Summary
Кетоконазол связывается и противодействует прегнановых X рецептор (ПРИ) активации. Дрожжи высокой пропускной экраны PXR мутантов определить уникальный регион для связывания кетоконазол. Этот генетический метод дрожжей на основе обнаруживает новые взаимодействия ядерных рецепторов с лигандами, которые связывают с поверхности участков связывания.
Abstract
В критической регулятора метаболизма лекарств и воспаления, прегнан Х-рецептора (ПРИ), играет важную роль в патофизиологии болезни обмена веществ, связывающую и воспаление (например, стеатоза печени) 1,2. Там был достигнут значительный прогресс в идентификации агонистов лигандов для ПРИ, однако, есть ограниченные описания наркотиками как антагонистов и их сайтов связывания на PXR 3,4,5. Критический барьер была неспособность эффективно очистить полнометражный белка для структурных исследований с антагонистами, несмотря на то, что ПРИ клонировали и характеризуется в 1998 году. Наша лаборатория разработала новую высокую пропускную дрожжи основе двугибридная анализа определить антагонист, кетоконазол х, связывания остатков на ПРИ 6. Наш метод включает в себя создание мутационные библиотеки, которые бы спасти эффект одиночных мутаций на AF-2 поверхности ПРИ ожидается, взаимодействовать с кетоконазол. Спасение или «усиления из-функции" вторй мутации могут быть сделаны таким образом, что выводы о генетическом взаимодействии кетоконазол и поверхностного остатка (ов) на ПРИ осуществимы. Таким образом, мы разработали высокую пропускную двухгибридного дрожжей экран PXR мутантов, взаимодействующих с ее коактиватора, SRC-1. Используя этот подход, в которых дрожжи был изменен, чтобы приспособить изучение противогрибкового препарата, кетоконазол, мы могли бы продемонстрировать специфические мутации на ПРИ обогащенные клонов не могли связать с кетоконазол. По обратной логике, мы приходим к выводу, что первоначальные остатки являются прямыми остатки взаимодействия с кетоконазолом. Этот анализ представляет собой роман, послушный генетический анализ для скрининга антагонистов сайтов связывания на поверхности ядерного рецептора. Этот анализ может быть применен к любому препарату независимо от его цитотоксического потенциала для дрожжей, а также клеточного белка (ов), которые не могут быть изучены с помощью стандартного структурной биологии или протеомических на основе методов. Потенциальные ловушки включают интерпретацию данных (нетрадиционные методы полезны), надежAnce на одного метода Y2H, опыт в обращении с дрожжей или выполнение дрожжей двух гибридных анализов и оптимизации анализа.
Introduction
Дрожжи двугибридная (Y2H) анализ широко используется, чтобы обнаружить белок-белковых взаимодействий и совсем недавно для открытия новых малых молекул, которые разрушают белок-белковых комплексов взаимодействия 7, 8, 9, 10, 11. Однако обычные подходы этом анализе используется для лекарственных препаратов или "попаданий", не позволяют для обнаружения аллостерических остатков химических веществ взаимодействия соединений в белок-белковых поверхности, что, когда изменяется еще взаимодействовать и позволяют опроса измененных остатков 11 . В самом деле, такой способ (ы), если это возможно, чтобы развиваться, позволило бы сговорчивым систему дрожжей для оценки высокой пропускной аллостерических остатков взаимодействия критических для нарушения взаимодействия белок-белок. В контексте открытия новых лекарств, наиболее прямой путь для установления взаимодействия соединений с белками предполагает структурную определение (например Кристаллизация белок-ингибитор комплекса). Эти методы дипломbersome, использовать сложные ресурсы, и это технически невозможно выполнить структурные исследования по каждой белка.
