Summary
神经元可塑性是一个日益认识到，但是不能充分理解的胃肠（GI）道的特征。这里，在人胰腺疾病的实例中，我们提出了对神经元可塑性的在胃肠道中在两个形态和功能水平的研究在体外神经可塑性试验。
Abstract
神经可塑性是病理条件下的肠神经系统和胃肠道（GI）的神经支配的固有特征。然而，神经可塑性的胃肠道疾病的病理生理作用尚不清楚。新颖的实验模型允许模拟和胃肠道神经可塑性的调制可以使得的神经可塑性的，尤其胃肠疾病，如胰癌（PCa）和慢性胰腺炎（CP）的贡献增强的赞赏。在这里，我们提出了一个协议，用于模拟在体外利用新生大鼠背根神经节（DRG）和肌间神经丛（MP），神经元的条件下胰腺神经可塑性的。这种双神经元的方法不仅允许监控两个器官内在的和，外在神经可塑性，同时也代表一种有价值的工具来评估神经元和神经胶质细胞形态学及电生理学。此外，它允许提供的微环境内容的功能调节学习他们的IMPACt关于神经可塑性。一旦建立，目前神经可塑性试验承担的是适用于神经可塑性的任何胃肠器官研究的潜力。
Introduction
在胃肠道（GI）的神经形态和密度的改变已经引起胃肠病学家和病理学家的关注很长一段时间，但其对胃肠道疾病的病理生理学意义尚不清楚1-3。事实上，有几个非常常见的胃肠道疾病如胃炎，反流性食管炎，结肠炎，憩室炎，阑尾炎都在发炎的组织方面1增加神经分布密度有关。然而，没有真正注意到目前为止已支付给在胃肠道的机制和神经可塑性的含义。别形态学改变的胃肠道神经从正常胃肠道神经不同， 即肠神经系统的正常状态下，在其功能方面？什么是塑料肠神经改变神经肽/神经递质含量的影响？请问周边神经可塑性总是意味着改变信号的中枢神经系统？哪里有塑料extri的中央预测NSIC胃肠神经通路？当看着我们的知识对胃肠道神经可塑性的功能方面的缺乏可以很容易地生成一个长等一系列关键问题。
胃肠道神经可塑性在功能层面的研究需要有效，重复性好，仍然很容易适用的实验模型。在增加的时代普及和接受遗传工程有条件的小鼠模型（GECoMM），这种在体内设置的承受阐明胃肠道神经可塑性的以前未知的方面在一个现实的方式1的潜力。然而，GECoMM的设计和生产仍是昂贵的，劳动密集的，尤其是费时。此外，他们还要求先验选择要有条件地调制在基因改变小鼠（ 如转基因的肠上皮细胞神经生长因子/神经生长因子过度表达）的目标。因此，对于DES一个成功的GECoMM的IGN，研究人员需要一种有价值的目标的一些指标（ 如以前的实验数据）， 即该利益（这里NGF）的分子至少可以预期会对胃肠神经生物学的一些相关影响。
这些指标可以很容易地衍生自适当的体外模型，其中从体内系统的复杂的微环境中分离的细胞的亚型可以在异型方式4-7被选择性地共培养。在这样的异型文化背景的分子靶点的调制平均为技术上不太繁琐，速度更快，因此可以在有价值的目标的预滤波有助于验证在体内研究。
最近，我们提出这是设计来模拟胰内NE的增加神经密度和肥大的体外神经可塑性试验rves人胰腺癌癌（PCa）和慢性胰腺炎（CP）的组织。在这里，从新生大鼠背根神经节（DRG）或肌间神经丛（MP），得出的神经元是从手术切除的前列腺癌或CP组织标本暴露于组织提取物和相比，那些在正常人体胰腺（NP）组织提取物5培养。而不是组织提取物，还可以使用细胞上清液来研究神经可塑性选择的细胞类型的影响。当一个标准化的形态测量相结合，所提出的神经可塑性试验允许有效的和可重复的神经可塑性的评估针对不同的胰腺微环境。特别地，它允许1）形态学神经可塑性的仿真， 即变化的神经突向外生长，分支图案和神经元的大小，和2）功能性神经可塑性， 即在改变外周神经元的兴奋性。此外，不仅外围（ 即 例如背根神经节或二阶脊髓）的神经元可被包括在本试验以评估其形态和功能的反应，不同的GI组织内容。在本视频教程中，我们展示了技术协议，这个实验的性能，并讨论其优点和缺点。此外，我们提醒大家注意这种试验，以神经可塑性的任何胃肠器官研究的基本概念的适用性。
