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Medicine

अग्नाशय Neuroplasticity अनुकरण: Published: April 14, 2014 doi: 10.3791/51049
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

Summary

Neuronal plasticity जठरांत्र (सैनिक) पथ की एक तेजी से मान्यता प्राप्त है, लेकिन अपर्याप्त समझ में आ सुविधा है. इधर, मानव अग्नाशय विकारों के उदाहरण में, हम रूपात्मक और कार्यात्मक दोनों स्तर पर सैनिक पथ में neuronal plasticity के अध्ययन के लिए इन विट्रो neuroplasticity परख उपस्थित थे.

Abstract

Neuroplasticity रोग की स्थिति के तहत आंतों का तंत्रिका तंत्र और जठरांत्र (सैनिक) स्फूर्तिदान का एक अंतर्निहित सुविधा है. हालांकि, सैनिक विकारों में neuroplasticity के pathophysiological भूमिका अनजान बनी हुई है. सिमुलेशन और सैनिक neuroplasticity के मॉडुलन की अनुमति जो उपन्यास प्रयोगात्मक मॉडल ऐसे अग्नाशय के कैंसर (पीसीए) और पुरानी pancreatitis (सीपी) के रूप में विशेष सैनिक रोगों में neuroplasticity के योगदान का बढ़ाया सराहना सक्षम हो सकता है. यहाँ, हम नवजात चूहे पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) और myenteric जाल (म. प्र.) न्यूरॉन्स का उपयोग इन विट्रो परिस्थितियों में अग्नाशय neuroplasticity के अनुकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस दोहरे न्यूरॉन दृष्टिकोण दोनों अंग आंतरिक और बाह्य neuroplasticity की निगरानी परमिट, लेकिन यह भी neuronal और glial आकारिकी और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है न केवल. इसके अलावा, यह उनके IMPAC के अध्ययन के लिए आपूर्ति की microenvironmental सामग्री की कार्यात्मक मॉडुलन की अनुमति देता हैneuroplasticity पर टी. एक बार स्थापित, वर्तमान neuroplasticity परख किसी भी सैनिक अंग में neuroplasticity का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा रहा है की क्षमता देता है.

Introduction

जठरांत्र (सैनिक) तंत्रिका आकारिकी और घनत्व में बदलाव एक लंबे समय के लिए gastroenterologists और पैथोलॉजिस्ट का ध्यान आकर्षित किया है, लेकिन सैनिक रोगों के pathophysiology के लिए उनकी प्रासंगिकता 1-3 अनजान बनी हुई है. दरअसल, इस तरह gastritis, भाटा ग्रासनलीशोथ, कोलाइटिस, diverticulitis, और पथरी के रूप में कई अति सामान्य सैनिक विकारों सूजन ऊतक क्षेत्रों 1 में वृद्धि स्फूर्तिदान घनत्व के साथ जुड़े रहे हैं. हालांकि, कोई असली ध्यान अब तक सैनिक पथ में तंत्र और neuroplasticity के अर्थ के लिए भुगतान किया गया है. आकृति विज्ञान बदल सैनिक नसों उनके कार्य के संदर्भ में, आंतों का तंत्रिका तंत्र की सामान्य स्थिति यानी, सामान्य सैनिक नसों से अलग है? प्लास्टिक आंतों नसों में बदल neuropeptide / neurotransmitter सामग्री के निहितार्थ क्या हैं? परिधीय neuroplasticity हमेशा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को बदल संकेतन आवश्यक है? और जहां प्लास्टिक extri की केंद्रीय अनुमानों हैंएनएसआईसी सैनिक तंत्रिका रास्ते? सैनिक neuroplasticity के कार्यात्मक पहलुओं पर हमारे ज्ञान की कमी को देखते समय इस तरह के अहम सवालों की एक लंबी श्रृंखला आसानी से उत्पन्न किया जा सकता है.

कार्यात्मक स्तर पर सैनिक neuroplasticity का अध्ययन, वैध प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और अभी भी आसानी से लागू प्रयोगात्मक मॉडल की आवश्यकता है. बढ़ती के दौर में लोकप्रियता और ऐसे विवो सेटिंग्स में अनुवांशिक इंजीनियर सशर्त माउस मॉडल (GECoMM), की स्वीकृति एक यथार्थवादी फैशन 1 में सैनिक neuroplasticity के पहले अज्ञात पहलुओं को स्पष्ट करने के लिए संभावित सहन. हालांकि, GECoMM के डिजाइन और उत्पादन, महंगा रहता श्रम प्रधान और, विशेष रूप से, समय लेने वाली. इसके अलावा, वे सशर्त आनुवंशिक रूप से परिवर्तित माउस (आंतों उपकला कोशिकाओं में तंत्रिका वृद्धि कारक / NGF की जैसे ट्रांसजेनिक overexpression) में संग्राहक जा करने के लक्ष्य की एक प्राथमिकताओं चयन की आवश्यकता है. इसलिए, देस के लिएएक सफल GECoMM की IGN, शोधकर्ताओं, एक सार्थक लक्ष्य के कुछ संकेतक (जैसे पिछले प्रयोगात्मक डेटा) की जरूरत है (यहां NGF) के ब्याज की अणु कम से कम जीआई तंत्रिकाओं पर कुछ जैविक रूप से प्रासंगिक प्रभाव डालती है उम्मीद की जा सकती है कि अर्थात्.

