Summary
我々は、腫瘍の成長の間の遊びで、通常の生物物理学的な制約を再現生体2光子顕微鏡用マウスにおける皮質同所神経膠芽腫モデルを確立している。腫瘍の上に頭蓋骨を交換慢性ガラス窓は、2光子顕微鏡による経時的な腫瘍進行のフォローアップを可能にします。
Abstract
多形性膠芽腫（GBM）は、これまでの利用可能な治癒的治療と脳腫瘍の最も積極的な形式です。
この病理のマウスモデルは、耐久母校の切開後の脳実質への神経膠腫細胞の懸濁液の注入に依存しています。細胞は生体2光子顕微鏡にアクセスできるように表面的に注入されなければならないのに対して、表面的な注射は生理病理学的条件を再現することができない。実際に、注入管を通って逃げるほとんどの腫瘍細胞は、それらが実質組織から機械的制約の非存在下で異常に速い展開硬膜外空間に到達する。
我々の改良が局所的に神経膠腫スフェロイドを注入するのではなく、大脳皮質の浅層においてもsurrounに接着されている架橋デキストランゲル半ビードにより注射部位を詰まらにおける神経膠腫細胞の懸濁液を注入するだけでなく構成されてい丁実質およびシアノアクリレートと耐久母校に密封さ。要するに、これらの手段は、脳実質の内部の腫瘍細胞の生理学的膨張および浸潤を強制。開頭術は、最終的にガラス窓で閉じた瘢痕組織の発達の非存在下で数週間にわたって慢性的イメージングを可能にするために頭蓋骨に接合。
我々は、神経膠細胞、ニューロン（ 例えば、THY1-CFPマウス）および血管系（蛍光色素の静脈内注射によって強調されている）との間に生じる相互作用の動力学は、生体によって視覚化することができることを示した蛍光腫瘍細胞でグラフト化された蛍光体トランスジェニック動物を利用して疾患の進行中に二光子顕微鏡。
画像への可能性を最小限に妥協脳環境での微視的な解像度で腫瘍が神経腫瘍学および薬物検査の分野に利益をもたらすべきである現在のGBM動物モデルの改善を示す。
Introduction
多形性膠芽腫では12ヶ月の生存期間中央値は、5％の5年生存率は成人で脳腫瘍の最も積極的な形として表示されます。臨床管理は、手術、放射線療法、しばしば組み合わせて使用される化学療法に依存しています。しかしながら、これらの治療の効果は姑息1-3残る。
これまで、神経腫瘍学の研究のほとんどは、静的なビューを提供することができる技術に依存して、腫瘍を有する動物の大コホートに対して実施（実施例4,5参照）異なる時点で屠殺した。生体内画像化に基づいて、フォローアップ法の最近の開発は、神経膠腫の増殖及び腫瘍細胞の経時同じ動物に対するそれらの病態生理学的な微小環境との間の相互作用を研究することができる。これは6これまで達成できなかった情報の排他的な作品への道を開きます。目的の細胞に蛍光タグを発現するトランスジェニック動物は、使用することがあります本論文では、腫瘍細胞とEGニューロン間の特異的相互作用を研究するD。
過去10年間で、生体2光子顕微鏡7は、基本的な神経腫瘍学の研究として（> 500ミクロンデュラ硬膜の下に）マウスの脳の深い生体内観察を行う能力について前臨床試験8,9におけるゴールドスタンダードとなっているマイクロメートル空間分解能10。慢性頭蓋窓11を移植同所動物モデルを用いた生体二光子顕微鏡を用いて、同じマウス9,12に経時的に腫瘍の進行を追跡することが可能である。
これらの以前に公表された動物モデルの主要な欠点の一つは、耐久硬膜細胞懸濁液の注射後9,13,14シールされていないとして、腫瘍の成長を支配する物理的制約を模倣しないことがある。神経膠腫細胞を、漏れること硬膜外の空間異1に同所神経膠腫モデルを変換する。
ここで紹介する動物モデルは、架橋デキストランゲル半ビーズおよび組織互換性のある接着剤で耐久母校のシールが続く200μmの深さで、大脳皮質内の蛍光神経膠腫細胞の回転楕円体の注入で構成されています。腫瘍の成長は、その後、病態生理学、物理的な制約を維持し脳実質に限定されています。腫瘍の上に移植され、慢性ガラス窓は、生体2光子顕微鏡のための簡単な光学アクセスを可能にする。関心対象の細胞における蛍光タグを発現するトランスジェニック動物を用いたが、経時的に神経膠腫の増殖のフォローアップを行うために（ここでは、蛍光デキストランで強調ニューロンおよび血管系を含む）、その微小環境との相互作用を研究することが可能である。
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Protocol
全ての実験手順は、実験動物の管理と使用に関する（86/609/EEC）フランスの法律に従ったと1986年11月24日の欧州共同体理事会指令に準拠して実施した。動物研究は方向DépartementaleDESサービスVétérinairesDESブーシュデュローヌ（ライセンスD-13-055から21）で承認され、プロヴァンスコートダジュールN°14（プロジェクト87から04122012）の倫理委員会によって承認された。
1。スフェロイドの準備
- アガロースでコーティングされたペトリ皿の調製
- ウシ胎児血清を補充していない細胞培養培地100mlでアガロース1gを混合する。電子レンジで使用します（40秒850ワット、その後3×15秒、各マイクロ波セッション間でソリューションをかき混ぜる）ソリューションを沸騰させると、完全にアガロースを溶解する。殺菌を確実にするために120℃で20分間、この1％アガロース溶液をオートクレーブ。LITY 注 ：完全にオートクレーブプロトコルの前にアガロースを溶解するために注意してください。不均一性は、スフェロイドの形成を損なう可能性がある。
- 一度オートクレーブから取り出され、100×20mmのペトリ皿の中で1％アガロース溶液10mlを注ぐ。 1％アガロース溶液が固化することを可能にするために、室温でペトリ皿を20分のままにしておきます。
- 湿度を維持するために、アガロース上で10mlのPBSを追加します。蒸発を防ぐためにパラフィルムで覆って、アガロースでコーティングされたペトリ皿のふたを密封する。適切PBS層により加湿場合ペトリ皿を4℃で最長2ヶ月間保存することができる。
- 回転楕円体の文化
- 75cm 2のフラスコの中で、文化の単層としての推奨培地中の神経膠腫細胞。
- 神経膠腫細胞の2D単層を含有するフラスコから収集し、「プレコンディショニング培地」1.5mlの1％アガロースでコーティングされたペトリ皿の一方からPBSを交換してくださいS。
- 神経膠腫細胞の2D単層の入ったフラスコから培地を除去します。
- 静かに10mlのPBSで単層を洗浄します。
- トリプシン/ EDTA溶液の0.05％の2 mlを加え、37℃でフラスコ注 4分間インキュベートする：インキュベーション時間は、使用される細胞株に応じて変化し得る。
- 静かに細胞懸濁液をフラッシュ、トリプシンの作用を停止するための培地の8ミリリットルを追加します（注）。それが細胞死を増加すると、細胞懸濁液中の空気をフラッシュしないように注意してください。
- 無菌バイアル中の細胞懸濁液の6ミリリットルを入れた。
- 遠心分離器800 rpmでバイアル4分。
- 上清を除去し、静かに培養液3mlの細胞沈殿物を一時停止。
- 準備されたアガロースでコーティングされたペトリ皿に細胞懸濁液をシード。
- 所望の直径のスフェロイドが形成されるまで2〜3日間、5％CO 2雰囲気中37℃でペトリ皿に入れた。
2。スフェロイドとウィンドウ移植 - 注入システムの製造
- 10分間、70％エタノール中で超音波処理によって清浄なガラスキャピラリー（直径1mm）。乾燥するまでインキュベーター内の水の前に配置して2回すすいでください。
- 少量入荷を準備するために、ピペットプラーを持ついくつかの洗浄したガラスキャピラリを引き出します。
- 典型的には300〜350ミクロンの外径および250〜300ミクロンの内径：所望の大きさの斜角端を得るために、ティッシュ紙の上に先端を引っ掻くことによって引っ張らキャピラリの先端を破る。この成形工程の間に、目盛り付き接眼ミラが装備されているマクロスコープを使用して、キャピラリーの直径を制御する。
- 内径のキャピラリーの外径に適合するプラスチックチューブの部分を使用して、3ウェイ·マニホールドに毛細血管の非ベベル四肢を接続します。
- プラスチックtubinを使用してgが、マニホールドの2つの方法を接続する 25μlのマイクロリットルシリンジ及び組織適合性鉱油を装填1mlシリンジに。