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Protocol
所有动物实验过程中的协议遵循慕尼黑工业大学，德国的动物护理指引。
1，媒体/提取物的制备
- 组织同质化
组织同质化的质量对后续检测神经可塑型变化在培养神经元的关键。在这里，均化，建议使组织解离没有在组织中的温度上升大。- 直接从-80℃至液氮并将其放置在组织中的均化的固相的胰腺组织的转帐5 x 5毫米×5毫米的立方体。理想的均化将解离组织的速度不够快，不让它解冻。
- 立即离解后，重新悬浮固体，粉末状的匀浆在300-500微升0.1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。在这里，不使用任何裂解液（如RIPA），因为这可能会裂解神经元。
- 离心匀浆至少15分钟，你的板凳离心机（ 如 21,130 XG）的最高速度。收集上清液它代表了组织提取液。
- 细胞上清液
- 让所关注的细胞达到至少70 - 在正常生长培养基中80％汇合。
- 通常情况下，这些媒体包括血清成分，并可能在神经元的生长产生不可控制的影响。因此，在达到所需的细胞密度后，用细胞培养级的PBS洗细胞，至少3倍，并放置在无血清培养基（SFM），长达48小时。
注意：在此，考虑到某些细胞（象胰腺星状细胞）可能需要血清中的生长培养基中，以维持其正常状态和结构。在这种情况下，为了找到所需的完整细胞函数的可能的最低血清内容执行在所感兴趣的细胞的培养基系列血清稀释Ñ。 - 测量通过Bradford蛋白测定的组织匀浆或细胞上清液中的蛋白质浓度。虽然这些值的变化取决于组织和细胞类型，胰腺组织提取物，应有5-12微克/微升之间的浓度范围内，并且为3-8微克/微升之间的细胞系上清液。
2，分装提取物和细胞上清液
这取决于在该测定中使用的浓度，在神经元培养基中的提取物或上清液的终浓度应为100微克/毫升5,8。
注意：对于与神经元的生长于500μl培养基中在24孔板的每个孔中的测定法，需要50微克蛋白质从各提取物或上清，每孔。在约10微克/微升的典型提取物浓度，人们可能需要5微升提取物/上层清液的每个孔。在每一个设置搜索克为一式三份，这将对应到15微升提取物/上清。对于不同的组织或细胞类型，执行最后的提取物或上清液浓度的连续稀释和比较不同提取物/上清浓度之间所观察到的神经营养作用。
神经元3。隔离
一旦提取物/上清收集完成后，继续与神经元的隔离。
- 对于DRG神经元，收集颈椎腰椎日龄（P）2-12后斩首和背根神经节的显微立体解剖（ 图1A）之间的新生大鼠背根神经节。为了有足够的DRG神经元的24孔板，收集所有颈椎腰椎一名新生儿鼠（相当于52 DRG）每盘的DRG。
- 切去周边（神经）和背根神经节的中央突起（根）由microscissors的手段。
离开突起的地方阻碍了研制和增加T他文化的污染风险由成纤维细胞。
- 切去周边（神经）和背根神经节的中央突起（根）由microscissors的手段。
- 对于MP神经元，切离小肠和手动肠系膜，小心剥离小肠（关于MP隔离一个详细的协议，是指舍费尔等人 9， 图1B）的浆肌层。对于MP，收集来自两个大鼠每24孔板的神经丛。
注：尝试，因为它们妨碍其从小肠成功分离，是尽可能轻柔，以免眼泪在浆肌层。 - 收集用庆大霉素（20毫克500ml中培养基）和甲硝唑（在500ml培养基中2.5毫克）供给在冰冷的极限必需培养基中背根神经节和浆肌层（MEM）。
- 以下收集DRG的，它们孵育在Hank平衡盐溶液（HBSS），用胶原酶II型20-30分钟供给。用于MP隔离，孵育1-3小时之间胶原酶类型，取决于年龄的动物（ 图1C）。
- 对于MP，根据收集的立体网状MP件，转移到冰冷的MEM。
- 然后通过注射器磨碎的DRG和MP与直径减小。
注意：过度研磨会破坏神经元，但少了神经胶质细胞。 - 一旦包含背根神经节或MP介质已经变得浑浊，离心93.9×g离心5分钟暂停，弃去培养基，重悬在Neurobasal培养基（含100 U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素，0.5mM的L-谷氨酰胺和2％的B-27）。
- 通过血球的方式计数细胞总数（ 即神经元和神经胶质细胞）。
注意：需要的细胞的数目是依赖于测量的参数。对轴突密度的定量化，需要更密集的培养物，从而更大数量的细胞比对神经突向外生长，perikaryonal尺寸的测量和分支单个神经元的形态。对于轴突密度测量， 例如使用10,000个细胞（神经胶质细胞+）/孔或1,500神经元/孔。对于形态上的单个神经元细胞的短暂（1分钟长），胰蛋白酶消化和2500个细胞/孔或400神经元/播种和建议。从一个大鼠获得的细胞的典型产率为约300,000-500,000细胞。 - 种子细胞在其上已涂覆前的夜晚13毫米盖玻片和顶部的井用Neurobasal培养基（补充有100单位/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素，0.5mM的L-谷氨酰胺和2％的B-27）（ 图1D）。
注意：使用聚-D-赖氨酸（40毫克/米2）或鸟氨酸和层粘连蛋白包被的（1毫克/毫升每个）涂布盖玻片。细胞附着到聚-D-赖氨酸非常快，从而使其适用于实验中，都需要许多细胞（ 即轴突密度测量）。附件粘连一般是一些什么较弱，但层粘连蛋白是神经突向外生长的强启动子。因此，对神经元的分支和神经突长度的测量，比较喜欢鸟氨酸/层粘连蛋白涂层。 - 使细胞附着到孔中过夜。在第二天，制备提取物的培养基中（在最终提取物/上层清液的100微克/毫升的浓度）。
- 吸出接种培养基，并用PBS进行可选的，非常温和洗涤，然后慢慢地吸取提取物/上清液的培养基中（ 图1E）。
- 让细胞生长48小时。吸媒体和4％多聚甲醛免疫染色（ 图1F）修复。
- 用神经元特异性（ 如 β-III-微管蛋白）和神经胶质特异性（ 如胶质fibriallary酸性蛋白/ GFAP）标记（ 图1G）进行双免疫荧光染色。
- 对于形态，使用倒置光显微镜配备结合无线CCD摄像机TH自动化的软件，它允许轴突密度测量（见表）。
- 神经细胞的轴突密度从最密集的增长对每个盖玻片4个不同地区按覆盖50微米×50微米的网格，计算在交叉纤维测定每平方的纤维密度测量4-5个代表性显微照片200倍的放大倍率。神经突向外生长，平均每神经元分支的数目，平均分支长度和perikaryonal大小可以从每个盖玻片随机选择30孤神经元标记的轴突和胞体（ 图1H）进行测定。
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Representative Results
形态神经可塑性
在新生大鼠（P2-12）和播种密度的表示年龄范围，MP和DRG神经元48小时（ 图2A）后，已经建立密集的神经网络。神经元培养于前列腺，CP之间的轴突密度，和NP提取物的比较揭示了背根神经节神经元中前列腺癌或CP提取物的更大的轴突密度比NP提取物（ 图2A）5。我们特别喜欢MP神经元上的单个神经元的测量，因为MP神经元往往更容易从周围的神经胶质细胞比DRG神经元分离。这里，在PCa或CP提取物生长MP神经元也建立较长的突起，并表现出比MP神经元的更复杂的分支图案中含有NP-提取物培养基中生长（ 图2B）5。由于没有在神经元形态学这种差异引起的NP，CP和前列腺癌中提取指示在一个技术问题SSAY。在大多数情况下，这可能是由于1）所制备的提取物，由于处理时间长，或2）由于损坏，在分离过程中发生的神经元的质量较差。
功能性研究
的神经可塑性测定耐足够高的灵敏度来检测诱导的在补充提取物或培养上清某些感兴趣的目标分子的存在或不存在的改变。例如，神经营养因子青蒿琥酯或神经生长由前列腺细胞，加入特异性阻断抗体与NGF或青蒿琥酯的结果中衰减的神经元网络的形成（ 图2C）10 dynabead诱导损耗因子（PCC）的上清液的封锁。在最近的研究中，我们可以表示为以神经可塑性在CP与其它神经营养因子，如神经生长因子，神经胶质细胞系 - 衍生工同时比较了神经营养因子Neurturin的贡献非常相似的效果编辑神经营养因子（GDNF）或转化生长因子-β（TGF-β）11。
神经胶质细胞
同样的方法也可以应用到评估DRG相关卫星胶质细胞或肠溶性胶质细胞向胰腺微环境内容的反应。事实上，为前列腺癌组织提取物后，背根神经节或MP相关的神经胶质细胞的最有力的影响之一是在神经胶质细胞的生长（ 图3）5突出的增长。此外，这种效果比在CP更加明显在PCa。在这里，人们应该考虑基于绝对计数神经胶质细胞的神经胶质细胞的增殖不应该评判，而是对神经胶质细胞对神经元（神经胶质细胞，神经元指数）的相对比例5。这是特别重要的考虑因素，因为神经胶质细胞在这些培养物中的数量是更加难以控制因神经胶质细胞的增殖能力，而不是神经元。
图1： 在体外神经可塑性试验的原理协议。本 实验利用新生大鼠背根神经节（DRG）和肌间神经丛（MP），神经元，研究胰腺组织提取物或细胞上清液后，神经元和神经胶质细胞形态的影响。 DRG前椎板切除，并与小肠的机械剥离后含MP浆肌层后收集（A，B）。经过二型胶原酶消化，神经元接种在需要的密度（详见说明书）广告培养24小时（C，D）。然后，将新鲜制备的胰（或从任何感兴趣的胃肠器官）提取物和细胞上清液在前面所定义的浓度（C）被添加在神经元的生长培养基中。48小时后，将培养物固定在4％多聚甲醛和双免疫染色对神经元和神经胶质标志物（F，G）。神经元的形态，包括轴突密度，神经的分支模式和perikaryonal大小是由一个标准化的软件协议（H）来测量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。胰腺神经可塑性诱导的人胰腺癌（PCA）和慢性胰腺炎（CP）。人体胰腺组织提取物手术从正常的胰腺（NP），CP或前列腺癌组织来源诱导的DRG网元的轴突密度显着差异 urons（A）和MP神经元（B）的神经元分支模式。在这里，前列腺癌和CP组织提取物施加于背根神经节和MP神经元的一个突出的神经营养作用。类似组织提取物，个体的细胞类型（这里胰腺癌细胞/ PCC）也上清也显着增大DRG神经元（C）的轴突密度。这种增加，然而，当选定的神经营养因子，如青蒿琥酯（ARTN）或神经生长因子（NGF）被耗尽或阻止与这些上清液可逆的。所有神经元免疫染色对β-III-微管蛋白。放大100倍的所有图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3。胶质反应胰腺微环境的内容。从前列腺癌胰腺组织提取物或CP组织不仅有神经营养作用，还能增强神经胶质细胞生长和神经胶质细胞计数在背根神经节或MP文化。神经胶质细胞的免疫染色对神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。在200X放大倍率的所有图像。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
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Discussion
本协议的目的是为了说明这是最近开发的由我们小组研究神经可塑性的机制，在前列腺癌和CP 5 体外胰腺神经可塑性试验背后的方法论。该协议涉及它可以很容易地被应用一次表演已经获得了在DRG和MP神经元的分离和培养足够的经验，进行为期三天的过程。此外，它表示用于学习和肠溶DRG相关神经胶质细胞的胰腺微环境组分的伴随反应的有价值的工具。
在我们看来，这种分析的最有趣的功能之一是它能够检测和模拟前列腺癌和CP（ 即神经出芽及肥大）期间发生的变化在一个简化的体外环境的能力。事实上，在改变神经元形态W应用组织提取物或细胞上清液结果HICH能够以足够的灵敏度以系统化形态学分析的手段来检测。最近，我们也可以证明，此法也是敏感的检测在同时比较多种实体肿瘤的神经营养潜在的差异：当前列腺细胞系的神经营养特性进行了比较，从大肠癌细胞系，前列腺癌细胞系显著诱导更大的轴突密度DRG神经元比大肠癌线8之间。甚至在直肠与结肠癌细胞系的比较，结肠癌细胞系不如直肠癌细胞中的神经可塑型其潜在8期。