इस तरह के संकेतक आसानी से एक में विवो प्रणाली की जटिल microenvironment से अलग सेल उपप्रकार चुनिंदा एक heterotypic ढंग 4-7 में cocultured किया जा सकता है जो इन विट्रो मॉडल में पर्याप्त से प्राप्त किया जा सकता है. इस तरह के एक heterotypic संस्कृति की स्थापना में आणविक लक्ष्य के मॉडुलन तेज, औसत पर तकनीकी रूप से कम बोझिल है, और इसलिए vivo अध्ययन में सत्यापन के लिए सार्थक लक्ष्य की prefiltering में सहायता कर सकते हैं.

हाल ही में, हम intrapancreatic पूर्वोत्तर की वृद्धि हुई तंत्रिका घनत्व और अतिवृद्धि अनुकरण करने के लिए डिजाइन किया गया था जो एक में इन विट्रो neuroplasticity परख प्रस्तुतमानव अग्नाशय के कैंसर (पीसीए) और पुरानी pancreatitis (सीपी) के ऊतकों में rves. इधर, नवजात चूहे पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) या myenteric जाल (म. प्र.) से प्राप्त न्यूरॉन्स शल्य चिकित्सा resected पीसीए या सी.पी. ऊतकों के नमूनों से ऊतक निष्कर्षों से अवगत कराया और सामान्य मानव अग्न्याशय (एनपी) ऊतक के अर्क 5 में सुसंस्कृत उन की तुलना में थे. इसके बजाय ऊतक निष्कर्षों की, एक भी neuroplasticity पर चयनित प्रकार की कोशिकाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सेल लाइन supernatants उपयोग कर सकते हैं. एक मानकीकृत morphometric माप के साथ संयुक्त, प्रस्तुत neuroplasticity परख अलग अग्नाशय microenvironments के जवाब में neuronal plasticity की वैध और प्रतिलिपि प्रस्तुत आकलन की अनुमति देता है. विशेष रूप से, यह अनुमति देता है neurite परिणाम, पैटर्न और neuronal आकार शाखाओं में बंटी, और 2) कार्यात्मक neuroplasticity, परिधीय न्यूरॉन्स के excitability में यानी परिवर्तन में परिवर्तन यानी 1) रूपात्मक neuroplasticity का अनुकरण,. इसके अलावा, परिधीय न केवल (यानी (जैसे डीआरजी या दूसरे क्रम रीढ़ की हड्डी) न्यूरॉन्स विभिन्न सैनिक ऊतक सामग्री के लिए उनके रूपात्मक और कार्यात्मक प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए उपस्थित परख में शामिल किया जा सकता है. वर्तमान वीडियो ट्यूटोरियल, हम इस परख के प्रदर्शन के लिए तकनीकी प्रोटोकॉल का प्रदर्शन और अपने फायदे और कमजोरियों पर चर्चा की. इसके अलावा, हम किसी भी सैनिक अंग में neuroplasticity का अध्ययन करने के लिए इस परख की बुनियादी धारणा की प्रयोज्यता की ओर ध्यान आकर्षित.

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Protocol

प्रोटोकॉल में सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं Technische Universität München, जर्मनी के जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों का पालन करें.

1. मीडिया / तैयारी निकालें

  1. ऊतक homogenization
    ऊतक homogenization की गुणवत्ता सभ्य न्यूरॉन्स में तंत्रिकाजाल परिवर्तन के बाद पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है. इधर, एक homogenizer ऊतक तापमान में प्रमुख वृद्धि के बिना ऊतक हदबंदी में सक्षम बनाता है जो सिफारिश की है.
    1. स्थानांतरण 5 मिमी एक्स 5 मिमी एक्स 5 मिमी सीधे ऊतक homogenator में एक ठोस चरण में तरल नाइट्रोजन और जगह के लिए -80 डिग्री सेल्सियस से अग्नाशय के ऊतकों के घनों. आदर्श homogenator यह defreeze की अनुमति के बिना, काफी तेजी से ऊतक अलग कर देना होगा.
    2. इसके तत्काल बाद हदबंदी के बाद, 0.1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 300-500 μl में ठोस, पाउडर जैसी homogenate resuspend. इधर, इस न्यूरॉन्स lyse सकता है के बाद से (जैसे RIPA के रूप में) किसी भी lysis बफर का उपयोग नहीं करते.
    3. अपने बेंच अपकेंद्रित्र (जैसे 21,130 XG) की अधिकतम गति से कम से कम 15 मिनट के लिए homogenates अपकेंद्रित्र. ऊतक निकालने का प्रतिनिधित्व करता है जो स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
  2. सेल लाइन supernatants
    1. सामान्य मध्यम विकास में 80% संगम - ब्याज की कोशिकाओं को कम से कम 70 तक पहुँचने.
    2. आमतौर पर, इन मीडिया सीरम घटक होते हैं और neuronal विकास पर बेकाबू प्रभाव डालती सकता है. इसलिए, वांछित सेल घनत्व तक पहुँचने के बाद, सेल कल्चर ग्रेड पीबीएस के साथ कम से कम 3x अपनी कोशिकाओं को धोने और अप करने के लिए 48 घंटे के लिए सीरम मुक्त मध्यम (SFM) में उन्हें जगह है.
      नोट: यहाँ, (अग्नाशय तारामय कोशिकाओं की तरह) कुछ कोशिकाओं को अपनी सामान्य स्थिति और संरचना को बनाए रखने के क्रम में उनके विकास मीडिया में सीरम की आवश्यकता हो सकती है कि विचार करें. ऐसे मामलों में, बरकरार सेल कार्यात्मक के लिए आवश्यक न्यूनतम सीरम सामग्री खोजने के लिए ब्याज की सेल के माध्यम में धारावाहिक सीरम dilutions प्रदर्शनएन.
    3. ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के माध्यम से ऊतक homogenate या सेल supernatants के प्रोटीन एकाग्रता उपाय. इन मूल्यों के ऊतकों और सेल प्रकार के आधार पर भिन्न, अग्नाशय के ऊतकों के अर्क के लिए, एक 5-12 ग्राम / μl के बीच एक एकाग्रता रेंज की उम्मीद है, और 3-8 ग्राम / μl के बीच सेल लाइन supernatants के लिए होगा.

2. विभाज्य अर्क और सेल Supernatants

परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एकाग्रता पर निर्भर करता है, neuronal मध्यम में निकालने या सतह पर तैरनेवाला के अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोग्राम / एमएल 5,8 होना चाहिए.

नोट: न्यूरॉन्स 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 500 μl मध्यम में बढ़ के साथ एक परख के लिए, एक अच्छी तरह से प्रति प्रत्येक निकालने या सतह पर तैरनेवाला से प्रोटीन की 50 ग्राम की जरूरत है. लगभग 10 माइक्रोग्राम / μl की एक ठेठ निकालने एकाग्रता में, हर एक के लिए अच्छी तरह से निकालने / सतह पर तैरनेवाला के 5 μl की आवश्यकता होगी. हर settin मेंजी एक तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया, इस निकालने / सतह पर तैरनेवाला के 15 μl के अनुरूप होगा. विभिन्न ऊतकों या सेल प्रकार के लिए, अंतिम निकालने या सतह पर तैरनेवाला एकाग्रता के धारावाहिक dilutions प्रदर्शन और अलग निकालने / सतह पर तैरनेवाला सांद्रता के बीच मनाया neurotrophic प्रभाव की तुलना करें.

न्यूरॉन्स की 3. अलगाव

निकालने / सतह पर तैरनेवाला संग्रह समाप्त हो जाने के बाद, न्यूरॉन्स के अलगाव के साथ जारी.