- マイクロシリンジおよび1ミリリットルの注射器間の経路を確立するために、マニホールドセレクタを調整します。削除する マイクロシリンジのピストンと、それが1ミリリットル注射器のピストンを押すことにより漏出するまで後方にマイクロシリンジにミネラルオイルを注入。チューブ内の気泡を残さないように注意しながらマイクロシリンジのピストンを交換してください。
- キャピラリーと1ミリリットルの注射器間の経路を確立するために、マニホールドセレクタを調整します。チューブ内の気泡を残さないように注意しながら、それが先端から漏れ出すまでミネラルオイルでキャピラリーを埋める。
- マイクロシリンジとキャピラリ間の接続を確立するためにマニホールドセレクタを調整します。鉱油の約10μLを追い出す。
- PBS溶液にキャピラリ先端を浸しおよびマイクロシリンジのゲージを使用して、キャピラリー中のPBS5μlの中で吸う。石油とPBSの間のメニスカスがはっきりと見えることに注意してください。
- 手術マクロスコープの下にフィットする3軸マイクロマニピュレータに毛細血管を修正します。このシステムは、視覚的制御下に注射部位にキャピラリを標的化するために使用される。
- 回転楕円体の移植
- 軽く（1〜1.5分の間に、空気中の1.5％）、誘導室にイソフルランの吸入によりマウスを鎮静。
- ケタミン/キシラジン（120 mg / kgで、12 mg / kg）の混合物の腹腔内注射で動物を麻酔。麻酔は、多くの場合、動物の体温を低下させることに留意されたい。これは、26℃の室内で手術を続行すると、基になるthermocontrolled加熱パッドで動物を暖かく保つことをお勧めします。
- 眼の乾燥を避けるために、眼軟膏を適用します。
- 動物の頭皮を剃る。
- 場所耳のバーやマウスピースを使って定位フレーム内の動物。
- ポビドンヨード（3％の石鹸は、10％溶液）で皮膚をきれいにします。
- メスで頭皮の中央に縦方向に長さ1cmの切開を加えます。はさみは頭頂骨の上の皮膚を切り取って削除]を使用。
- メスの刃で軽く頭蓋骨の上に骨膜を除去します。寛大に後でセメント遵守のための粗面を生成するために、骨の上にシアノアクリレートを適用します。
- 直径4mmの開頭を生成するために、外科的マクロスコープの下頭頂骨をドリル。寛大な加熱を防止するために、全体の手順の間、ペニシリン（1,000 U / ml）とStreptomicin（1ミリグラム/ ml）を含む氷冷PBSを追加します。鉗子とウェット滅菌ガーゼの小さな骨片を取り除く。出血を避けるために、離れて頭頂頭蓋骨縫合から少なくとも1ミリメートルのドリルに注意してください。
- ガラス窓が密封される開頭の境界で薄い骨。目的は、Eにある脳とガラスの間の最大接触面を有するガラス窓に、Nsureカート平面位置決め。ゆっくりとピンセットを用いて骨を除去し、PBS溶液で公開される耐久母校を清掃してください。
- 、直径5mm丸いガラスカバースリップを取るアルコールでそれをきれいにし、ティッシュペーパーでそれを乾燥させます。開頭のための蓋としてカバースリップを使用して、脳の大型フラット表面はガラスと接触に入っていることを確認してみてください。必要に応じて、カバーガラスに、さらに薄い側の骨を取り除く。そっと場所で一度カバースリップ上で圧力をかけた場合、脳がフラット絞ら取得できるようになるまで進みます。
- 再びアルコールでカバーガラスを清掃し、ティッシュペーパーで乾かし、そして離れてそれを保存します。
- 26ゲージの針で、まだメインの血管を避け開頭の中心部に耐久母校に穴を作る。このステップの目的はただ耐久母校を開くことですとして脳実質を損傷しないように注意してください。
- 優しく耐久母校のWIをきれいに出血性の血液を除去するためにPBS溶液を番目。回転楕円体の注入を準備している間ティッシュペーパーの切れ端でカバーしています。
- ステップ2.1で作成回転楕円噴射システムでは、ステップ1.2で作成ペトリ皿からキャピラリー内径（約200〜250μm）をフィッティングラウンド回転楕円体を吸う。回転楕円体は、大きく分けて5μlの培養液と一緒に来る必要があります。それは、その重みで毛細管現象の先に落ちるべきです。
