एक orthotopic Glioblastoma माउस मॉडल मस्तिष्क parenchymal शारीरिक बाधाओं को बनाए रखने और intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त

Summary

हम ट्यूमर के विकास के दौरान खेलने पर सामान्य रूप से biophysical बाधाओं का स्मरण दिलाता है कि intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए चूहों में एक cortical orthotopic glioblastoma मॉडल की स्थापना की है. ट्यूमर से ऊपर खोपड़ी की जगह एक पुरानी खिड़की के कांच दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा समय पर ट्यूमर प्रगति की अनुवर्ती सक्षम बनाता है.

Abstract

Glioblastoma मल्टीफार्मी (जीबीएम) तिथि करने के लिए उपलब्ध नहीं उपचारात्मक उपचार के साथ मस्तिष्क ट्यूमर के सबसे आक्रामक रूप है.

इस विकृति की murine मॉडल ड्यूरा-मेटर का चीरा निम्नलिखित मस्तिष्क पैरेन्काइमा में glioma कोशिकाओं का एक निलंबन के इंजेक्शन पर भरोसा करते हैं. कोशिकाओं intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए सुलभ हो अल्पज्ञता इंजेक्शन जा करने के लिए है, जबकि सतही इंजेक्शन physiopathological शर्तों पुनरावृत्ति करने में विफल. दरअसल, इंजेक्शन तंत्र के माध्यम से बचने के सबसे ट्यूमर कोशिकाओं वे पैरेन्काइमा से यांत्रिक कमी के अभाव में असामान्य रूप से तेजी से विस्तार जहां अतिरिक्त dural अंतरिक्ष तक पहुँचने.

हमारे सुधार focally एक glioma अंडाकार आकृति दाखिल बजाय सेरेब्रल कॉर्टेक्स की ऊपरी परत में glioma कोशिकाओं का एक निलंबन इंजेक्शन लगाने में बल्कि surroun से चिपके है कि एक पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका द्वारा इंजेक्शन साइट clogging में न केवल मिलकरडिंग पैरेन्काइमा और cyanoacrylate साथ ड्यूरा-मेटर को सील कर दिया. कुल मिलाकर इन उपायों मस्तिष्क पैरेन्काइमा अंदर ट्यूमर कोशिकाओं के शारीरिक विस्तार और घुसपैठ को लागू. एक कांच की खिड़की निशान ऊतक विकास के अभाव में सप्ताह से अधिक पुरानी इमेजिंग अनुमति देने के लिए खोपड़ी के लिए पुख्ता साथ कपाल - उच्छेदन अंत में बंद कर दिया था.

हम glioma कोशिकाओं, न्यूरॉन्स (जैसे Thy1-इंडोनेशियाई चूहों) और वाहिका संरचना (एक फ्लोरोसेंट डाई की एक अंतःशिरा इंजेक्शन से प्रकाश डाला) के बीच होने वाली बातचीत की गतिशीलता intravital से देखे जा सकते हैं पता चला है कि फ्लोरोसेंट ट्यूमर कोशिकाओं के साथ grafted फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक जानवरों का लाभ उठाते हुए रोग की प्रगति के दौरान दो photon माइक्रोस्कोपी.

एक न्यूनतम के साथ छेड़छाड़ मस्तिष्क वातावरण में सूक्ष्म प्रस्ताव पर छवि एक ट्यूमर को संभावना न्यूरो ऑन्कोलॉजी और नशीली दवाओं के परीक्षण के क्षेत्र को लाभ होना चाहिए, जो वर्तमान जीबीएम पशु मॉडल की एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है.

Introduction

Glioblastoma मल्टीफार्मी 12 महीने की एक औसत अस्तित्व के साथ वयस्कों में मस्तिष्क ट्यूमर के सबसे आक्रामक रूप और 5% से 5 साल के जीवित रहने की दर के रूप में प्रकट होता है. नैदानिक ​​प्रबंधन सर्जरी, रेडियोथेरेपी और अक्सर संयोजन में उपयोग रसायन चिकित्सा पर निर्भर करता है. हालांकि, इन उपचार के प्रभाव को ^1-3 उपशामक रहते हैं.

अब तक, न्यूरो ऑन्कोलॉजी अध्ययन के अधिकांश (उदाहरण ^4,5 के लिए देखें) केवल एक स्थिर दृष्टिकोण प्रदान करने में सक्षम हैं और ट्यूमर असर पशुओं की बड़ी साथियों पर प्रदर्शन अलग समय बिंदुओं पर बलिदान किया है कि तकनीक पर भरोसा करते हैं. intravital इमेजिंग के आधार पर अनुवर्ती तरीकों की हाल ही में विकास glioma विकास और ट्यूमर कोशिकाओं और समय के साथ ही पशु पर उनके pathophysiological microenvironment के बीच बातचीत का अध्ययन कर देता है. यह ⁶ अब तक पहुंच से बाहर था कि जानकारी के अनन्य टुकड़ा करने के लिए रास्ता खुल जाता है. ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट टैग व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवर उपयोग किया जा सकता हैइस पत्र में ट्यूमर कोशिकाओं और जैसे न्यूरॉन्स के बीच विशिष्ट बातचीत का अध्ययन करने के लिए डी.

पिछले दशक के दौरान, intravital दो photon माइक्रोस्कोपी ⁷ के साथ (> 500 ड्यूरा-मेटर नीचे माइक्रोन) मौलिक न्यूरो ऑन्कोलॉजी अध्ययन और preclinical परीक्षण माउस मस्तिष्क के गहरे intravital अवलोकन प्रदर्शन करने की क्षमता के लिए ^8,9 में एक स्वर्ण मानक बन गया है एक micrometric स्थानिक संकल्प ^10. एक पुरानी कपाल खिड़की ¹¹ के साथ प्रत्यारोपित orthotopical पशु मॉडलों के साथ intravital दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग, यह एक ही माउस ^9,12 पर समय के साथ ट्यूमर प्रगति का पालन करने के लिए संभव है.

ये पहले से प्रकाशित पशु मॉडल की प्रमुख कमियां की है कि वे ड्यूरा-मेटर सेल निलंबन ^9,13,14 के इंजेक्शन के बाद सील नहीं है के रूप में ट्यूमर के विकास को नियंत्रित करने वाले शारीरिक बाधाओं की नकल नहीं है कि हालांकि है. Glioma कोशिकाओं में रिसाव हो सकता हैएक heterotopic एक में एक orthotopic glioma मॉडल बदलने extradural अंतरिक्ष.

यहाँ प्रस्तुत पशु मॉडल एक पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका और histo संगत गोंद के साथ ड्यूरा-मेटर की सील द्वारा पीछा 200 माइक्रोन की गहराई में सेरेब्रल कॉर्टेक्स में फ्लोरोसेंट glioma कोशिकाओं का एक अंडाकार आकृति के इंजेक्शन में होते हैं . ट्यूमर के विकास को फिर pathophysiological शारीरिक बाधाओं का कहना है कि मस्तिष्क पैरेन्काइमा के लिए प्रतिबंधित है. ट्यूमर से ऊपर प्रत्यारोपित एक पुरानी कांच की खिड़की intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए एक आसान उपयोग ऑप्टिकल अनुमति देता है. यह समय के साथ glioma विकास की एक अनुवर्ती करने के लिए और (फ्लोरोसेंट dextrans के साथ प्रकाश डाला न्यूरॉन्स और वाहिका संरचना के साथ यहाँ) अपने microenvironment के साथ अपनी बातचीत का अध्ययन करने के लिए संभव है ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट टैग व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवर का उपयोग करना.

Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए फ्रांसीसी कानून के अनुसार और 24 नवंबर के यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक, 1986 (86/609/EEC) के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया. जानवरों पर अनुसंधान की दिशा Départementale देस सेवा Vétérinaires des बोचेस - डु - रोन (लाइसेंस डी-13-055-21) द्वारा अधिकृत और प्रोवंस कोटे डी AZUR n ° 14 (परियोजना 87-04122012) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था .

1. Spheroids तैयारी

1. Agarose लेपित पेट्री डिश की तैयारी
   1. भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक नहीं सेल संस्कृति के माध्यम से 100 मिलीलीटर के साथ agarose की 1 ग्राम मिलाएं. एक माइक्रोवेव ओवन का प्रयोग करें (40 सेकंड के लिए 850 वाट, तो 3 एक्स 15 सेकंड, एक माइक्रोवेव सत्र के बीच में समाधान हलचल) समाधान फोड़ा करने के लिए और पूरी तरह से agarose भंग करने के लिए. Steri बीमा करने के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए यह 1% agarose समाधान आटोक्लेव. lity नोट: पूरी तरह से आटोक्लेव प्रोटोकॉल से पहले agarose भंग करने के लिए ध्यान रखना. Inhomogeneity spheroids के गठन समझौता हो सकता है.
   2. एक बार आटोक्लेव से लिया गया, 100 x 20 मिमी पेट्री डिश में 1% agarose समाधान के 10 मिलीलीटर डालना. 1% agarose समाधान दृढ़ करने की अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर पेट्री व्यंजन 20 मिनट के लिए छोड़ दें.
   3. नमी बनाए रखने के लिए agarose ऊपर पीबीएस के 10 एमएल जोड़ें. वाष्पीकरण से बचने के लिए parafilm के साथ उन्हें लपेटकर द्वारा agarose लेपित पेट्री डिश के ढक्कन सील. ठीक से पीबीएस परत द्वारा humidified अगर पेट्री डिश 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 2 महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है.
2. उपगोल संस्कृति
   1. एक monolayer के रूप में उनकी सिफारिश मध्यम में एक 75 सेमी ² फ्लास्क, संस्कृति में glioma कोशिकाओं.
   2. Glioma सेल के 2 डी monolayer युक्त कुप्पी से एकत्र "preconditioned मध्यम" के 1.5 मिलीग्राम से 1% agarose लेपित पेट्री डिश में से एक से पीबीएस बदलेंएस.
   3. Glioma कोशिकाओं की 2 डी monolayer युक्त कुप्पी से मध्यम निकालें.
   4. धीरे पीबीएस के 10 एमएल के साथ monolayer कुल्ला.
   5. एक trypsin / EDTA समाधान के 0.05% के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस नोट में कुप्पी 4 मिनट सेते: ऊष्मायन समय का इस्तेमाल सेल लाइन के अनुसार भिन्न हो सकते हैं.
   6. धीरे सेल निलंबन फ्लश, trypsin की कार्रवाई को रोकने के लिए संस्कृति के माध्यम से 8 मिलीलीटर जोड़ें नोट:. यह कोशिका मृत्यु बढ़ जाती है के रूप में सेल निलंबन में हवा निकलवाने के लिए नहीं ख्याल रखना.
   7. एक बाँझ शीशी में सेल निलंबन के 6 मिलीलीटर रखो.
   8. 800 rpm पर शीशी 4 मिनट अपकेंद्रित्र.
   9. सतह पर तैरनेवाला निकालें और धीरे संस्कृति के माध्यम से 3 मिलीलीटर में सेल तलछट निलंबित.
   10. तैयार agarose लेपित पेट्री डिश में सेल निलंबन बीज.
   11. वांछित व्यास की spheroids गठन कर रहे हैं जब तक 2 से 3 दिनों के लिए एक 5% सीओ _{2 के} वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर पेट्री डिश में डाल दिया.
2. उपगोल और विंडो आरोपण
1. इंजेक्शन प्रणाली की तैयारी
   1. 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में sonicating द्वारा स्वच्छ कांच capillaries (व्यास में 1 मिमी). शुष्क जब तक एक मशीन के अंदर पानी से पहले रखने के साथ दो बार कुल्ला.
   2. एक छोटे स्टॉक तैयार करने के क्रम में एक विंदुक खींचने के साथ कई साफ कांच capillaries खींचो.
   3. आम तौर पर 300-350 माइक्रोन के एक बाहरी व्यास और 250-300 मीटर की एक आंतरिक व्यास: वांछित आकार के एक beveled सिरा प्राप्त करने के लिए टिशू पेपर के एक टुकड़े पर सिरा scratching द्वारा खींचा केशिका की नोक तोड़ो. इस आकार देने की प्रक्रिया के दौरान, जिसका आंख का एक स्नातक मीरा के साथ सुसज्जित है एक macroscope का उपयोग केशिका का व्यास नियंत्रित करते हैं.
   4. जिसका भीतरी व्यास केशिका के बाहरी व्यास फिट बैठता प्लास्टिक टयूबिंग के एक टुकड़े का उपयोग कर एक 3 रास्ता कई गुना करने के लिए केशिका की गैर beveled छोर से कनेक्ट करें.
   5. प्लास्टिक tubin का प्रयोगजी, एक को कई गुना की दो अन्य तरीकों से कनेक्ट 25 μl microliter सिरिंज और histo संगत खनिज तेल के साथ भरी हुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के लिए.
   6. Microliter सिरिंज और 1ml सिरिंज के बीच एक मार्ग स्थापित करने के लिए कई गुना चयनकर्ता को समायोजित करें. हटाना microliter सिरिंज के पिस्टन और यह 1ml सिरिंज के पिस्टन जोर से बाहर लीक जब तक microliter सिरिंज में पिछड़े खनिज तेल इंजेक्षन. ख्याल रखने ट्यूब में हवा के बुलबुले छोड़ने के लिए नहीं है, जबकि microliter सिरिंज के पिस्टन बदलें.
   7. केशिका और 1 मिलीलीटर सिरिंज के बीच एक मार्ग स्थापित करने के लिए कई गुना चयनकर्ता को समायोजित करें. ट्यूब में हवा के बुलबुले छोड़ने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, जबकि यह टिप से बाहर लीक जब तक खनिज तेल के साथ केशिका भरें.
   8. Microliter सिरिंज और केशिका के बीच एक संबंध स्थापित करने के लिए कई गुना चयनकर्ता को समायोजित करें. खनिज तेल के बारे में 10 μl निष्कासित.
   9. पीबीएस समाधान में केशिका टिप डुबकीऔर microliter सिरिंज का गेज का उपयोग, केशिका में पीबीएस के 5μl में चूसना. तेल और पीबीएस के बीच meniscus स्पष्ट रूप से दिख रहा है कि नोट.
   10. सर्जरी macroscope तहत ढाले एक 3 अक्ष micromanipulator पर केशिका ठीक करें. इस प्रणाली के दृश्य नियंत्रण में इंजेक्शन साइट के लिए केशिका लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
2. अंडाकार आकृति आरोपण
   1. हल्के (1 से 1.5 मिनट के दौरान हवा में 1.5%) एक प्रेरण कक्ष में isoflurane की साँस लेना द्वारा माउस शांत.
   2. Ketamine / xylazine (120 मिलीग्राम / किग्रा, 12 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण से एक अंतर peritoneal इंजेक्शन के साथ पशु anesthetize. संज्ञाहरण अक्सर जानवर के शरीर के तापमान को कम कर देता है कि नोट. यह 26 डिग्री सेल्सियस पर एक कमरे में सर्जरी के साथ आगे बढ़ने के लिए और एक अंतर्निहित thermocontrolled हीटिंग पैड के साथ जानवरों को गर्म रखने की सिफारिश की है.
   3. आंखों की सुखाना से बचने के लिए नेत्र मरहम लागू करें.
   4. जानवर की खोपड़ी दाढ़ी.
   5. जगहकान सलाखों और एक मुखपत्र का उपयोग कर एक stereotactic फ्रेम में पशु.
   6. Povidone आयोडीन (3% साबुन, तो 10% समाधान) के साथ त्वचा को साफ.
   7. एक स्केलपेल के साथ खोपड़ी के बीच में longitudinally एक 1 सेमी लंबा चीरा. कैंची पार्श्विका हड्डियों ऊपर त्वचा में कटौती और निकालें का उपयोग.
   8. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ धीरे खोपड़ी ऊपर periosteum हटा दें. उदारता बाद सीमेंट पालन करने के लिए किसी न किसी सतह उत्पन्न करने के लिए हड्डी के शीर्ष पर cyanoacrylate लागू होते हैं.