  1. DRG न्यूरॉन्स के लिए, प्रसव के बाद दिन (पी) 2-12 कत्ल और डीआरजी का stereomicroscopic विच्छेदन (चित्रा 1 ए) के बाद के बीच नवजात चूहों के डीआरजी काठ के लिए गर्भाशय ग्रीवा इकट्ठा. , 24 अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त DRG न्यूरॉन्स है प्रति प्लेट (52 डीआरजी के बराबर) एक नवजात चूहे के डीआरजी काठ के लिए सभी गर्भाशय ग्रीवा जमा करने के लिए.
    1. Microscissors के माध्यम से परिधीय (तंत्रिका) और डीआरजी का केंद्रीय अनुमानों (जड़) दूर कटौती.
      जगह में अनुमानों छोड़कर विचूर्णन में बाधा उत्पन्न करती है और टी बढ़ जाती हैवह fibroblasts द्वारा संस्कृति का खतरा संदूषण.
  2. सांसद न्यूरॉन्स के लिए, मैन्युअल रूप से छोटी आंत और से अन्त्रपेशी दूर कटौती और ध्यान से छोटी आंत (म. प्र. अलगाव पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, Schäfer एट अल. 9 तक चित्रा 1B देखें) की seromuscular परत बंद पट्टी. सांसद के लिए, 24 अच्छी तरह से थाली में दो चूहों से जाल इकट्ठा.
    नोट: वे छोटी आंत से इसके सफल जुदाई में बाधा के बाद seromuscular परत में आँसू से बचने के लिए संभव के रूप में कोमल बनने की कोशिश करो.
  3. Gentamicin (500ml मध्यम में 20mg) और metronidazol (500 मिलीलीटर मध्यम में 2.5 मिलीग्राम) के साथ आपूर्ति ठंडा न्यूनतम आवश्यक मध्यम में डीआरजी और seromuscular परत (सदस्य) लीजिए.
  4. डीआरजी के संग्रह के बाद 20-30 मिनट के लिए collagenase प्रकार द्वितीय के साथ आपूर्ति की हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) में उन्हें सेते हैं. सांसद अलगाव के लिए, उम्र के आधार पर, 1-3 घंटा के बीच collagenase प्रकार में सेतेपशु (चित्रा 1C) के.
  5. सांसद के लिए, stereomicroscope के तहत शुद्ध की तरह सांसद टुकड़े इकट्ठा करने और ठंडा सदस्य को हस्तांतरण.
  6. तब व्यास में कमी के साथ सीरिंज के माध्यम से डीआरजी और सांसद triturate.
    नोट: अत्यधिक विचूर्णन न्यूरॉन्स को नष्ट, लेकिन कम glia कोशिकाओं कर सकते हैं.
  7. डीआरजी या सांसद युक्त मध्यम 5 मिनट के लिए 93.9 XG पर निलंबन से बादल छाए रहेंगे, अपकेंद्रित्र हो गई है, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.5mm एल glutamine के साथ पूरक Neurobasal मध्यम में मध्यम और resuspend (त्यागें और 2% बी -27).
  8. एक hemocytometer के माध्यम से कोशिकाओं की कुल संख्या (यानी न्यूरॉन्स और glia) गणना.
    नोट: जरूरत कोशिकाओं की संख्या माप पैरामीटर पर निर्भर है. Neurite घनत्व की मात्रा का ठहराव के लिए, एक neurite परिणाम, perikaryonal आकार की माप के लिए की तुलना में सघन संस्कृतियों और इस प्रकार की कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या की जरूरतऔर व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के पैटर्न शाखाओं में बंटी. Neurite घनत्व माप के लिए, जैसे अच्छी तरह से 10,000 कोशिकाओं (न्यूरॉन + glia) / या 1,500 न्यूरॉन्स / अच्छी तरह से इस्तेमाल करते हैं. व्यक्तिगत न्यूरॉन्स, संक्षिप्त (1 मिनट लंबी) कोशिकाओं की trypsination और 2,500 कोशिकाओं / अच्छी तरह से या 400 न्यूरॉन्स / के बोने पर morphometry के लिए अच्छी तरह से सिफारिश की है. एक चूहे से प्राप्त कोशिकाओं के विशिष्ट उपज चारों ओर 300,000-500,000 कोशिकाओं है.
  9. इससे पहले रात लेपित किया गया है जो 13 मिमी coverslips पर कोशिकाओं बीज और (100 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.5 मिमी एल glutamine और 2% बी -27) Neurobasal मध्यम (चित्रा के साथ कुओं में शीर्ष पर -1).
    नोट: उपयोग पाली डी lysine (40 मिलीग्राम / एम 2) या ओर्निथिन और laminin लेपित लेपित (1 मिलीग्राम / एमएल प्रत्येक) कवर फिसल जाता है. प्रकोष्ठों इस प्रकार कई कोशिकाओं की जरूरत है जिसमें प्रयोगों (यानी neurite घनत्व माप) के लिए उपयुक्त बनाने, बहुत तेजी से पाली डी lysine के लिए देते हैं. Laminin को अनुलग्नक सामान्य से कुछ में हैकमजोर क्या, लेकिन laminin neurite परिणाम के एक मजबूत प्रवर्तक है. इसलिए, neuronal शाखाओं में बंटी और neurite लंबाई पर मापन के लिए, ओर्निथिन / laminin कोटिंग पसंद करते हैं.
  10. कोशिकाओं रातोंरात कुओं को देते अनुमति दें. अगले दिन पर, (100 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम निकालने / सतह पर तैरनेवाला एकाग्रता में) निकालने पूरक मीडिया तैयार करते हैं.
  11. बोने मध्यम Aspirate, और पीबीएस के साथ एक वैकल्पिक, बहुत कोमल धोने प्रदर्शन, और फिर धीरे धीरे निकालने / सतह पर तैरनेवाला पूरक मीडिया (चित्रा 1E) पिपेट.
  12. कोशिकाओं 48 घंटे के लिए बढ़ता है. मीडिया aspirate और (चित्रा 1F) immunostaining के लिए 4% paraformaldehyde में तय कर लो.
  13. न्यूरॉन विशेष (जैसे बीटा-III ट्यूबिलिन) और glia विशिष्ट (जैसे glial fibriallary अम्लीय प्रोटीन / GFAP) मार्कर (चित्रा 1G) का उपयोग डबल immunofluorescence धुंधला प्रदर्शन करना.
  14. Morphometry के लिए, संयोजन वाई में एक सीसीडी कैमरे से लैस एक औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोगneurite घनत्व की माप की अनुमति देता है जो स्वचालित सॉफ्टवेयर (तालिका देखें) वें.
  15. neuronal संस्कृतियों के neurite घनत्व एक 50 माइक्रोन x 50 माइक्रोन ग्रिड overlaying और पारस्परिक फाइबर में मापा प्रति वर्ग फाइबर घनत्व की गणना के द्वारा प्रत्येक coverslip पर सघनतम विकास के 4 विभिन्न क्षेत्रों से 200x बढ़ाई 4-5 प्रतिनिधि photomicrographs पर मापा जाता है. Neurite परिणाम, न्यूरॉन प्रति शाखाओं की संख्या मतलब है, मतलब शाखा लंबाई और perikaryonal आकार neurites और perikarya (चित्रा 1H) अंकन द्वारा प्रत्येक coverslip से बेतरतीब ढंग से चुनी 30 एकान्त न्यूरॉन्स से मापा जा सकता है.

