Ketoconazolo lega e antagonizza Pregnane X Receptor (PXR) attivazione. Di lievito di alta schermi di throughput di mutanti PXR definiscono una regione unica per l'associazione ketoconazolo. Questo metodo genetico a base di lievito scopre interazioni recettore nucleare nuovi con leganti che associano con siti di legame di superficie.
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Articolo metodologico
Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come regolatore critico del metabolismo dei farmaci e infiammazione, Pregnane X Receptor (PXR), svolge un ruolo importante nella patofisiologia collegamento metabolismo e infiammazione (es. steatosi epatica) 1,2. C'è stato molto progresso per l'identificazione di ligandi agonisti a PXR, tuttavia, ci sono le descrizioni limitate di antagonisti drug-like e dei loro siti di legame su PXR 3,4,5. Una barriera critica è l'incapacità di purificare efficientemente proteina intera per studi strutturali con antagonisti nonostante PXR è stato clonato e caratterizzato nel 1998. Il nostro laboratorio ha sviluppato un romanzo di lievito ad alta velocità basata saggio del doppio ibrido per definire un antagonista, ketoconazolo di residui vincolante per PXR 6. Il nostro metodo prevede la creazione di librerie mutazionali che salvare l'effetto delle singole mutazioni sulla superficie AF-2 di PXR previsto per interagire con ketoconazolo. Rescue o seco "guadagno di funzione"nd mutazioni possono essere fatte in modo tale che le conclusioni riguardanti l'interazione genetica di ketoconazolo e il residuo di superficie (s) on PXR sono fattibili. Così, abbiamo sviluppato un elevato throughput two-hybrid schermo lievito di mutanti PXR che interagiscono con il suo coactivator, SRC-1. Usando questo approccio, in cui il lievito è stato modificato per accogliere lo studio del farmaco antifungino, ketoconazolo, potremmo dimostrare mutazioni specifiche su PXR arricchiti in cloni incapaci di legarsi al ketoconazolo. Con logica inversa, possiamo concludere che i residui originali siano residui interazione diretta con ketoconazolo. Questo test rappresenta un romanzo, test genetico trattabili allo schermo per antagonista siti di legame sulle superfici del recettore nucleare. Questa analisi può essere applicata a qualsiasi farmaco indipendentemente dal suo potenziale citotossico di lievito e di proteina cellulare (s) che non può essere studiata utilizzando biologia strutturale standard o metodi basati proteomica. Potenziali insidie comprendono l'interpretazione dei dati (metodi complementari utile), relizione sul metodo unico Y2H, esperienza nella gestione di lievito o l'esecuzione di lievito saggi di due ibridi, e l'ottimizzazione del dosaggio.
Introduzione
Il lievito due ibridi (Y2H) saggio è ampiamente utilizzato per rilevare le interazioni proteina-proteina e più recentemente per la scoperta di nuove piccole molecole che interrompono proteina-proteina complessi di interazione 7, 8, 9, 10, 11. Tuttavia, gli approcci convenzionali di questo test, utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci o di "hits", non consentono per il rilevamento di residui di interazione allosterici di prodotti chimici composti all'interno di superfici proteina-proteina, che, quando alterati ancora interagire e consentire l'interrogatorio dei residui alterati 11 . Infatti, tale metodo (s), se possibile sviluppare, c....
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Protocollo
1. Costruzione di PXR e SRC-1 Fusioni in vettori di lievito
- Amplificazione PCR di Human PXR LBD (107-434 amminoacidi) e Human SRC-1 a figura intera (1-1401 amminoacidi).
- Utilizzare pSG5-hPXR plasmide 8 come modello PXR LBD, utilizzare plasmide pCMX-SRC1 come SRC-1 modelli.
- Thaw PCR SuperMix, i modelli di DNA e primer (vedi Materiali), tenerli su ghiaccio.
- Aggiungere 0,25 mg / template DNA microlitri 1 ml, 10 mM coppie di primer 2 microlitri ciascuno, PCR SuperMix 45 ml e aggiungere H 2 O per portare il volume totale di 50 microlitri.
- Impostare PCR in un ciclo di 94 ° C per 2 min, 20 cicli di 94 °....
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Risultati
Noi eseguito un test per vedere se potevamo rilevare una lettura colorimetrica dell'associazione di PXR e del recettore steroide coactivator-1 (SRC-1). Dato che il lievito ha una significativa produzione di sterolo, è stato precedentemente dimostrato che l'espressione lacZ nel lievito può essere indotta senza la necessità di ulteriori ligando esogeno. Abbiamo trovato che l'espressione lacZ (colonie blu) è anche indotto nel ceppo di lievito trasformato con PXR e SRC-1, tuttavia, non vi è alcuna induzione dell.......
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Discussione
Nel nostro test Y2H modificata, abbiamo identificato residui importanti per le interazioni ketoconazolo su PXR 6. Dal SRC-1 è un coactivator (ed è stato clonato nel vettore pGADNot), abbiamo provato anche se SRC-1 potrebbe attivare l'espressione lacZ quando clonato nel sistema vettore PSH e se questo cambierebbe il profilo di attivazione e / o influenzare il leakiness di il lievito saggio del doppio ibrido. Utilizzando i nostri plasmidi ridisegnati abbiamo effettuato test di due ibride in ERG3 Δ .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) concede CA127231 e The Damon Runyon Premio Fondazione Clinical Investigator (CI 1502) (SM). Vorremmo ringraziare il professor Zdenek Dvorak da Palacky Università di Olomouc, Repubblica Ceca per i suoi utili intuizioni che parlano di portabilità di questa tecnica per la loro istituzione e la standardizzazione del protocollo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ceppo di lievito CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Il nostro | lievito CTY10-5d da laboratorio è stato sottoposto a doppio knock out ERG3 e ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) geni6. | |
| YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) senza aminoacidi e solfato di ammonio | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-HIS/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (O-nitrofenil Β-D- galattopiranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Brodo (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| Salmone sonicato Sperma DNA bollito (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicillina | Acros Organics | 61177 | |
| Ketoconazolo | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimetilformammide | Acros Organics | 326871000 | |
| Acetato di litio | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 soluzione, sterilizzato con filtro | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Membrana in nitrocellulosa Whatman | 10402091 | ||
| 10 cm Piastra di Petri | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'our | lab | PXR LBD primer forward per pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'our | lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'our | lab | SRC-1 primer forward per pGADNOT | |
| 5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'our | lab | SRC-1 primer inverso per pGADNOT | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | il nostro laboratorio | R0136 | |
| SalI | il nostro laboratorio | R0138 | |
| NotI | il nostro laboratorio | R0189 |
Riferimenti
- Kliewer, S. A., et al. An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway. Cell. 92 (1), 73-82 (1998).
- Blumberg, B., et al. a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. Genes Dev. 12
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Ristampe e permessi
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