利用反向酵母双杂交系统鉴定与配体和/或拮抗剂相互作用的哺乳动物核受体残基

摘要

酮康唑可结合并拮抗妊娠X受体（PXR）的活化。通过酵母高通量筛选PXR突变体，确定了酮康唑结合的独特区域。这种基于酵母的遗传学方法可发现核受体与配体之间的新型相互作用，这些配体结合于受体表面的结合位点。

摘要

作为药物代谢和炎症的关键调节因子，妊娠X受体（Pregnane X Receptor, PXR）在连接代谢与炎症的疾病病理生理过程中发挥重要作用（例如 肝脂肪变性）^1,2。目前在PXR激动剂配体的鉴定方面已取得诸多进展，然而关于具有药物特性的拮抗剂及其在PXR上的结合位点的描述仍十分有限^3,4,5。一个关键障碍在于难以高效纯化全长PXR蛋白以进行拮抗剂的结构研究，尽管PXR早在1998年就已被克隆和表征。本实验室开发了一种基于酵母的新型高通量双杂交检测方法，用于确定拮抗剂酮康唑（ketoconazole）在PXR上的结合残基⁶。该方法通过构建突变文库，筛选能够挽救位于PXR AF-2表面单个突变（预期与酮康唑相互作用）效应的二次突变。通过引入“功能获得性”二次突变"gain-of-function"，可合理推断酮康唑与PXR表面残基之间的遗传相互作用。因此，我们建立了一种针对PXR突变体与其共激活因子SRC-1相互作用的高通量酵母双杂交筛选方法。通过该方法，并对酵母系统进行改造以适应抗真菌药物酮康唑的研究，我们能够鉴定出在无法与酮康唑结合的克隆中富集的PXR特异性突变。通过逆向逻辑分析，我们推断原始残基即为与酮康唑直接相互作用的位点。该检测方法代表了一种新颖且可行的遗传学手段，可用于筛选核受体表面的拮抗剂结合位点。该方法可适用于任何药物，无论其对酵母是否具有细胞毒性，也可用于无法通过常规结构生物学或基于蛋白质组学方法研究的细胞蛋白。潜在局限性包括数据解读（建议结合互补方法）、对单一酵母双杂交技术的依赖、操作酵母或执行酵母双杂交实验所需的专业技能，以及实验条件的优化。

引言

酵母双杂交（Y2H）实验被广泛用于发现蛋白质-蛋白质相互作用，近年来也被用于筛选可破坏蛋白质-蛋白质相互作用复合物的新型小分子 ^{7, 8, 9, 10, 11}然而，该检测的传统方法在药物发现中的应用 "命中数"，无法检测蛋白质-蛋白质相互作用界面上化学化合物的变构相互作用残基，这些残基在发生改变后仍能保持相互作用，并允许对已改变的残基进行分析¹¹的确，如果能够开发出此类方法，将可建立一个易于操作的酵母系统，用于高通量评估对蛋白-蛋白相互作用破坏至关重要的变构相互作用残基。在药物发现背景下，确定化合物与蛋白质相互作用的最直接方法是通过结构解析例如 蛋白质-抑制剂复合物的结晶）。这些方法繁琐，需要复杂的资源，且在技术上难以对每一种蛋白质都进行结构研究。

在细菌^{1, 2}及其他模式系统（如哺乳动物双杂交系统）中已建立可操作的遗传学药物筛选体系。然而，这些系统仍需优化，而像酵母双杂交（Y2H）这样的替代系统在药物发现中仍是应用最广泛的。现有方法存在诸多局限性，例如单一方法在检测相互作用时敏感性和可靠性较差¹³；不过，单个Y2H实验可通过改造用于探究特定相互作用残基的问题。在核受体研究领域，Y2H已被用于鉴定相互作用蛋白¹⁴，但这些蛋白相互作用极少被用于阐明配体/拮抗剂与核受体-蛋白复合物之间相互作用的性质。因此，本实验室致力于开发一种....

方案

1. 在酵母载体中构建PXR和SRC-1融合蛋白

1. 人PXR配体结合结构域（107-434氨基酸）及人SRC-1全长（1-1401氨基酸）的PCR扩增
   1. 使用 pSG5-hPXR 质粒⁸ 以PXR LBD为模板，使用pCMX-SRC1质粒作为SRC-1的模板。
   2. 解冻PCR SuperMix、DNA模板和引物（见材料部分），并置于冰上保存。
   3. 加入0.25 μ克/μl DNA 模板 1 μl，10 mM 引物对 2 μ每份 45 微升，PCR SuperMix μl 并加入 H₂O 以总体积补至 50 μl.
   4. 设置PCR程序为94℃一个循环 °C，2 分钟，20 个循环：94 °C，30 秒，55 °30 秒，37°C 和 72 °C 2分钟，然后一个72 °10 分钟，C 用于延伸。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
2. 将PCR产物克隆至Y2H载体
   1. 从1%琼脂糖凝胶中纯化PCR产物。用BamHI和SalI酶切PXR、LBD、PCR和Y2H载体pSH2-1；用NotI酶切SRC-1 PCR和Y2H载体pGADNOTΙ 和 SalΙ。为此，加入1 μ基因组....

