Abstract
약물 대사 및 염증의 중요한 조절 제로, Pregnane X 수용체 (PXR)는, 대사 및 염증 (예, 간 지방증) 1,2 연결 질병 병태 생리에서 중요한 역할을한다. PXR에 대한 효능 리간드의 식별에 많은 진전이 있었다, 그러나, 마약과 같은 길항제 및 PXR 3,4,5 그들의 결합 부위의 제한에 대한 설명이 있습니다. 중요한 장벽을 효율적으로 PXR는 1998 년에 복제 및 특징되었다는 사실에도 불구하고 길항제와 구조 연구에 대한 전체 길이의 단백질을 정화하는 무능력이다. 우리 연구소는 PXR 6 잔류 물을 결합, 길항제, 케토코나졸의를 정의하는 기반으로 소설 높은 처리량 효모 두 하이브리드 분석을 개발했다. 우리의 방법은 케토코나졸과 상호 작용 할 것으로 예상 PXR의 AF-2면에 하나의 돌연변이의 효과를 구출 할 돌연변이 라이브러리를 만드는 작업이 포함됩니다. 구조 또는 "기능 획득"세코ND 돌연변이 PXR에 케토코나졸의 유전 적 상호 작용과 표면 잔기 (들)에 관한 결론이 실현 가능하도록 만들어 질 수있다. 따라서, 우리는 그것의 보조 활성화, SRC-1과 상호 작용 PXR 돌연변이의 높은 처리량을 두 하이브리드 효모 화면을 개발했다. 효모는 항진균제, 케토코나졸의 연구를 수용하기 위해 수정 된이 방식을 사용하여, 우리는 케토코나졸에 바인딩 할 수 없습니다 클론 풍부한 PXR의 특정 변이를 설명 할 수 있습니다. 반대 논리에 의해, 우리는 원래의 잔류 케토코나졸과의 직접적인 상호 작용 잔류 있다는 결론을 내린다. 이 분석은 소설, 핵 수용체 길항제 표면에 결합 부위에 대한 화면으로 다루기 쉬운 유전자 분석을 나타냅니다. 이 분석은 효모뿐만 아니라 표준 구조 생물학 또는 단백체 기반 방법을 사용하여 연구 할 수없는 세포 단백질 (들)에 관계없이 세포 독성 가능성의 약물에 적용 할 수 있습니다. 잠재적 인 함정은 데이터의 해석 (보완적인 방법으로 유용), 신뢰성을 포함단일 Y2H 방법, 효모 처리 또는 효모 두 하이브리드 분석을 수행하는 전문 지식 및 분석 최적화에 ANCE.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast Strain CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ | Our lab | CTY10-5d yeast was double knocked out ERG3 and ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) genes6 . | |
YPD Growth Medium | BD Biosciences | 630409 | |
Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate | BD Biosciences | 233520 | |
Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | |
CSM-His/-Leu Complete Supplement Mixture | MP Biomedicals | 4250-412 | |
ONPG (o-Nitrophenyl Β-D- Galactopyranoside). | Sigma-Aldrich | N1127 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Luria Broth (LB) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
X-Gal | Fisher | BP-1615 | |
Sonicated Salmon Sperm DNA boiled (10 mg/ml) | Life Technology | 156-017 | |
Ampicillin | Acros Organics | 61177 | |
Ketoconazole | Sigma-Aldrich | K1003 | |
N,N-Dimethylformamide | Acros Organics | 326871000 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | L4158 | |
50% PEG-3350 solution, filter-sterilized | Sigma-Aldrich | P-3640 | |
Nitrocellulose Membrane | Whatman | 10402091 | |
10 cm Petri Dish | Fisher | 875712 | |
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3' | our lab | PXR LBD forward primer for pSH2-1 | |
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3' | our lab | PXR LBD reverse primer for pSH2-1 | |
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3' | our lab | SRC-1 forward primer for pGADNOT | |
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3' | our lab | SRC-1 reverse primer for pGADNOT | |
Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
BamHI | our lab | R0136 | |
SalI | our lab | R0138 | |
NotI | our lab | R0189 |
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