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Representative Results

रूपात्मक neuroplasticity

नवजात चूहों (P2-12) और बोने घनत्व का संकेत दिया आयु सीमा में, सांसद और DRG न्यूरॉन्स पहले से ही 48 घंटा (2A चित्रा) के बाद घने neuronal नेटवर्क का निर्माण. पीसीए, सी.पी. में खेती न्यूरॉन्स के बीच neurite घनत्व, और एनपी निष्कर्षों की तुलना एनपी निष्कर्षों में से पीसीए या सी.पी. निष्कर्षों में DRG न्यूरॉन्स की अधिक से अधिक neurite घनत्व (2A चित्रा) 5 से पता चलता है. सांसद न्यूरॉन्स और अधिक आसानी से DRG न्यूरॉन्स से आसपास के glia कोशिकाओं से अलग कर देना करने के लिए करते हैं क्योंकि हम विशेष रूप से, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स पर माप के लिए सांसद न्यूरॉन्स पसंद करते हैं. यहाँ पीसीए या सी.पी. निष्कर्षों में उगाई सांसद न्यूरॉन्स भी अब neurites निर्माण और युक्त एनपी निकालने माध्यम में बढ़ रही सांसद न्यूरॉन्स की तुलना में एक अधिक जटिल शाखाओं में बंटी पैटर्न (चित्रा 2 बी) का प्रदर्शन 5. एनपी, सी.पी., और पीसीए के अर्क से प्रेरित neuronal आकारिकी में इस अंतर का अभाव एक में एक तकनीकी समस्या को इंगित करता हैssay. ज्यादातर मामलों में, इस) की वजह से लंबे समय प्रसंस्करण के लिए या 2) के कारण अलगाव की प्रक्रिया के दौरान हुई कि न्यूरॉन्स को नुकसान करने के लिए तैयार निकालने की खराब गुणवत्ता 1 के कारण हो सकता है.

कार्यात्मक अध्ययन

neuroplasticity परख पूरक अर्क या supernatants में ब्याज की निश्चित लक्ष्य अणुओं की उपस्थिति या अनुपस्थिति से प्रेरित परिवर्तन का पता लगाने के लिए उच्च पर्याप्त संवेदनशीलता भालू. उदाहरण के लिए, NGF के लिए विशिष्ट अवरुद्ध एंटीबॉडी जोड़कर या neuronal नेटवर्क के गठन (चित्रा -2) 10 की क्षीणन में Artemin परिणाम की dynabead प्रेरित कमी से पीसीए सेल से neurotrophic कारक Artemin या तंत्रिका वृद्धि कारक (पीसीसी) supernatants की नाकाबंदी. हाल ही में एक अध्ययन में, हम इस तरह के NGF, glial सेल लाइन deriv के रूप में अन्य neurotrophic कारकों के साथ एक साथ तुलना में सी.पी. में neuroplasticity को neurotrophic कारक Neurturin के योगदान के लिए एक बहुत ही समान प्रभाव दिखा सकता हैएड neurotrophic कारक (GDNF) या बदलने वृद्धि कारक बीटा (TGF-बीटा) 11.

Glia

एक ही दृष्टिकोण भी अग्नाशय microenvironmental सामग्री के लिए डीआरजी जुड़े उपग्रह glia कोशिकाओं या आंतों का glia की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है. दरअसल, डीआरजी या सांसद से जुड़े glia पर पीसीए ऊतक के अर्क का सबसे शक्तिशाली प्रभाव से एक glia की वृद्धि (चित्रा 3) 5 में प्रमुख वृद्धि है. इसके अलावा, इस आशय सी.पी. में से पीसीए में अधिक स्पष्ट है. इधर, एक glia की कि प्रसार पूर्ण glia मोर्चों पर आधारित न्याय, बल्कि न्यूरॉन्स (glia-न्यूरॉन इंडेक्स) glia कोशिकाओं के रिश्तेदार अनुपात पर नहीं किया जाना चाहिए पर विचार करना चाहिए 5. यह न्यूरॉन्स के लिए विरोध के रूप में इन संस्कृतियों में glia कोशिकाओं की संख्या की वजह से glia के प्रसार शक्ति को नियंत्रित करने के लिए और अधिक कठिन है, क्योंकि विचार करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.