- 開頭術をカバーするために使用されるウェットティッシュペーパーを取り外し、注入システムの下で動物を配置します。
- それは耐久母校で行われた穴に接触するまでインジェクションピペットを下げます。すると、250ミクロンで再びそれを下げる。 30秒待ってください。
- ゆっくりとティッシュペーパーの薄片に余分な液体を汲み出しながらマイクロシリンジのピストン（2-3μl）を使用して、回転楕円体を注入する。 30秒待ってから、ゆっくりと表面に向かって50ミクロンでインジェクションピペットを持ち上げます。 30秒とrepea再び待つ表面までの50μmのステップによるリフティング手順T。時間を待って、ピペットに固執するだろう回転楕円体の抽出を避けることができます。
- 蛍光マクロスコープを用いて脳内の回転楕円体の存在を確認する。
- シャーレ内のPBS溶液で、100〜300ミクロン径架橋デキストランゲルビーズをミックス。 1分待ってから、いくつかの水和ビーズを釣る。開頭術に隣接した骨の上に置きます。
- 巨視的制御の下で、耐久母校の開口部の大きさと同様、直径1のビーズを選択してください。鉗子を使用して2等分における架橋デキストランゲルのビーズをカット。
- 静かに回転楕円体に向かって凸顔を注入穴に架橋デキストランゲル半ビーズを入れる。凹のフロンティアは、周囲の硬膜-硬膜との接触に入るまでゆっくり下降回転楕円体を押して削除しないように注意してください。
- ガラススライド上にシアノアクリレート接着剤の滴を置く; DROに爪楊枝の先端を浸し少量の接着剤を取るためのp。すぐに周囲に接着剤を打ち抜いて、隣接する硬膜-母校に架橋デキストランゲル半ビードの端をシールします。爪楊枝に架橋デキストランゲルヘミビーズを接着避けるために、迅速かつ正確な動作を行うように注意してください。乾燥させた後に画像化を防ぐことはできません場合は、広がり、妨げることができ、接着剤の過剰を避ける。接着剤が乾燥した後、PBS溶液で開頭術や周囲の骨をきれいにするために2分待ちます。
- 窓注入
- （2.2.12を参照）開頭の上に直径5mmの円形のカバースリップを置く。カバーガラスの縁は開頭の外側に薄くなった頭蓋骨上にある必要があります。カバースリップをし、縁は耐久母校と薄くなった骨と接触していなければならない。そうでなければ、瘢痕組織が光学的透明度を開発し、妨げることができる耐久硬膜とカバーガラスとの間の直接的な接触を持つことが非常に重要である。
- 組織と、日にPBSを吸収電子カバースリップの縁部カバースリップの中央に小さな圧力を加えたとき、溶液は完全に開頭術を覆わないようにする。これは、骨、ガラスおよび脳が関心のある領域の側面に互いに接着されていることを保証する。
- そっと骨とカバーガラスの間の境界にシアノアクリレートを加えながらピンセットでカバースリップの中央に小さな圧力を維持する。接着剤は、自発的にPBS溶液との界面まで拡散する。解決策は、接着剤の疎水与えバリアとして機能します。シールは、分未満に効果があるが、それが修正されるまで、カバースリップを動かさないように細心の注意を取る必要があります。これはそうでない、したがって手術の失敗につながる耐久母校にシアノアクリレート漏れをもたらすであろう。
- 接着剤がガラスの上に広がっていた場合、それはそうでなければ、光学的透明度を減少させることができるように、らせん状の動きを実行して、マイクロ手術用メスの刃を使用して、それを削除してください。ドゥリンカバーガラスを壊さないように気を付けるG過度の圧力による手順。
- 隣接頭蓋骨に向かってカバースリップの端に歯科用セメントを適用することにより、ガラスの固定を統合。頭皮まで全体公開される頭蓋骨をカバーすることを確認します。余分なセメントを使用して、目的の浸漬に必要なプールを作成するためにカバースリップの周りに側壁を構築する。歯科用セメントは、10分未満で硬化する。
- 術後ケア
- 定位フレームからマウスを外し、Dexamethazon（0.2 mg / kg）をしてアノルフィン骨盤領域の上（5 mg / kg）を皮下に注入し、温かい組織巣をケージに彼女を置く。
- 麻酔の効果が消えてまで、動物を監視します。手術後の一般的な2〜3時間で、マウスは完全に可動である。動物が食料や水への容易なアクセスを持っていることを確認してください。アガロース（グルコースを含むアガロースを動物に提供する3％、グルコース3％）。