Сговорчивым системы генетического скрининга наркотиков были созданы в бактериях 1, 2 и других модельных систем, как млекопитающих двугибридная. Тем не менее, эти системы должны оптимизацию и альтернативные системы, такие как Y2H-прежнему являются наиболее протестирован в лекарственных препаратах. Существуют ограничения, которые включают слабую чувствительность и надежность взаимодействия с использованием особых методов 13, однако, один Y2H анализ может быть изменен, чтобы ответить на конкретные вопросы, касающиеся остатков взаимодействия. В области исследований ядерной рецепторов, Y2H был использован для определения взаимодействующих белков 14, однако, эти белковые взаимодействия редко используется для определения характера, в которых лиганды / антагонисты взаимодействуют с ядерными рецептор-белковых комплексов. Таким образом, наша лаборатория сосредоточены усилия на определении метода, особенно для белков-рецепторов, которые нелегко поддаются протеомные методы, основанные, что бы раскопать роман лиганд / антагониста, взаимодействующих остатков с использованием обратной Y2H основе платформу открытия.
Основываясь на нашем предыдущем открытии, что кетоконазол нарушает PXR и его активатор SRC-1, мы разработали роман обратного Y2H систему, которая позволит нам определить и допросить кетоконазол взаимодействующих остатков на ПРИ 6. Наша методика основана на свойствах белка GAL4 дрожжей, который состоит из отделимых областей, отвечающих за активацию ДНК-связывающего и транскрипции. Белок PXR LBD выражается в виде гибрида к LexA ДНК-связывающий домен (ДНК-BD), в то время как по всей длине Соактиваторы SRC-1 (стероид коактиватор рецептор 1) белки экспрессируются в виде слитых с доменом активации GAL4 (AD ). Взаимодействие между ПРИ и SRC-1 слитых белков приводит к транскрипционной активации GAL4-связывающие сайты, содержащие репортерный ген β-Lac Z, который интегрирован в геноме дрожжейэ. Кетоконазол, антагонист PXR, нарушает PXR и SRC-1 взаимодействие 15, 16, 17, и мы можем детектировать взаимодействие ПРИ и SRC-1 в присутствии или в отсутствие кетоконазол после окрашивания колонии на фильтров для X-гал активности. Принцип Y2H иллюстрируется на рисунке 1 и экспериментальная процедура показаны на рисунке 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Строительство ПРИ и SRC-1 Fusions в дрожжевые векторы
- ПЦР-амплификации человеческого PXR ДТЛ (107-434 аминокислот) и человека SRC-1 полной длины (1-1401 аминокислот).
- Используйте pSG5-hPXR плазмиды 8 как ПРИ LBD шаблона, используйте PCMX-SRC1 плазмиды как SRC-1 шаблонов.
- Оттепель ПЦР SuperMix, ДНК-матрицы и праймеры (см. материалы), держать их на льду.
- Добавить 0,25 мкг / мкл матричной ДНК 1 мкл, 10 мМ пары праймеров 2 мкл каждый, ПЦР SuperMix 45 мкл и добавить H 2 O, чтобы довести общий объем до 50 мкл.
- Набор ПЦР на один цикл при 94 ° С в течение 2 мин, 20 циклов при 94 ° С в течение 30 сек, 55 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 2 мин, а затем один цикл при 72 ° С в течение 10 мин для расширения. Проверка продуктов ПЦР, запустив на 1% агарозном геле.
- Продукты ПЦР клонирования в Y2H векторов.
- Очищают продуктов ПЦР с 1% агарозном геле. Дайджест ПРИ, ДТЛ, ПЦР и Y2H вектор pSH2-1 сBamHI и SalI; переварить SRC-1 ПЦР и Y2H вектор pGADNOT с NotΙ и SalΙ. Чтобы сделать это, добавьте 1 мкг ДНК, 3 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл ферменты рестрикции, и, наконец H 2 O, чтобы принести общий объем до 30 мкл.
- Положите образцы пищеварения в 37 ° С водяной бане в течение 1 часа. Проверка на пищеварение работает на 1% агарозном геле.
- Очищают образцы пищеварения от 1% агарозном геле, переваривали перевязывать продуктов ПЦР и Y2H векторы и преобразования, чтобы компетентных клеток DH5б.
- Выберите колонии и изолировать ДНК плазмиды.