चित्रा 1. इन विट्रो neuroplasticity परख के योजनाबद्ध प्रोटोकॉल. उपस्थित परख नवजात चूहे पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) और myenteric जाल (म. प्र.) न्यूरॉन्स neuronal और glial आकारिकी पर अग्नाशय के ऊतकों के अर्क या सेल supernatants के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए का उपयोग करता है. डीआरजी पूर्वकाल laminectomy और लकीर और छोटी आंत के यांत्रिक स्ट्रिपिंग के बाद सांसद युक्त seromuscular परत के बाद एकत्र कर रहे हैं (ए, बी). Collagenase प्रकार द्वितीय पाचन के बाद, न्यूरॉन्स विज्ञापन 24 घंटा (सी, डी) के लिए खेती (विवरण के लिए पाठ देखें) की जरूरत घनत्व में वरीयता प्राप्त हैं. फिर, हौसले से तैयार अग्नाशय (या हित के किसी भी सैनिक अंग से) निष्कर्षों और सेल supernatants पहले से परिभाषित सांद्रता (ई) में न्यूरॉन्स की मध्यम विकास में जुड़ जाते हैं.48 घंटे के बाद, संस्कृतियों 4% paraformaldehyde में तय कर रहे हैं और neuronal और glial मार्कर (च, छ) के खिलाफ डबल immunostained. neurite घनत्व, तंत्रिका शाखाओं में बंटी पैटर्न और perikaryonal आकार सहित neuronal आकारिकी, एक मानकीकृत सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल (एच) के माध्यम से मापा जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. मानव अग्नाशय के कैंसर (पीसीए) और पुरानी pancreatitis (सीपी) द्वारा प्रेरित अग्नाशय neuroplasticity. मानव अग्नाशय के ऊतकों के अर्क शल्य चिकित्सा डीआरजी पूर्वोत्तर के neurite घनत्व में प्रमुख मतभेद प्रेरित सामान्य अग्न्याशय (एनपी), सी.पी. या पीसीए ऊतकों से निकाली गई urons (ए) और सांसद न्यूरॉन्स (बी) के neuronal शाखाओं में बंटी पैटर्न में. इधर, पीसीए और सी.पी. ऊतक अर्क डीआरजी और सांसद न्यूरॉन्स पर एक प्रमुख neurotrophic प्रभाव डालती है. ऊतक के अर्क, व्यक्तिगत प्रकार की कोशिकाओं (यहाँ अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं / पीसीसी) की भी supernatants के लिए इसी प्रकार भी उल्लेखनीय DRG न्यूरॉन्स (सी) के neurite घनत्व में वृद्धि. यह वृद्धि, हालांकि, इस तरह artemin (Artn) या तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) के रूप में चयनित neurotrophic कारकों समाप्त हो या इन supernatants साथ अवरुद्ध कर रहे हैं जब प्रतिवर्ती है. सभी न्यूरॉन्स बीटा-III ट्यूबिलिन के खिलाफ immunostained. 100X बढ़ाई सभी छवियों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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चित्रा 3. अग्नाशय microenvironmental सामग्री के लिए Glial प्रतिक्रिया. अग्नाशय पीसीए से ऊतक के अर्क या सी.पी. ऊतकों एक neurotrophic प्रभाव है, लेकिन यह भी डीआरजी या सांसद संस्कृतियों में glial विकास और glial कोशिकाओं की गिनती बढ़ाने के लिए न केवल. Glia कोशिकाओं glia मार्कर glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के खिलाफ immunostained. 200X बढ़ाई सभी छवियों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल हाल ही में पीसीए और सी.पी. 5 में neuroplasticity के तंत्र का अध्ययन करने के लिए हमारे समूह द्वारा विकसित किया गया था, जो इन विट्रो अग्नाशय neuroplasticity परख के पीछे कार्यप्रणाली को वर्णन करने का इरादा है. प्रोटोकॉल कलाकार डीआरजी और सांसद न्यूरॉन्स के अलगाव और संस्कृति में पर्याप्त अनुभव प्राप्त किया है एक बार आसानी से लागू किया जा सकता है, जो तीन दिन की प्रक्रिया शामिल है. इसके अलावा, यह अग्नाशय microenvironmental घटकों को आंतों और डीआरजी जुड़े glia की सहवर्ती प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.