- 毎日動物の体重を監視し、手術後の最初10D用Dexamethazon（0.2 mg / kg）をし、アノルフィン（5 mg / kg）を皮下注射する。損失がその元の重量の15％を超えると倫理的配慮のために、マウスを安楽死させる。頭蓋内圧は、動物のための運動障害をもたらす腫瘍の大きさと共に増加する。これは、依存性腫瘍細胞株であり、様々な遅延が術後に発生する。特別な注意は、使用される細胞株を用いた実験のエンドポイントを特徴づけるために注意する必要があります。
- イメージングのための準備
- 軽く誘導室（1〜1.5分間、空気中の1.5％）でイソフルランの吸入によりマウスを鎮静。
- ケタミン/キシラジン（100 mg / kgで、10 mg / kg）の混合物の腹腔内注射で動物を麻酔。このような麻酔は通常観察の45分を可能にします。より長いイメージングセッションを実行するために、マウスにイソフルランの連続的な吸入の下に配置される空気（0.25から0.75パーセント）。
- 眼の乾燥を避けるために、眼軟膏を適用します。
- 定位フレームに動物を入れて、earbarsで頭蓋骨をブロックします。
- 血管を可視化するために、蛍光色素を静脈内注射することができる。
- 窓が汚れて表示される場合は、緩やかに薄い刃と組織の隅にデブリを除去することにより洗浄することができる。それは常に、歯科用セメントと互換性がありませんし、それがウィンドウの下に脳を冷却することができるように窓をきれいにアルコールを使用しないでください。
3。術後ケアとイメージングのための準備
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Representative Results
外科的プロトコルは（ 図1）が実行されると、動物は屠殺まで週にわたって蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。炎症反応は、1〜2週間以内に消失する手術後に観察することができる。腫瘍増殖は、蛍光肉眼及び二光子顕微鏡法（ 図2）を含む種々の顕微鏡技術によって観察することができる。ここに示された例のイメージは、蛍光マクロスコープ及びフェムト秒パルス赤外波長可変レーザとホーム変性20X水浸対物レンズ（1.0NA）下記の動物の位置決めを可能にするように結合された二光子顕微鏡で実現された。
腫瘍の発達は、明視野反射率イメージングおよびエピ蛍光発光（ 図2A〜2C）のための斜方照明とを組み合わせた蛍光マクロスコープを用いて経時的に推定された。蛍光の閾値処理を簡単superfながら腫瘍領域へのアクセスを提供しますicial血管系は、可視光画像の白地から暗い構造を切り離す。一方の生体二光子顕微鏡で細胞内分解能で、大きな視野のz切片と直交再構成します（ 図2Dに樹状突起を参照）ことができます。 （例えば、ニューロンにおけるシアン蛍光蛋白質を発現THY1-CFPマウスは、 図2Dの緑色擬似カラー）は、その神経細胞の微小環境において腫瘍の進行を観察することが可能である関心対象の細胞内で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物を用いた。しかしながら、腫瘍細胞の密度が増加による拡散光子侵入深さ、並びに出射光子検出を制限することができることに留意しなければならない。空間分解能は、腫瘍内の硬膜と物質を以下200程度ではなく、健康な脳実質に低下し始めるので、これは図2Dにはっきりと見える。また、第二高調波発生信号があちこちに発生するMは、IとIII型コラーゲンは、耐久母校（ 図2D、矢印でのシアンの擬似カラー）のシグネチャを提供する型の非centrosymetric分子のパターンを組織した。それは私たちの外科プロトコルで、腫瘍はその開発は、脳の物理的な制約によって支配されている脳実質内デュラ硬膜の下に成長することに注意しなければならない。架橋デキストランゲルヘミビーズと耐久母校のシールは、硬膜外空間に神経膠腫細胞の脱出を防ぐことができます。