结果

我们进行了一项检测，以观察是否能够检测到PXR与类固醇受体共激活因子-1（SRC-1）相互作用的比色读数。由于酵母具有显著的甾醇合成能力，先前已有研究表明，酵母中的lacZ表达可在无需额外外源性配体的情况下被诱导。我们发现，在转入PXR和SRC-1的酵母菌株中，lacZ表达（蓝色菌落）也被诱导；然而，在仅转入空载体、单独PXR或单独SRC-1的酵母中，未出现LacZ表达的诱导（白色菌落）（图3）。为了确定酮康唑（25 μM）是否在酵母中破坏PXR与SRC-1的相互作用，我们将含有酮康唑的复制平板用硝酸纤维素膜浸泡，并进行了X-gal滤膜提升实验以及β-半乳糖苷酶液体活性检测。结果显示，酮康唑可破坏酵母中PXR与SRC-1的相互作用，因为复制滤膜上的所有菌落均变为白色（液体酶学检测也显示β-半乳糖苷酶活性显著降低）（图4A）。我们此前在哺乳动物系统检测中已证明，PXR突变体（T248E/K277Q）可被强效配体（例如 利福平）激活，但对酮康唑的拮抗作用具有抗性¹⁷。类似地，当我们在酵母质粒中构建PXR双突变体（.......

讨论

在我们改进的酵母双杂交实验中，已鉴定出PXR上对酮康唑相互作用至关重要的残基⁶。由于SRC-1是一种共激活因子（并被克隆至pGADNot载体中），我们还检测了当SRC-1被克隆到pSH载体系统中时是否仍能激活lacZ表达，以及这是否会改变激活谱和/或影响酵母双杂交实验的本底表达水平。利用重新设计的质粒，我们在erg3Δ/erg11Δ酵母菌株中进行了双杂交实验。与之前结果一致，我们发现转入PXR和SRC-1的erg3Δ/erg11Δ酵母菌株中lacZ表达（蓝色菌落）同样被诱导；然而，在仅转入空载体、单独PXR或单独SRC-1的酵母中未观察到LacZ表达的诱导（白色菌落，数据未显示）。我们的方法为分离那些难以通过传统结构生物学和/或蛋白质组学方法研究的蛋白质的变构配体-蛋白质相互作用相关残基，提供了一种强大而新颖的技术途径^5,21。

所述方案存在若干必须注意的缺陷。首先，检测的灵敏度，特别是对蛋白质-蛋白质相互作用残基上部分拮抗效应的检测，可能会限制该检测方法的分辨率。比.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酵母菌株 CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ	我们的实验室		CTY10-5d 酵母菌株进行了双基因敲除 ERG3 和 ERG11 (erg3Δ/erg11Δ基因6 .
YPD培养基	BD 生物科学	630409
Difco 酵母氮源基础培养基（YNB），不含氨基酸和硫酸铵	BD 生物科学	233520
Bacto 琼脂	BD 生物科学	214010
CSM-His/-Leu 完全补充剂混合物	MP Biomedicals	4250-412
ONPG（邻硝基苯基-β-半乳糖苷） Β-D-半乳吡喃糖苷)	Sigma-Aldrich	N1127
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
Luria肉汤（LB）	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Fisher	BP-1615
超声处理的鲑鱼精子DNA煮沸（10 mg/ml）	Life Technology	156-017
氨苄青霉素	Acros Organics	61177
酮康唑	Sigma-Aldrich	K1003
N,N-二甲基甲酰胺	Acros Organics	326871000
乙酸锂	Sigma-Aldrich	L4158
50% PEG-3350 溶液，滤膜除菌	Sigma-Aldrich	P-3640
硝酸纤维素膜	Whatman	10402091
10 cm 培养皿	Fisher	875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'	我们的实验室		PXR LBD 用于 pSH2-1 的正向引物
5'-AGAGTCGACTCAGCTACCTGTGATGCC-3'	我们的实验室		PXR LBD 反向引物（用于 pSH2-1）
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'	我们的实验室		SRC-1 用于 pGADNOT 的正向引物
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'	我们的实验室		pGADNOT 的 SRC-1 反向引物
Platinum PCR Supermix	Invitrogen	11306-016
BamHI	我们的实验室	R0136
SalI	我们的实验室	R0138
NotI	我们的实验室	R0189