其中一个此法的主要优点是它拆装方便，不仅形态，而且还电生理分析。如在片制剂，录音从我们的测定神经元确定的培养基中，或在一个相对于原位的神经元bsence /过存在定义的因素在技术上并不苛刻，可以在选定的分子对神经细胞的活动这些微环境中的作用提供有价值的信息。
当然，所提出的检测不应该被视为可以完全限制在相关的胰腺神经可塑性的问题的研究。神经可塑性是病理情况下，如炎症性肠道神经病变1-3下整个胃肠道的一个突出特点。所有这些条件都报与变化形态的支配和改变神经元的活动1-3关联。因此，可以想到通过那些来自对应的组织来源，以取代胰腺组织提取物或细胞系，并研究它们对神经元和神经胶质细胞伴随的具体影响。我们对胰腺癌和结直肠癌组织中的比较最近的分析支持这一观点8。然而，它也是可行的，以assumË不同组织微环境的组件可能不会引起敏感和有代表性的改动，因为我们经常观察胰腺组织成分。因此，我们建议神经元形态的诱发“积极的”控制组织（ 即组织中如病理证实的神经肥大）与“负”控制组织（ 如：没有组织学证据的神经肥大）以前广泛的评估。
我们对神经胶质细胞在该测定中，反应前的分析仅限于胶质细胞计数在不同胰腺微环境的判定。神经胶质细胞具有自识别他们的神经电位和钙电流沿胶质膜12兴趣增加在神经生物学新兴的重要性。因此，胶质细胞在这个实验也很容易接触到进一步的功能分析通过新的方法。然而，这种额外的创新方法需要以前的广泛验证他们的升学申请。
像任何其他的实验分析，也提出了神经可塑性试验承担不同的患者接受手术治疗得到人体组织样本的一些有限的可比性。当务之急是这些组织为可靠的分析1来源于同一组织区域（ 如胰头，从主肿块）。此外，即使当此先决条件被满足，在组织或肿瘤生物学进一步差异不能被排除在考虑的变化量较大的不同个体1的生物学响应模式。为了规避这些个体组织的差异，我们建议检测与从尽可能多的患者至少有5得到的可能， 即组织中的表现-每单位10个不同的患者。
作为一个关键的技术方面，我们想提请注意的涂层物质对神经细胞生长的作用。上面还提到，我们优选的聚-D-赖氨酸对轴突密度的测量，和鸟氨酸/层粘连蛋白涂层为那些对个体的神经分支/生长模式。在我们手中，而神经元的生长的测量也可以在聚-D-赖氨酸覆盖的表面来进行，我们发现，这种方法倾向于降低该测定的灵敏度为实际差异。因此，研究人员应用该测定法应确保最佳涂层用他们感兴趣的问题的使用。
综上所述，我们认为，所提出的神经可塑性试验代表了有价值的工具，以获取有关神经形态和神经功能的不同组织微环境的快速和可重复的信息，这表现在的例子胰腺组织。如诱发不同胰腺组织内容的灵敏检测在神经形态学差异彰显出体外重现胰腺神经可塑性在人类前列腺癌和CP。今后的努力应着眼于应用上清优化preassay筛选和提取，以达到最好的定义媒体胃肠疾病相关的神经可塑性的研究。
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Disclosures
作者没有竞争的利益，没有财务披露。
Acknowledgments
所有作者均参与对所提出的方法的建立和验证，以及稿件的草案。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm Coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27 Supplement | Gibco/Life Sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200 U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
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