- Определить pSH2-1-PXR ДНК плазмиды по BamHI / SalI пищеварения, определить pGADNOT-SRC-1 ДНК плазмиды на NotI / SalI пищеварения. Проверьте весь положительный ДНК плазмиды путем секвенирования.
2. Дрожжи двугибридная Анализы
- Инокуляции штамма дрожжей в 5 мл YPAD и инкубировать в течение ночи при постоянном перемешивании (220 оборотов в минуту при 30 ° С). Примечание: Штамм Saccharomyces CEREVISIAE был CTY10-5d(MAT ade2 ГТО 1-901 leu2-3, 112 his3-200 га L4 - gal80 - URA3 :: Lexa-LacZ), который содержит интегрированный ген GAL1-LacZ с Lexa оператора 10. Для получения жизнеспособных дрожжевых клеток, устойчивых к кетоконазол, но те, которые не несут транспортера изменения в качестве причины азольного сопротивления 18-20 новых штаммов CTY10-5d дрожжей были получены предварительного удаления ERG3 (erg3 Δ), а затем введения дополнительного удаления в ERG11 (erg3 Δ / erg11 Δ) гены путем гомологичной рекомбинации. Конструктивные детали были описаны в ранее опубликованной рукописи 6.
- На следующий день (утром), привить дрожжи (1:20) в 5 мл YAPD и инкубировать, чтобы получить OD 600 ~ 0,2 на постоянном перемешивании (220 оборотов в минуту при 30 ° С).
- Гранул клеток при 2000 оборотах в минуту в микроцентрифуге в течение 2 мин и отбросить супернатант. Затем промыть Pelleт дважды автоклавного водой и один раз 0,1 М LiAc.
- После последней промывки, отбросить супернатант и добавьте следующие реагенты к осадку клеток: 240 мкл ПЭГ 3500 50% вес / объем, 36 мкл 1 М LiAc, 50 мкл 2 мг / мл кипяченой одноцепочечной ДНК спермы лосося, H 2 O 34 мкл. Vortex перемешать, добавить 1 мкг ПШ-PXR и 1 мкг pGADNOT-SRC-1 ДНК и перемешать.
- Перенести смесь с полистиролом с круглым дном трубки, агитировать преобразование, смешать (220 оборотов в минуту при 30 ° С) в течение 30 мин. Перемещение трубки 42 ° С на водяной бане и инкубируют в течение еще 30 мин.
- Центрифуга трубки при 2000 оборотах в минуту в течение 2 минут и удалить супернатант. Вымойте гранул один раз автоклавного воды.
- Внесите 100 мкл стерильной воды в трубку, вновь приостановить клеток путем легкого пальцем разговоров и пипетки, затем пластину на пластинах -His/-Leu Dropout Medium (композиции на один литр -His/-Leu Dropout Medium: 20 г декстрозы, 1,7 г YNB, 0,67 г CSM-His/-Leu, 5 г сульфата аммония, 1,5% агар) и вклUbate при 30 ° С в течение 3-4 дней, чтобы изолировать трансформантов.
3. X-гал фильтр Анализ
- Cut нитроцеллюлозную мембрану с размером части чашке Петри. Этикетка нитроцеллюлозную мембрану, чтобы отметить ориентацию.
- Поместите premarked на нитроцеллюлозную мембрану дрожжевых колоний, убедитесь, что мембрана находится в контакте с поверхностью пластины среде.
- Удалить мембрану, поместите его колонии стороной вверх на 3 мм фильтровальной бумаги и поместите мембрану и фильтровальную бумагу при -80 ° С в течение 15 мин.
- Сделать X-гал решение. Добавить 50 мкл 20 мг / мл X-Gal и 15 мкл β-меркаптоэтанола в 5 мл Z-буфера (1 л буфер содержит 16,1 г Na 2 HPO 4 7H 2 O, 5,5 г NaH 2 PO 4 H 2 O, 0,75 г KCl, 0,25 г MgSO 4 • 7H 2 O). Если Z буфера выдерживали при 4 ° С, довести его до комнатной температуры перед добавлением этих реагентов.
- Поместите два круга 3 мм фильтровальной бумагив чашку Петри и впитать их с 5 мл X-гал раствора. Слейте избыток буфера от чашки Петри и поместите нитроцеллюлозную мембрану с колонии стороной вверх.
- Закройте крышку, убедитесь, что мембрана делает полный контакт с фильтровальной бумаги, и это полностью мокрой. Обертка чашку Петри в фольгу и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин в течение ночи.
4. Жидкость Анализ β-гал
- Расти дрожжи в жидкой среде -His/-Leu Dropout к OD 600 0,7.
- Передача 1 мл среды в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге при 3000 оборотах в минуту в течение 2 мин. Удалите супернатант.
- Добавьте 1 мл Z-буфером, чтобы ресуспендируют осадок, центрифуги при 3000 оборотах в минуту снова в течение 2 мин. Удалите супернатант.
- Добавить 150 мкл Z-буфером с 2ME чтобы ресуспендируют осадок клеток, смешать затем добавить 50 мкл хлороформа и 20 мкл 0,1% SDS. Энергично вихрь образец в течение 15 сек.
- Добавить 700 мкл ONPG решения (1 мг / мл в Z BUFфер). Установка таймера, инкубировать при 30 ° С достаточно долго, чтобы позволить желтый цвет разработать и отметить общее время реакции.
- Добавить 500 мкл 1 М Na 2 CO 3, чтобы остановить реакцию, и определить оптическую плотность при 420 нм. Заготовка решение ONPG 700 мкл плюс 500 мкл 1 М Na 2 CO 3.
Рассчитать Миллер единиц следующим образом: Миллер Единицы = (A420 * 1000) / (A600 * мин * мл)
A420: единиц поглощения при 420 нм; A600: единиц поглощения в 600 нанометров; мин: время реакции в минутах; мл: реакционного объема в мл
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы провели анализ, чтобы убедиться, что мы могли обнаружить колориметрического считывание ассоциации ПРИ и стероидного рецептора коактиватор-1 (SRC-1). Поскольку дрожжи имеет значительный производства стерола, это ранее было показано, что LacZ экспрессии в дрожжах могут быть вызваны без необходимости дополнительного экзогенного лиганда. Мы обнаружили, что LacZ выражение (голубые колонии) также индуцируется в дрожжевой штамм трансформированного ПРИ и SRC-1, однако нет индукция LacZ выражения (белые колонии) в дрожжи, трансформированные с пустыми векторов, ПРИ или SRC-1 отдельности (рис. 3). Чтобы определить, является ли кетоконазол (25 мкм) нарушен PXR и SRC-1 взаимодействие в дрожжах, реплики планшеты, содержащие кетоконазол были пропитаны нитроцеллюлозы и X-гал фильтра, лифт, и были выполнены жидкие анализы β-галактозидазы. Мы покажем, что кетоконазол нарушает ПРИ и SRC-1 взаимодействий в дрожжах, так как все колоний от реплик фильтра были теперь белый (который былПоказано также, по значительно сниженной β-галактозидазы жидкими ферментативных анализов) (фиг.4А). Мы ранее показали в анализах млекопитающих, что ПРИ мутант (T248E/K277Q) могут быть активированы сильным лиганда (например рифампицин), но не застрахован от антагонистических эффектов кетоконазол 1 7. Точно так же, когда мы проектировали PXR двойной мутант (T248E/K277Q) в дрожжевой плазмиды, а затем выполняется дрожжевых преобразований с SRC-1, мы смогли показать, что колонии подвергаются кетоконазол по-прежнему сохраняют LacZ выражение (рис. 4б).
Рисунок 1. Схему, иллюстрирующую принципы дрожжевой двухгибридной (Y2H) анализа. Дрожжи анализ был создан в качестве функционального анализа, который позволяет для изоляции PXR мутантов, которые стойкиет кетоконазол, опосредованного ингибирования SRC-1 взаимодействия., рифампицин-индуцированной двугибридная взаимодействие LexA-DB-hPXR слитого белка с SRC-1, слитого с доменом активации GAL4-(GAL4AC-SRC-1). Результаты взаимодействия в синих колоний в Х-гал анализа из-за репортера LacZ. B, наличие кетоконазол нарушает рифампицин-индуцированной взаимодействие hPXR с SRC-1. X-Gal результаты анализа в белых колоний. C, наличие мутации (указаны звездочками) в hPXR, которая делает его невосприимчивым к действию кетоконазол даст синий колонии. D, дополнительную модификацию нашего анализа в будущем может включать дополнительные второго мутации сайт супрессоров (иллюстрированные полумесяца) сводит на нет эффект первой мутации, которая может привести к срыву hPXR-SRC-1 взаимодействия и, следовательно, белой колонии в X-гал анализа. LexAOp, LexA Оперон; Galp, Gal4 промоутер, Лак Z, бета-glalactosidase; DB, LexAOp ДНК-связывающий домен Galp; AC, актдомен ivation; *, мутация (ы). (Воспроизводится по ссылке 6). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Экспериментальная Блок-схема.
Рисунок 3. X-гал, лифт анализ и β-гал жидкость анализ. Дрожжи трансформировали указанных плазмид и высевали колоний, подверженных X-гал подъема теста (слева) и β-гал жидкого теста (правая панель). PSH пустой вектор + pGADNOT пустой вектор (полоса 1); ПШ-ПРИ + pGADNOT пустой вектор (дорожка 2); PSH пустой вектор + pGADNOT-SRC-1 (полоса 3); ПШ-ПРИ + pGADNOT-SRC-1 (полоса 4 </ EM>) 5. ПШ-INI-1 + pGADNOT-с-Мус (положительный контроль; дорожка 5). (Воспроизведено из работы 6).
Рисунок 4. Кетоконазол разрушает дикого типа, но не мутантный ассоциацию PXR с коактиватора, SRC-1 дрожжевых колоний были реплики в виде пластин, содержащих автомобиль. (0,2% ДМСО; полоса 1) или кетоконазол (25 мкМ; дорожка 2). X-гал лифт анализ (левая панель) и β-гал жидкость анализ (правая панель) были затем выполняется. Дикого типа ПРИ (А, В линии 1 и 2) и кетоконазол немой мутант T248E/K277Q (В линии 3 и 4) были показаны на этом рисунке. (Воспроизведено из работы 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашем модифицированном Y2H анализа, мы выявили важные остатки для кетоконазол взаимодействий на ПРИ 6. Поскольку SRC-1 представляет собой коактиватор (и клонировали в вектор pGADNot), мы также протестировали, может ли SRC-1 активировать экспрессию LacZ, когда клонировали в векторе системы PSH и будет ли это изменить профиль активации и / или воздействовать на неплотности в дрожжи двугибридная анализ. Используя наши изменен плазмиды мы провели два гибридных анализы в erg3 Δ / erg11 Δ дрожжей. Как и прежде, мы показываем, что LacZ выражение (синие колонии) также индуцируется в erg3 Δ / erg11 Δ штамма дрожжей, трансформированных ПРИ и SRC-1, однако, нет индукция экспрессии LacZ (белые колонии) в дрожжах трансформируется с пустыми векторов , PXR или SRC-1 индивидуально (данные не показаны). Наш подход обеспечивает новый мощный метод для изоляции генетического взаимодействия аллостерический лиганд-белковых остатков для белков не поддающихся conventioНАЛ структурной биологии и / или протеомный приближается 5,21.
