение нейронов выроста также может быть выполнена на поли-D-лизина, покрытых поверхностей, находим, что этот подход имеет тенденцию к снижению чувствительности анализа для фактических различий. Таким образом, исследователи, применяющие настоящие анализа следует обеспечить использование оптимального материала покрытия для их вопрос интереса.

Таким образом, мы считаем, что представлено нейропластичность анализ представляет собой ценный инструмент для получения быстрой и воспроизводимой информации о нейро-морфологии и нейро-функции в различных микросреды ткани, как показано в примереткани поджелудочной железы. Чувствительный обнаружение различий в нейро-морфологии как индуцированный различным содержанием ткани поджелудочной железы подчеркивает воспроизводимость в пробирке поджелудочной нейропластичности в человеческой РПЖ и CP. Будущие усилия должны быть направлены на оптимизированной preassay скрининга, применяемых супернатантами и извлекает для достижения лучше всего определить средств массовой информации для изучения GI-ассоциированных с заболеваниями, нейропластичности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конкурирующие интересы и никаких раскрытия финансовой информации.

Acknowledgments

Все авторы способствовали созданию и проверки представленной анализа и к проекту рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1149
Ornithine/laminin Sigma-Aldrich P2533/L4544
13 mm Coverslips Merck For use in 24-well plates
Dismembranator S Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin antibody Millipore MAB1637 1:200 concentration
Anti-GFAP-antibody DAKO M0761 1:400 concentration
RIPA buffer + protease inhibitor Any supplier
Neurobasal medium Gibco/Life Sciences 21103-049
B-27 Supplement Gibco/Life Sciences 17504044 Quality of B-27 is known to depend on the lot number
Gentamicin/Metronidazol Any supplier
Minimal essential medium Gibco/Life Sciences 31095-029
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Sciences 24020133 Improves collagenase activity when containing Ca/Mg
Collagenase type II Worthington Biochemical CLS-2 Obtain lots with at least 200 U/mg activity
Trypsin-EDTA 0.25% Gibco/Life Sciences 25200056
4% Paraformaldehyde Any supplier
analySIS docu software Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
  2. Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
  3. Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
  4. Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
  5. Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
  6. Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
  7. Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
  8. Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
  9. Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
  10. Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
  11. Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
  12. Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).

Tags

Медицина выпуск 86 вегетативной нервной системы Болезни пищеварительная система новообразований желудочно-кишечных заболеваний заболеваний поджелудочной железы поджелудочной железы новообразования панкреатит сахарный нейропластичность ганглии задних корешков мышечной оболочки кишечника сплетение Морфометрия плотность аксонов аксонов ветвления perikaryonal гипертрофия нейронная пластичность
Имитация поджелудочной Нейропластичность:<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Dual-нейрон Пластичность Анализ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Demir, I. E., Tieftrunk, E.,… More

Demir, I. E., Tieftrunk, E., Schäfer, K. H., Friess, H., Ceyhan, G. O. Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay. J. Vis. Exp. (86), e51049, doi:10.3791/51049 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter