Abstract
दवा चयापचय और सूजन के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में, Pregnane एक्स रिसेप्टर (PXR), चयापचय और सूजन (जैसे यकृत steatosis) 1,2 जोड़ने रोग pathophysiology में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. PXR के लिए agonist ligands की पहचान में बहुत प्रगति हुई है, हालांकि, दवा की तरह गरम और PXR 3,4,5 पर उनके बाध्यकारी साइटों के सीमित वर्णन कर रहे हैं. एक महत्वपूर्ण बाधा कुशलता PXR 1998 में क्लोन और विशेषता थी कि इस तथ्य के बावजूद विरोधी के साथ संरचनात्मक अध्ययन के लिए पूर्ण लंबाई प्रोटीन को शुद्ध करने में असमर्थता किया गया है. हमारी प्रयोगशाला PXR 6 पर अवशेषों बंधन, एक विरोधी, ketoconazole के परिभाषित करने के लिए आधारित एक उपन्यास उच्च throughput खमीर दो संकर परख विकसित की है. हमारे विधि ketoconazole के साथ बातचीत करने की उम्मीद PXR की वायुसेना -2 सतह पर एक परिवर्तन के प्रभाव बचाव होता है कि उत्परिवर्तनीय पुस्तकालयों का निर्माण शामिल है. बचाव या "लाभ के समारोह" Secoएन डी म्यूटेशन PXR पर ketoconazole की आनुवंशिक बातचीत और सतह छाछ (ओं) के बारे में निष्कर्ष संभव है कि इस तरह बनाया जा सकता है. इस प्रकार, हम अपने coactivator, एसआरसी-1 के साथ बातचीत PXR म्यूटेंट के एक उच्च throughput दो संकर खमीर स्क्रीन विकसित की है. खमीर रोधी दवा, ketoconazole के अध्ययन को समायोजित करने के लिए संशोधित किया गया था जिसमें इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम ketoconazole करने के लिए बाध्य करने में असमर्थ क्लोन में समृद्ध PXR पर विशिष्ट परिवर्तन का प्रदर्शन कर सकता. रिवर्स तर्क से, हम मूल अवशेषों ketoconazole के साथ सीधी बातचीत के अवशेष हैं कि समाप्त. यह परख एक उपन्यास, परमाणु रिसेप्टर सतहों पर प्रतिपक्षी बाध्यकारी साइटों के लिए स्क्रीन को विनयशील आनुवंशिक परख का प्रतिनिधित्व करता है. यह परख खमीर करने के साथ ही मानक संरचनात्मक जीव विज्ञान या प्रोटिओमिक आधारित विधियों का उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता कि सेलुलर प्रोटीन (ओं) को परवाह किए बिना अपने साइटोटोक्सिक क्षमता के किसी भी दवा के लिए लागू किया जा सकता है. संभावित नुकसान डेटा की व्याख्या (पूरक के तरीकों उपयोगी), धर्म में शामिलएकल Y2H विधि, खमीर से निपटने या खमीर दो संकर assays के प्रदर्शन में विशेषज्ञता, और परख अनुकूलन पर मंजूरी.
Introduction
खमीर दो संकर (Y2H) परख व्यापक रूप से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की खोज करने के लिए प्रयोग किया जाता है और हाल ही में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत परिसरों 7, 8, 9, 10, 11 को बाधित कि उपन्यास छोटे अणुओं की खोज के लिए. हालांकि, इस परख के परंपरागत तरीके, दवाओं की खोज या 'हिट' के लिए इस्तेमाल किया, प्रोटीन, प्रोटीन सतहों के भीतर रसायन यौगिकों के allosteric बातचीत अवशेषों का पता लगाने के लिए अनुमति नहीं देते हैं कि बातचीत और बदल अवशेष 11 से पूछताछ के लिए अनुमति अभी भी बदल जब . दरअसल, इस तरह के एक विधि (एस), विकसित करना संभव है, तो प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत विघटन के लिए महत्वपूर्ण allosteric बातचीत अवशेषों के उच्च throughput मूल्यांकन के लिए एक विनयशील खमीर प्रणाली सक्षम होगा. दवाओं की खोज के संदर्भ में, प्रोटीन के साथ यौगिकों की बातचीत की स्थापना के लिए सबसे सीधा रास्ता संरचनात्मक निर्धारण (प्रोटीन अवरोध करनेवाला परिसर के जैसे crystalization) शामिल होगा. इन विधियों सह रहे हैंbersome, व्यापक संसाधनों का उपयोग करें और यह हर प्रोटीन पर संरचनात्मक अध्ययन को करने के लिए तकनीकी रूप से संभव नहीं है.
विनयशील आनुवंशिक दवा स्क्रीनिंग सिस्टम बैक्टीरिया 1, 2 और स्तनधारी दो संकर जैसे अन्य मॉडल प्रणाली में स्थापित किया गया है. हालांकि, इन प्रणालियों अनुकूलन की जरूरत है और Y2H जैसे वैकल्पिक सिस्टम अभी भी सबसे दवाओं की खोज में परीक्षण किया गया. गरीब संवेदनशीलता और विलक्षण विधियों 13 का उपयोग करते हुए बातचीत की विश्वसनीयता भी शामिल है कि सीमाएं हैं, हालांकि, एक भी Y2H परख बातचीत अवशेषों के बारे में विशिष्ट सवालों के जवाब देने के लिए संशोधित किया जा सकता है. परमाणु रिसेप्टर अनुसंधान के क्षेत्र में, Y2H बातचीत प्रोटीन 14 को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, हालांकि, इन प्रोटीन बातचीत शायद ही कभी / विरोधी परमाणु रिसेप्टर प्रोटीन परिसरों के साथ बातचीत ligands जिसमें प्रकृति को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रकार, हमारी प्रयोगशाला विशेष रूप से नहीं कर रहे हैं कि रिसेप्टर प्रोटीन के लिए एक विधि को परिभाषित करने के प्रयासों पर ध्यान केंद्रितआधारित विधियों प्रोटिओमिक आसानी से उत्तरदायी, कि एक रिवर्स Y2H आधारित खोज मंच का उपयोग अवशेषों बातचीत उपन्यास ligand / प्रतिपक्षी पता लगाना होगा.
Ketoconazole PXR और इसके उत्प्रेरक एसआरसी 1 बाधित कि हमारे पिछले खोज के आधार पर, हम एक उपन्यास PXR 6 पर ketoconazole बातचीत अवशेषों को परिभाषित करने और पूछताछ करने के लिए सक्षम है कि Y2H प्रणाली रिवर्स विकसित की है. हमारे विधि डीएनए बाध्यकारी और transcriptional सक्रियण के लिए जिम्मेदार वियोज्य डोमेन के होते हैं कि खमीर GAL4 प्रोटीन के गुणों पर आधारित है. पूरी लंबाई सह activators एसआरसी -1 (स्टेरॉयड रिसेप्टर coactivator 1) प्रोटीन GAL4 सक्रियण डोमेन के लिए fusions के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, जबकि PXR LBD प्रोटीन (, Lexa डीएनए बाध्यकारी डोमेन (डीएनए बी) को एक संलयन के रूप में व्यक्त किया जाता है ई. ). PXR और एसआरसी 1 संलयन प्रोटीन के बीच बातचीत खमीर genom में एकीकृत है कि β-लैक जेड रिपोर्टर जीन युक्त GAL4 बाध्यकारी साइटों के transcriptional सक्रियण की ओर जाता हैई. Ketoconazole, एक PXR प्रतिपक्षी, PXR और एसआरसी 1 बातचीत 15, 16, 17 को बाधित और हम एक्स लड़की गतिविधि के लिए फिल्टर पर कालोनियों धुंधला के बाद उपस्थिति या ketoconazole के अभाव में PXR की बातचीत का पता लगाने और एसआरसी 1 कर सकते हैं. Y2H के सिद्धांत चित्र 1 में सचित्र है और प्रयोगात्मक प्रक्रिया चित्रा 2 में संक्षेप.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Our lab | CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
| YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BD Biosciences | 233520 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
| CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
| ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
| Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
| Ampicillin | Acros Organics | 61177 | |
| Ketoconazole | Sigma-Aldrich | K1003 | |
| N,N-Dimethylformamide | Acros Organics | 326871000 | |
| Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| 50% PEG-3350 solution, filter-sterilized | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
| Nitrocellulose Membrane | Whatman | 10402091 | |
| 10 cm Petri Dish | Fisher | 875712 | |
| 5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | our lab | PXR LBD forward primer for pSH2-1 | |
| 5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | our lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
| 5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' | our lab | SRC-1 forward primer for pGADNOT | |
| 5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | our lab | SRC-1 reverse primer for pGADNOT | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| BamHI | our lab | R0136 | |
| SalI | our lab | R0138 | |
| NotI | our lab | R0189 |
References
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