हमारी राय में, इस परख का सबसे दिलचस्प सुविधाओं में से एक एक इन विट्रो में सरलीकृत सेटिंग में पीसीए और सीपी (यानी तंत्रिका अंकुरण और अतिवृद्धि) के दौरान होने वाले परिवर्तन का पता लगाने और अनुकरण करने की क्षमता है. दरअसल, डब्ल्यू neuronal आकारिकी में परिवर्तन में ऊतक के अर्क या सेल supernatants परिणामों के आवेदनhich व्यवस्थित morphometric विश्लेषण के माध्यम से पर्याप्त संवेदनशीलता के साथ पता लगाया जा सकता है. हाल ही में, हम भी इस परख भी एक साथ तुलना में कई कैंसर संस्थाओं की neurotrophic क्षमता में अंतर का पता लगाने के लिए संवेदनशील है कि प्रदर्शन कर सकता: पीसीए सेल लाइनों की neurotrophic विशेषताओं कोलोरेक्टल कैंसर से सेल लाइनों की तुलना में किया गया था, पीसीए सेल लाइनों काफी प्रेरित कोलोरेक्टल कैंसर लाइनों 8 से DRG न्यूरॉन्स के बीच अधिक से अधिक neurite घनत्व. यहां तक कि पेट के कैंसर कोशिका लाइनों बनाम मलाशय की तुलना में पेट के कैंसर कोशिका लाइनों उनके तंत्रिकाजाल संभावित 8 के संदर्भ में मलाशय के कैंसर की कोशिकाओं को नीचा थे.

इस परख के प्रमुख लाभ में से एक अपनी ही नहीं morphometric के लिए आसान पहुंच, लेकिन यह भी electrophysiological विश्लेषण है. परिभाषित मीडिया के भीतर हमारे परख में न्यूरॉन्स से टुकड़ा तैयारी, रिकॉर्डिंग में या एक में सीटू न्यूरॉन्स में करने का विरोध कियापरिभाषित कारकों की bsence / अधिक उपस्थिति तकनीकी रूप से मांग नहीं कर रहे हैं और neuronal गतिविधि पर इन microenvironments में चयनित अणुओं की भूमिका पर बहुमूल्य जानकारी दे सकते हैं.

निश्चित रूप से, प्रस्तुत परख केवल अग्नाशय neuroplasticity से संबंधित सवालों का अध्ययन करने के लिए प्रतिबंधित किया जा माना नहीं होना चाहिए. Neuroplasticity ऐसे भड़काऊ आंतों का न्यूरोपैथी 1-3 के रूप में रोग की स्थिति, के तहत पूरे सैनिक पथ की एक प्रमुख विशेषता है. इन सभी स्थितियों स्फूर्तिदान आकारिकी और बदल neuronal गतिविधि 1-3 में परिवर्तन के साथ जुड़े होने की सूचना मिली. इसलिए, यह इसी ऊतकों से निकाली गई उन से अग्नाशय के ऊतकों के अर्क या सेल लाइनों की जगह और न्यूरॉन्स और साथ glia पर उनके विशिष्ट प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बोधगम्य है. अग्नाशय और कोलोरेक्टल कैंसर के ऊतकों की तुलना पर हमारे हाल के विश्लेषण में इस धारणा 8 का समर्थन है. हालांकि, यह भी assum प्रशंसनीय हैहम नियमित रूप से अग्नाशय के ऊतकों घटकों में निरीक्षण के रूप में विभिन्न ऊतकों microenvironments के घटकों के रूप में संवेदनशील और प्रतिनिधि परिवर्तन के लिए प्रेरित नहीं कर सकता है कि ई. इसलिए, हम "नकारात्मक" नियंत्रण ऊतकों (यानी तंत्रिका अतिवृद्धि के लिए कोई ऊतकीय सबूत के साथ) बनाम "सकारात्मक" नियंत्रण ऊतकों (जैसे histologically प्रदर्शन किया तंत्रिका अतिवृद्धि के साथ यानी ऊतकों) द्वारा प्रेरित neuronal आकारिकी के पिछले व्यापक मूल्यांकन सलाह देते हैं.

इस परख में glia की प्रतिक्रिया पर हमारे पूर्व विश्लेषण अलग अग्नाशय microenvironments में glial कोशिकाओं की गिनती के निर्धारण तक ही सीमित थे. Glia कोशिकाओं उनके तंत्रिकाजन्य क्षमता की मान्यता और glial झिल्ली 12 के साथ कैल्शियम धाराओं में वृद्धि हुई ब्याज के बाद से तंत्रिका जीव विज्ञान में उभरते महत्व के अधिकारी. इसलिए, इस परख में glia कोशिकाओं को भी आगे कार्यात्मक विश्लेषण करने के लिए आसानी से उपलब्ध हैंउपन्यास दृष्टिकोण से. हालांकि, इस तरह के अतिरिक्त नवीन दृष्टिकोण आगे की पढ़ाई के लिए अपने आवेदन करने से पहले पिछले व्यापक सत्यापन की जरूरत है.