   9. 4 मिमी व्यास की एक कपाल - उच्छेदन उत्पन्न करने के लिए एक शल्य macroscope तहत पार्श्विका हड्डी ड्रिल. उदारता ताप रोकने के लिए पूरी प्रक्रिया के दौरान Pencillin (1,000 यू / एमएल) और Streptomicin (1 मिलीग्राम / एमएल) युक्त ठंडा पीबीएस जोड़ें. संदंश और एक गीला बाँझ धुंध के साथ छोटे हड्डी के टुकड़े निकालें. दूर हेमोरेज से बचने के लिए पार्श्विका खोपड़ी टांके से कम से कम 1 मिमी ड्रिल करने के लिए ध्यान रखना.
   10. कांच की खिड़की बंद हो जाएगा जहां कपाल - उच्छेदन की सीमा पर पतला हड्डी. उद्देश्य ई करने के लिए हैमस्तिष्क और कांच के बीच अधिक से अधिक संपर्क सतह के साथ कांच की खिड़की के nsure बाद में तलीय पोजीशनिंग. धीरे धीरे एक संदंश का उपयोग हड्डी को हटाने और पीबीएस समाधान के साथ संपर्क में ड्यूरा-मेटर साफ.
   11. एक 5 मिमी व्यास दौर गिलास coverslip लो शराब के साथ साफ और टिशू पेपर के साथ शुष्क. कपाल - उच्छेदन के लिए एक ढक्कन के रूप में coverslip का उपयोग करें और मस्तिष्क के एक बड़े फ्लैट सतह गिलास के साथ संपर्क में हो जाता है कि इस बात की पुष्टि करने की कोशिश करो. यदि आवश्यक हो coverslip करने के लिए आगे पतली पक्ष हड्डियों को हटा दें. धीरे जगह में एक बार coverslip पर दबाव लागू यदि मस्तिष्क फ्लैट निचोड़ा प्राप्त कर सकते हैं जब तक आगे बढ़ें.
   12. फिर शराब के साथ coverslip साफ, टिशू पेपर के साथ यह शुष्क है, और यह अलग बचाने के लिए.
   13. एक 26 गेज सुई के साथ अभी तक मुख्य रक्त वाहिकाओं से परहेज कपाल - उच्छेदन के केंद्र में ड्यूरा-मेटर में एक छेद करना. बस ड्यूरा-मेटर को खोलने के लिए इस कदम का उद्देश्य के रूप में मस्तिष्क पैरेन्काइमा है नुकसान नहीं सुनिश्चित करें.
   14. धीरे ड्यूरा-मेटर वाई साफरक्तस्रावी रक्त को निकालने के लिए पीबीएस समाधान वें. अंडाकार आकृति इंजेक्शन तैयार करते समय टिशू पेपर के एक टुकड़े के साथ कवर.
   15. 2.1 चरण में तैयार अंडाकार आकृति इंजेक्शन प्रणाली के साथ, 1.2 चरण में तैयार पेट्री डिश से केशिका भीतरी व्यास (लगभग 200-250 माइक्रोन) फिटिंग एक दौर अंडाकार आकृति चूसना. उपगोल लगभग 5 μl मध्यम संस्कृति के साथ आना चाहिए. यह अपने वजन के तहत कैशिकता की टिप करने के लिए नीचे गिर चाहिए.
   16. कपाल - उच्छेदन कवर और इंजेक्शन प्रणाली के तहत पशु की स्थिति के लिए प्रयोग किया जाता गीले टिश्यू पेपर निकालें.
   17. यह ड्यूरा-मेटर में किए गए छेद छू तक इंजेक्शन पिपेट कम करें. फिर, 250 माइक्रोन से इसे फिर से कम है. 30 मिनट रुको.
   18. धीरे धीरे टिशू पेपर का एक पतला टुकड़ा के साथ अतिरिक्त तरल बाहर पम्पिंग जबकि microliter सिरिंज के पिस्टन (2-3 μl) का उपयोग अंडाकार आकृति इंजेक्षन. 30 मिनट रुको और फिर धीरे सतह की ओर 50 माइक्रोन से इंजेक्शन पिपेट उठा. 30 सेकंड और repea फिर रुकोसतह तक 50 माइक्रोन के इस कदम से उठाने की प्रक्रिया टी. बार प्रतीक्षा की जा रही पिपेट के लिए छड़ी होगी कि अंडाकार आकृति की निकासी से बचा जाता है.
   19. एक प्रतिदीप्ति macroscope का उपयोग कर मस्तिष्क में अंडाकार आकृति की उपस्थिति की पुष्टि.
   20. 100-300 माइक्रोन व्यास एक पेट्री डिश में पीबीएस समाधान के साथ पार से जुड़े dextran जेल मोती मिलाएं. 1min रुको और कुछ हाइड्रेटेड मोती मछली. कपाल - उच्छेदन करने के लिए आसन्न हड्डी पर रखें.
   21. Macroscopic नियंत्रण के तहत, ड्यूरा-मेटर खोलने के आकार के समान एक व्यास के साथ एक मनका चुनें. संदंश का उपयोग दो हिस्सों में पार से जुड़े dextran जेल मनका काटें.
   22. धीरे अंडाकार आकृति की ओर उत्तल चेहरे के साथ इंजेक्शन छेद में एक पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका डाल दिया. अवतल की सीमा के आसपास के ड्यूरा-मेटर के साथ संपर्क में मिलता है जब तक धीरे नीचे की ओर अंडाकार आकृति और प्रेस को दूर करने के लिए नहीं ख्याल रखना.
   23. एक गिलास स्लाइड पर cyanoacrylate गोंद की एक बूंद रखो; DRO में एक दन्तखुदनी की नोक डुबकीगोंद की एक छोटी राशि लेने के लिए पी. जल्दी चारों ओर गोंद मुद्रांकन द्वारा आसन्न ड्यूरा-मेटर को पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका के किनारों को सील. दंर्तखोदनी को पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका gluing से बचने के लिए तेजी से और सही आंदोलनों प्रदर्शन करने के लिए ध्यान रखना. एक बार सूखे इमेजिंग रोकने यदि नहीं फैला है और बाधित कर सकते हैं कि गोंद की अतिरिक्त बचें. गोंद सूखा और फिर पीबीएस समाधान के साथ कपाल - उच्छेदन और आसपास के हड्डी को साफ करने के लिए 2 मिनट रुको.
3. विंडो आरोपण
   1. कपाल - उच्छेदन ऊपर coverslip दौर 5 मिमी व्यास रखो (2.2.12 देखें). coverslip के किनारों कपाल - उच्छेदन के बाहरी पर पतला खोपड़ी पर होना चाहिए. coverslip किनारों पर ड्यूरा-मेटर और पतला हड्डी के साथ संपर्क में होना चाहिए. यह अन्यथा निशान ऊतक ऑप्टिकल स्पष्टता को विकसित करने और बाधा हो सकती है ड्यूरा-मेटर और कांच coverslip के बीच सीधा संपर्क होना बहुत जरूरी है.
   2. एक ऊतक के साथ, वें पर पीबीएस अवशोषितcoverslip के केंद्र में एक छोटा सा दबाव लागू जब ई coverslip किनारों कि समाधान तो पूरी तरह से कपाल - उच्छेदन कवर नहीं करता है. यह हड्डी, कांच और मस्तिष्क हित के क्षेत्र की ओर एक साथ चिपका रहे हैं यह सुनिश्चित करेगा.
   3. धीरे हड्डी और coverslip के बीच सीमा पर cyanoacrylate आवेदन करते समय एक संदंश के साथ coverslip के केंद्र में एक छोटे से दबाव बनाए रखें. गोंद अनायास पीबीएस समाधान के साथ इंटरफेस तक फैल जाएगा. समाधान गोंद की hydrophobicity दिए एक बाधा के रूप में कार्य करेगा. सील एक मिनट से भी कम समय में प्रभावी हो सकता है लेकिन यह तय हो गई है जब तक coverslip स्थानांतरित करने के लिए नहीं एक अत्यधिक ध्यान रखना चाहिए. इस अन्यथा ड्यूरा-मेटर इसलिए सर्जरी की विफलता के लिए नेतृत्व पर cyanoacrylate रिसाव पर नतीजा होगा.
   4. गोंद कांच के शीर्ष पर फैल गया होता मामले में यह अन्यथा ऑप्टिकल स्पष्टता कम हो सकता है, के रूप में सर्पिल आंदोलनों कर रही द्वारा एक माइक्रो स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर हटा दें. कांच coverslip ड्यूरिन तोड़ने के लिए नहीं बाहर देखोजी अत्यधिक दबाव के कारण प्रक्रिया.
   5. आसन्न खोपड़ी की ओर coverslip के किनारों पर दंत सीमेंट लगाने से गिलास निर्धारण एकीकरण. खोपड़ी जब तक पूरी उजागर खोपड़ी को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें. अतिरिक्त सीमेंट का प्रयोग, उद्देश्य के विसर्जन के लिए आवश्यक पूल बनाने के लिए coverslip के आसपास ओर दीवारों का निर्माण. दंत सीमेंट कम से कम 10 मिनट में ठीक हो जाएगा.

3. पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल और इमेजिंग के लिए तैयारी

1. पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल
   1. स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम से माउस निकालें, Dexamethazon (0.2 मिलीग्राम / किग्रा) और Rimadyl श्रोणि क्षेत्रों (5 मिलीग्राम / किग्रा) अनुसूचित जाति इंजेक्षन और एक गर्म ऊतक घोंसला साथ एक पिंजरे में उसे रखना.
   2. संज्ञाहरण के प्रभाव गायब हो गई है जब तक पशु मॉनिटर. सर्जरी के बाद सामान्य 2 से 3 घंटे में, चूहों पूरी तरह से मोबाइल हैं. पशु भोजन और पानी के लिए एक आसान पहुँच गया है कि सुनिश्चित करें. Agarose युक्त ग्लूकोज (साथ पशु प्रदान करें agarose3%, ग्लूकोज 3%).
   3. हर दिन पशु वजन पर नजर रखने और सर्जरी के बाद पहली 10D के लिए Dexamethazon (0.2 मिलीग्राम / किग्रा) और Rimadyl (5 मिलीग्राम / किग्रा) अनुसूचित जाति इंजेक्षन. नुकसान अपने मूल वजन के 15% से अधिक है जब नैतिक आधार के लिए, चूहों euthanize. Intracranial दबाव पशु के लिए मोटर impairments के लिए अग्रणी ट्यूमर के आकार के साथ बढ़ जाती है. यह निर्भर ट्यूमर सेल लाइन है और विभिन्न देरी के बाद सर्जरी पर होता है. विशेष देखभाल इस्तेमाल किया सेल लाइन के साथ प्रयोग के समापन बिंदु चिह्नित करने के लिए लिया जाना चाहिए.
2. इमेजिंग के लिए तैयारी
   1. हल्के से एक प्रेरण कक्ष (1 से 1.5 मिनट के लिए हवा में 1.5%) में isoflurane की साँस लेना द्वारा माउस शांत.
   2. Ketamine / xylazine (100 मिलीग्राम / किग्रा, 10 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण से एक अंतर peritoneal इंजेक्शन के साथ पशु anesthetize. इस तरह के एक संज्ञाहरण आम तौर पर अवलोकन के 45 मिनट की अनुमति देता है. अब इमेजिंग सत्र को करने के लिए माउस में isoflurane की निरंतर साँस लेना के तहत रखा गया हैहवा (0.25-0.75%).
   3. आंखों की सुखाना से बचने के लिए नेत्र मरहम लागू करें.
   4. एक stereotactic फ्रेम पर पशु रखो और earbars साथ खोपड़ी ब्लॉक.
   5. रक्त वाहिकाओं कल्पना, एक फ्लोरोसेंट डाई नसों में इंजेक्शन जा सकता है.
   6. खिड़की गंदा दिखता है, तो यह धीरे एक पतली ब्लेड और एक ऊतक के कोने से मलबे को हटाने से साफ किया जा सकता. यह हमेशा दंत सीमेंट के साथ संगत नहीं है और यह खिड़की से नीचे मस्तिष्क शांत कर सकते हैं के रूप में खिड़की साफ करने के लिए शराब का प्रयोग न करें.

Representative Results

शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल (चित्रा 1) किया जाता है एक बार, जानवरों बलिदान तक सप्ताह से अधिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा जा सकता है. एक भड़काऊ प्रतिक्रिया एक या दो सप्ताह के भीतर गायब हो जाता है कि सर्जरी के बाद देखा जा सकता है. ट्यूमर के विकास फ्लोरोसेंट macroscopy और दो ​​photon माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2) सहित विभिन्न माइक्रोस्कोपी तकनीक द्वारा मनाया जा सकता है. यहाँ दर्शाया उदाहरण के चित्र एक प्रतिदीप्ति macroscope और एक femtosecond स्पंदित अवरक्त tunable लेजर और घर संशोधित 20x पानी विसर्जन उद्देश्य (1.0NA) नीचे पशु पोजीशनिंग अनुमति देने के लिए करने के लिए मिलकर एक दो photon माइक्रोस्कोप पर महसूस किया गया.

ट्यूमर के विकास के उज्ज्वल क्षेत्र reflectance इमेजिंग और epifluorescence उत्सर्जन (आंकड़े 2A -2 सी) के लिए परोक्ष रोशनी संयोजन एक प्रतिदीप्ति macroscope का उपयोग समय के साथ अनुमान लगाया गया था. प्रतिदीप्ति की थ्रेशोल्डिंग आसानी ट्यूमर क्षेत्र के लिए पहुँच देता है, जबकि superficial vasculature दृश्य प्रकाश छवि का सफेद पृष्ठभूमि के बाहर के रूप में अंधेरे संरचनाओं अलग. दूसरी ओर intravital में दो photon माइक्रोस्कोपी Z-सेक्शनिंग और subcellular संकल्प के साथ देखने के बड़े क्षेत्रों के orthogonal पुनर्निर्माण (चित्रा 2 डी में डेन्ड्राइट देखें) की अनुमति देता है. (उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स में सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि Thy1-इंडोनेशियाई चूहों, चित्रा 2 डी में हरी छद्म रंग) इसे अपनी neuronal सूक्ष्म वातावरण में ट्यूमर प्रगति का निरीक्षण करने के लिए संभव है ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवर का उपयोग करना. हालांकि, यह ट्यूमर सेल घनत्व की वजह से वृद्धि हुई प्रसार के लिए फोटॉन प्रवेश गहराई के साथ ही उत्सर्जित फोटोन सीमा का पता लगाने सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. स्थानिक संकल्प स्वस्थ मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ट्यूमर में ड्यूरा बात के नीचे 200 मीटर में कमी करने के लिए शुरू होता है, लेकिन नहीं के रूप में यह स्पष्ट रूप से चित्रा 2 डी में दिखाई दे रहा है. इसके अलावा, दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी संकेत fro उत्पन्न होने वालीएम ऐसे मैं और III कोलेजन ड्यूरा-मेटर (चित्रा 2 डी और तीर में सियान छद्म रंग) के एक हस्ताक्षर प्रदान करता है प्रकार के रूप में गैर centrosymetric अणुओं के पैटर्न का आयोजन किया. यह हमारे शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल के साथ, ट्यूमर इसके विकास मस्तिष्क की शारीरिक बाधाओं से संचालित है जहां मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ड्यूरा-मेटर नीचे बढ़ता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. एक पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका के साथ ड्यूरा-मेटर की सीलिंग extradural अंतरिक्ष में glioma कोशिकाओं के भागने से बचाता है.

Intravital दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया जब अलग समय अंक के बीच ट्यूमर प्रगति सेलुलर संकल्प पर तुलना की जा सकती. D16 और D27 के बाद सर्जरी (चित्रा 3) हम 11 दिनों की अवधि में स्थिर थे कि तीर से प्रकाश डाला एक के रूप में कुछ रक्त वाहिकाओं पाया पर एक ही क्षेत्र इमेजिंग; दूसरी तरफ ट्यूमर सामने स्पष्ट रूप से इसी अवधि से अधिक स्वस्थ पैरेन्काइमा में घुसपैठ की. ट्यूमर प्रगति, अपनी मा का मूल्यांकन करने के लिएD27 पर मनाया rgin एक पीले बिंदीदार रेखा के साथ रेखांकित और D16 में लिया तस्वीर पर मढ़ा गया था. सामने बढ़त की एक 520 माइक्रोन पारी GL261 glioma मॉडल ¹⁵ की सूचना दी proliferative प्रोफाइल के साथ लगातार मनाया गया. ट्यूमर के अंदर संवहनी नेटवर्क के पैटर्न महत्वपूर्ण नाड़ी remodeling रोग क्षेत्रों (चित्रा 3) में होता है जो बताता है कि D16 और D27 पर बहुत अलग थे. ट्यूमर हाशिये पर, हम भी एक आक्रामक ट्यूमर से उम्मीद के रूप में ट्यूमर कोर से detaching glioma कोशिकाओं के मामलों में पाया गया. हमारे छवियों के सूक्ष्म संकल्प इन कोशिकाओं वे अपनी प्रगति (तीर और चित्रा 3 बी में Z-पुनर्निर्माण) के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में रक्त वाहिकाओं का उपयोग कर सकते हैं कि यह भी पर्यावरण भावना को cytoplasmic protrusions फेंकना लेकिन है कि न केवल दिखाया. दो photon माइक्रोस्कोपी इस प्रकार वास्तव में एक शारीरिक संदर्भ में सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. ब्याज की प्रत्येक कोशिका आबादी है जहां ट्रांसजेनिक जानवरों का प्रयोगयह रोग प्रगति (चित्रा 3 बी, सही) के प्रमुख नियामकों के रूप में ट्यूमर कोशिकाओं और अपने वातावरण के बीच शारीरिक संबंधों के अस्तित्व के लिए देखने के लिए संभव हो जाता है अपने आप ही फ्लोरोसेंट संवाददाता द्वारा की पहचान की.

सर्जरी के चित्रा 1. अवलोकन. कपाल - उच्छेदन छोड़ दिया पार्श्विका हड्डी (ए) पर किया जाता है. बाईं पार्श्विका हड्डी की सीमा एक बिंदीदार रेखा के साथ रेखांकित कर रहे हैं और हटाया हिस्सा पीला (बी) में भर जाता है. कपाल - उच्छेदन प्रदर्शन किया एक बार, पार्श्विका प्रांतस्था (सी) संपर्क में है, अंडाकार आकृति के इंजेक्शन के लिए क्षेत्र मुख्य रक्त वाहिकाओं (डी में तीर) और एक 26 गेज सुई ड्यूरा-मेटर को खोलने के लिए प्रयोग किया जाता है (से बचने के ख्याल रख चयन किया गया है ) ई में तीर. अंडाकार आकृति हैइंजेक्शन और ड्यूरा-मेटर में छेद cyanoacrylate गोंद (एफ में तीर) के साथ बंद एक पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका से भरा हुआ है. मस्तिष्क के साथ संपर्क रखते हुए एक गिलास coverslip हड्डी से चिपके है. coverslip आगे पुरानी टिप्पणियों (जीआई) के लिए कपाल खिड़की के दीर्घकालिक ठोस लगाव सुनिश्चित करने के लिए संपर्क में खोपड़ी के लिए एकजुट है. पूरे प्रोटोकॉल संक्षेप जम्मू में schematized है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2. ट्यूमर के विकास मस्तिष्क पैरेन्काइमा तक ही सीमित है और समय. एसी पर नजर रखी जा सकती है. ट्यूमर के विकास (DsRed2 व्यक्त GL261 सेल लाइन) एम द्वारा मनाया जाता हैसर्जरी के दिन (करते हैं, एक) पर और दिनों 21 (बी) में acroscopy और 27 (सी). सी में Arrowhead कदम 2.3.5. डी दौरान हटाया नहीं गया था कि दंत सीमेंट की एक बूंद पर प्रकाश डाला गया. D20 के बाद सर्जरी पर दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा एक GL261 ट्यूमर असर एक Thy1-इंडोनेशियाई माउस में ड्यूरा-मेटर नीचे 300 माइक्रोन 0 से हासिल कर ली एक 3 एक्स 3 क्षेत्र से प्राप्त विषयेतर पुनर्निर्माण. ट्यूमर (लाल), दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (तीर, सियान) और न्यूरॉन्स (हरा) द्वारा मनाया ड्यूरा-मेटर. ट्यूमर मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ड्यूरा-मेटर नीचे बढ़ता ध्यान दें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3. Vascular remodeling और ट्यूमर कोशिकाओं पर आक्रमण intravital दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर स्थानिक संकल्प के साथ समय पर नजर रखी जा सकती है. एक. GL261 ट्यूमर (लाल) रक्त वाहिकाओं को उजागर करने के लिए झरना नीले dextran 70 केडीए के एक अंतःशिरा इंजेक्शन के बाद D16 और D27 के बाद सर्जरी में मनाया. बिंदीदार रेखा: D27 में ट्यूमर मार्जिन; तीर:. D16 और D27 बी में एक ही क्षेत्र स्थानीयकरण करने के लिए स्थलों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि रक्त वाहिकाओं का उदाहरण. आक्रमण (तीर) के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में रक्त वाहिकाओं का उपयोग कर, व्यक्तिगत ट्यूमर कोशिकाओं (लाल) स्वस्थ मस्तिष्क पैरेन्काइमा (हरे न्यूरॉन्स) पर आक्रमण. छवियाँ 100 से ड्यूरा बात नीचे 150 माइक्रोन से लेकर गहराई में ले जाया गया. बिंदीदार रेखा:. क्षेत्र नीचे केंद्र पैनल में दर्शाया orthogonal पुनर्निर्माण महसूस किया गया, जहां बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

यह दृष्टिकोण ऑप्टिकल इमेजिंग तरीकों का उपयोग दिनों और हफ्तों के एक orthotopically प्रत्यारोपित glioma के विकास पर नजर रखने के लिए अनुमति देता है. वही पशु बाद में विकृति के दौरान लगभग किसी भी मस्तिष्क इमेजिंग साधन के अधीन किया जा सकता है; अभी तक दो photon माइक्रोस्कोपी विशिष्ट तैयारी जीवित जानवरों के दिमाग के अंदर subcellular संकल्प को प्राप्त करने के लिए अद्वितीय अवसर प्रदान करता है. हमारे प्रोटोकॉल glioma कोशिकाओं क्षतिग्रस्त ड्यूरा के माध्यम से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को छोड़ सकते हैं यदि ऐसा होता है के रूप में नहीं बल्कि अतिरिक्त durally से मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ट्यूमर के विकास को लागू करने के लिए लाभ प्रस्तुत करता है. मस्तिष्क वातावरण द्वारा लगाए शारीरिक बाधाओं के अभाव में, ट्यूमर सेल वास्तव में वे पैरेन्काइमा ¹⁶ घुसपैठ करने की जरूरत नहीं है के रूप में तेजी से पैदा कर सकते हैं. पहले प्रकाशित तरीकों बल्कि वे spheroids से कोशिकाओं के निलंबन इंजेक्शन से सभी को और अधिक समस्याग्रस्त था जो ग्राफ्टिंग के बाद ड्यूरा मेटर को सील करने का प्रयास नहीं किया^9,13,14. कोशिकाओं के निलंबन वास्तव में गहराई से ड्यूरा-मेटर को पिपेट वापस लेने जब व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए व्यवस्थित इंजेक्शन पथ साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं के रूप में focally लागू करने के लिए असंभव है.

मौजूदा प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक और immunosuppressed पशुओं सहित विभिन्न माउस उपभेदों पर लागू किया जा सकता है. विभिन्न glioma सेल लाइनों grafted और सीधे जब तक वे stably एक फ्लोरोसेंट संवाददाता पूर्व ग्राफ्टिंग व्यक्त करने ट्रांसफ़ेक्ट हैं के रूप में मानव बायोप्सी से प्राप्त कोशिकाओं सहित देखे जा सकते हैं. सर्जिकल प्रोटोकॉल आम तौर पर 1 घंटा में प्रदर्शन किया जा सकता है और पशुओं के साथियों जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण इस प्रकार के ट्यूमर में नाड़ी remodeling, angiogenesis और ट्यूमर के विकास पर औषधीय उपचार के प्रभाव है, साथ ही प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब जरूरत glioma सेल प्रवास और glioma कोशिकाओं और microenvironment के बीच गतिशील बातचीत कई Hou के लिए वास्तविक समय में देखा जा सकता हैरुपये.

इमेजिंग 500 माइक्रोन की गहराई पर किया जा सकता है के रूप में यह मात्रा ट्यूमर के सबसे शुरू में ड्यूरा-मेटर नीचे 200 माइक्रोन प्रत्यारोपित कवर करने के लिए संभव है. यह सुनिश्चित करने के लिए अधिक से अधिक इमेजिंग गहराई विशेष देखभाल ड्यूरा-मेटर और कांच coverslip के बीच शारीरिक संपर्क बनाने के लिए सर्जरी के दौरान लिया जाना चाहिए. यह वास्तव में अन्यथा ऑप्टिकल स्पष्टता समझौता होगा कि निशान ऊतक के गठन को कम कर देता है. शल्य चिकित्सा के माहौल का पूर्ण बाँझपन भी क्षणिक खिड़की blurs कि बाद सर्जरी सूजन सीमित करने के लिए मनाया जाना चाहिए. हम वैसे भी इष्टतम इमेजिंग की स्थिति प्राप्त करने के लिए सर्जरी और पहली टिप्पणी सत्र के बीच 15 दिनों के इंतजार के लिए सलाह. इसके बाद, खिड़की ट्यूमर अंडाकार आकृति का इंजेक्शन छोड़कर पूरे प्रोटोकॉल लिया कि दिखावा संचालित जानवरों पर सर्जरी के बाद एक साल तक स्पष्ट ऊपर रहने के लिए मिला था.

अंत में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मौजूदा orth के एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता हैotopic glioma माउस मॉडल पुरानी intravital दो photon माइक्रोस्कोपी के लिए समर्पित किया. एक ट्यूमर अंडाकार आकृति का सतही इंजेक्शन, इंजेक्शन के clogging एक पार से जुड़े dextran जेल Hemi-मनका और ड्यूरा-मेटर वास्तव में सामान्य रूप से रोग प्रगति गवर्निंग भौतिक बाधाओं का स्मरण दिलाता है कि मस्तिष्क वातावरण में ट्यूमर के विकास को लागू की सील के साथ ट्रैक. इस विधि glioma pathophysiology पर मौलिक पढ़ाई में काम करेगा लेकिन यह भी preclinical परीक्षण के दौरान औषधीय परिणामों की प्रासंगिकता सुधार नहीं होगा ही.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों गरमी डा. केके Fenrich, डा. एमसी धन्यवाद. Amoureux, पी. वेबर और उपयोगी विचार विमर्श के लिए ए Jaouen; एम. Hocine, सी. Meunier, एम. Metwaly, एस Bensemmane, जे Bonnardel, IBDML में जानवरों की सुविधा और तकनीकी समर्थन के लिए IBDML पर PicSIL इमेजिंग मंच के कर्मचारियों का स्टाफ. इस काम जीआर, एजेंस Nationale डे ला Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), फेडरेशन के राष्ट्रीय Institut डु कैंसर (Inca-DGOS-INSERM6038) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था महासंघ से फैलोशिप द्वारा, एफडी को ला Recherche सुर ले Cerveau (एफआरसी) डालना सीआर के लिए डी ला Recherche médicale और Cancéropole PACA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

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