Протокол, как описано имеет несколько ошибок, которые необходимо признать. Во-первых, чувствительность обнаружения, особенно те, частичного антагонистического эффекта на остатках взаимодействия белок-белковых можете ограничить разрешение анализа. Колориметрический сканирования может помочь решить некоторые из обнаружения вопросы 21. Во-вторых, присутствие синих колоний не всегда указывают кетоконазол устойчивых PXR мутации (ложно положительные). Выражение LacZ можно было спасти в присутствии кетоконазола из-за мутации (ов) в ПРИ что делает белок конститутивно активным или активным независимо от SRC-1 взаимодействии. Такие мутанты ПРИ можно отличить от истинных кетоконазол устойчивых мутантов путем тестирования способности LexA-DB-ПРИ самостоятельно активировать экспрессию LacZ, т.е. эти мутанты дадут синих колоний в отсутствие GAL4AC-SRC-1. Как следствие, мутанты могут др.так введен в дрожжах с использованием GAL4AC-плазмиды при отсутствии LexA-DB-SRC-1 для дальнейшего описания доказательств для самостоятельного активации LacZ. В-третьих, остается неизвестным, если же результат будет получен, если другие протоколы Y2H / векторы использовали 13. В-четвертых, изучение внутримолекулярных ревертанта мутантов (второй сайт супрессоры мутанты кетоконазол устойчивых мутантов) можно добавить к пониманию антагониста связывания, определив соседние остатки, которые влияют на связывание фармакофор. С модификации библиотеки мутантов, можно определить это более точно, используя кетоконазол устойчивостью мутанта в качестве матрицы мутагенеза.
Этот способ может быть модифицирован, чтобы включить любой лекарственный препарат в котором мишень цитотоксических в дрожжах хорошо известна или к препарата (ов), который не имеет потенциальную токсичность по отношению к дрожжей. Дрожжи могут быть изменены, как мы показали 6, и при этом быть жизнеспособными в течение Y2H анализов. Мощность этого метода также опирается на вспомогательное сообщитьрадиоизлучение от других анализов (например молекулярный докинг), которые сообщают взаимодействия по конкретным участкам. Кроме того, конкретные ядерных рецепторов / coregulator взаимодействия (например nurr77/LKB1; AR/PELP1) могут быть изучены 22,23. Трактабильность этой системы является то, что он является портативным, может быть выполнена в течение нескольких дней в высокой пропускной образом и не требует дорогих реагентов или методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья (NIH) Гранты CA127231 и Дэймон Руньон Foundation Award клинический исследователь (CI 1502) (на SM). Мы хотели бы поблагодарить профессора Зденек Дворак из Палацкого университета Оломоуц, Чехия за его полезные проникновения в обсуждении переносимости этой методики их организации и стандартизации протокола.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Our lab | CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
| YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicillin | Acros Organics | 61177 | |
| Ketoconazole | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimethylformamide | Acros Organics | 326871000 | |
| Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 solution, filter-sterilized | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Nitrocellulose Membrane | Whatman | 10402091 | |
| 10 cm Petri Dish | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | our lab | PXR LBD forward primer for pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | our lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' | our lab | SRC-1 forward primer for pGADNOT | |
| 5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | our lab | SRC-1 reverse primer for pGADNOT | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | our lab | R0136 | |
| SalI | our lab | R0138 | |
| NotI | our lab | R0189 |
References
- Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
- Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).
- Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists. Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).
- Pondugula, S. R., Mani, S. Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response. Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).
- Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. PXR antagonists and implications for drug metabolism. Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).
- Li, H., et al. Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR. J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).
- Hollenberg, S. M., et al. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
- Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf. Cell. 74 (1), 205-214 (1993).
- Wang, H., et al. The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor. Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).
- Kalpana, G. V., Goff, S. P. Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).
- Hamdi, A., Colas, P. Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery. TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).
- Battesti, A., Bouveret, E. The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli. Methods. 58 (4), 325-334 (2012).
- Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems. Methods. 58 (4), 317-324 (2012).
- Albers, M., et al. Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins. Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).
- Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics. J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).
- Huang, H., et al. Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole. Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).
- Wang, H., et al. Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs. Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).
- Ghannoum, M. A., Rice, L. B. Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).
- Kaur, R., Bachhawat, A. K. The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology. 145, 809-818 (1999).
- White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).
- Serebriiskii, I. G., et al. Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets. Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).
- Yang, L., et al. Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer. Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).
- Zhan, Y. Y., et al. The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK. Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).