किसी भी अन्य प्रयोगात्मक परख तरह, यह भी प्रस्तुत neuroplasticity परख सर्जरी के दौर से गुजर विभिन्न रोगियों से प्राप्त मानव ऊतकों के नमूनों में से कुछ सीमित तुलनात्मकता भालू. इन ऊतकों विश्वसनीय विश्लेषण 1 के लिए (मुख्य ट्यूमर जन से जैसे अग्नाशय के सिर,) एक ही ऊतक क्षेत्रों से प्राप्त किया जा करने के लिए यह जरूरी है. इसके अलावा, यह शर्त पूरी हो जाती है, तब भी जब ऊतक या ट्यूमर जीव विज्ञान में आगे मतभेद अलग व्यक्तियों 1 के जैविक प्रतिक्रिया पैटर्न में बड़े बदलाव पर विचार अपवर्जित नहीं किया जा सकता. इकाई प्रति 10 विभिन्न रोगियों - इन व्यक्तिगत ऊतक मतभेदों को दरकिनार करने के लिए, हम कम से कम 5 से यानी, संभव के रूप में कई रोगियों से प्राप्त ऊतकों के साथ परख के प्रदर्शन की सिफारिश.

एक महत्वपूर्ण तकनीकी पहलू के रूप में, हम neuronal विकास पर कोटिंग पदार्थों की भूमिका की ओर ध्यान आकर्षित करना चाहूंगा. जैसा कि ऊपर उल्लेख हुआ, हम neurite घनत्व पर माप के लिए पाली डी lysine पसंद करते हैं, और व्यक्तिगत neuronal शाखाओं / परिणाम तर्ज पर उन लोगों के लिए ओर्निथिन / laminin कोटिंग. Neuronal परिणाम की माप भी पाली डी lysine से ढके सतहों पर किया जा सकता है, जबकि हमारे हाथ में है, हम इस दृष्टिकोण वास्तविक अंतर के लिए परख की संवेदनशीलता को कम करने के लिए जाता है कि लगता है. इसलिए, इस परख लागू करने के शोधकर्ताओं के हित के अपने प्रश्न के लिए इष्टतम कोटिंग सामग्री का उपयोग सुनिश्चित करना चाहिए.

संक्षेप में, हम के उदाहरण में प्रदर्शन के रूप में प्रस्तुत neuroplasticity परख, न्यूरो आकारिकी और विभिन्न ऊतकों microenvironments में न्यूरो समारोह पर तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जानकारी प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है का मानना ​​है किअग्नाशय के ऊतकों. अलग अग्नाशय के ऊतकों सामग्री द्वारा प्रेरित के रूप में न्यूरो आकारिकी में मतभेद के संवेदनशील पता लगाने मानव पीसीए और सीपी में अग्नाशय neuroplasticity की इन विट्रो reproducibility रेखांकित करता है. भविष्य के प्रयासों लागू supernatants के अनुकूलित preassay स्क्रीनिंग का उद्देश्य और सैनिक रोग जुड़े neuroplasticity के अध्ययन के लिए सबसे अच्छा परिभाषित मीडिया को प्राप्त करने के लिए निकालता जाएगा.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा हितों और कोई वित्तीय खुलासे की है.

Acknowledgments

सभी लेखकों प्रस्तुत परख की स्थापना और मान्यता की दिशा में और पांडुलिपि के मसौदे के लिए योगदान दिया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1149
Ornithine/laminin Sigma-Aldrich P2533/L4544
13 mm Coverslips Merck For use in 24-well plates
Dismembranator S Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin antibody Millipore MAB1637 1:200 concentration
Anti-GFAP-antibody DAKO M0761 1:400 concentration
RIPA buffer + protease inhibitor Any supplier
Neurobasal medium Gibco/Life Sciences 21103-049
B-27 Supplement Gibco/Life Sciences 17504044 Quality of B-27 is known to depend on the lot number
Gentamicin/Metronidazol Any supplier
Minimal essential medium Gibco/Life Sciences 31095-029
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Sciences 24020133 Improves collagenase activity when containing Ca/Mg
Collagenase type II Worthington Biochemical CLS-2 Obtain lots with at least 200 U/mg activity
Trypsin-EDTA 0.25% Gibco/Life Sciences 25200056
4% Paraformaldehyde Any supplier
analySIS docu software Olympus

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References

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चिकित्सा अंक 86 स्वायत तंत्रिका तंत्र रोग पाचन तंत्र अर्बुद जठरांत्र रोगों अग्नाशय के रोगों अग्नाशय अर्बुद अग्नाशयशोथ अग्नाशय neuroplasticity पृष्ठीय रूट ganglia myenteric जाल Morphometry neurite घनत्व neurite शाखाओं में बंटी perikaryonal अतिवृद्धि neuronal plasticity
अग्नाशय Neuroplasticity अनुकरण:<em&gt; इन विट्रो</em&gt; दोहरे न्यूरॉन Plasticity परख
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Demir, I. E., Tieftrunk, E.,… More

Demir, I. E., Tieftrunk, E., Schäfer, K. H., Friess, H., Ceyhan, G. O. Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay. J. Vis. Exp. (86), e51049, doi:10.3791/51049 (2014).

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