生体二光子顕微鏡法に続いたときに異なる時点の間の腫瘍の進行は、細胞の解像度で比較することができる。 D16とD27の手術後（ 図3A）で同じ領域を撮影する私たちは、11日の期間にわたって安定していた矢印で強調を含む一部の血管を発見。一方、腫瘍のフロントは明らかに同じ期間に健康的な実質に浸潤し。腫瘍進行、そのミリアンペアを評価するためにD27で観察rginは黄色の点線で輪郭やD16で撮影した画像の上に重ねた。前縁部の520ミクロンシフトはGL261神経膠腫モデル15の報告された増殖性プロファイルと一貫して観察された。腫瘍内部の血管網のパターンが重要な血管リモデリングは、病理学の領域（ 図3A）で発生していることを示すD16とD27に非常に異なっていた。腫瘍のマージンでは、我々はまた、浸潤性腫瘍から予想されるように、腫瘍のコアから取り外し神経膠腫細胞の例を見つけました。我々の画像の微視的な解像度は、これらの細胞が環境を感知するだけでなく、彼らは彼らの進行（矢頭および図3（b）のZ-再構成）のためのマトリックスとしての血管を使用することができ、細胞質突起を放出していることだけでなく、示された。二光子顕微鏡は、このように真の生理的な文脈で細胞間相互作用を研究することができます。関心のある各細胞集団は、トランスジェニック動物を使用それは病気の進行（ 図3B、右）の重要な調節因子として、腫瘍細胞とその環境との間の物理的相互作用が存在するかどうかを調べることが可能となり、独自の蛍光レポーターで識別。
図1の手術の概要。開頭は、左頭頂骨（A）上で実行される。左頭頂骨の限界は点線で概説されているし、除去された部分は、黄色（B）に封入されている。開頭術を行った後、頭頂皮質（C）に露出され、回転楕円体の注入のための領域は、主血管（D、矢印）を避けるように注意して選択され、26ゲージの針が硬膜、硬膜を（開くために使用され）、Eの矢印。回転楕円体である注入し、耐久母校の穴は、シアノアクリレート接着剤（Fの矢印）で封止されて架橋デキストランゲル半ビーズで詰まっています。脳との接触を維持しつつ、ガラスカバースリップは、骨に接着される。カバーガラスは、さらに慢性の観測（GI）のための頭蓋窓の長期固体添付ファイルを確実にするために公開される頭蓋骨に接着されている。全体のプロトコルを簡単にJに図式化されています。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2腫瘍の成長が脳実質に限定され、経時的にモニターすることができる。AC。腫瘍増殖（DsRed2のを発現するGL261細胞株）mで観察される手術の日（DO、A）上および日21（B）および27（℃）でacroscopy。 C言語で矢じりが、ステップ2.3.5。 開発中に削除されなかった歯科用セメントの低下を強調しています。 D20術後に2光子顕微鏡によるGL261腫瘍を有するTHY1-CFPマウスにおける耐久硬膜下の300μmの0から取得した3×3のフィールドから取得した直交再構成。第二高調波発生（矢印、シアン）、ニューロン（緑）で観察した腫瘍（赤）、耐久母校。腫瘍が脳実質内の硬膜-硬膜の下に成長することに注意してください。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。Vaはscularリモデリングおよび腫瘍細胞浸潤は、生体二光子顕微鏡による細胞の空間分解能で経時的にモニターすることができる。 。GL261腫瘍（赤）は血管を強調するためのカスケード·ブルーデキストラン70kDaの静脈内注射後のD16とD27術後に観察した。点線：D27での腫瘍マージン;矢印：D16及びD27 Bで同じ領域を局在化するための目印として使用することができる血管の例を示す。浸潤（矢印）のためのマトリックスとして血管を用いて、個々の腫瘍細胞（赤色）健康な脳実質（緑ニューロン）に侵入する。画像は硬膜と物質を以下100〜150ミクロンの範囲の深さで採取した。点線：地域下部中央のパネルに描か直交再建が実現した拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
このアプローチは、光学イメージング法の使用は、数日から数週間にわたって同所移植し、神経膠腫の成長を監視することができます。同じ動物は、その後、病理の過程中に実質的に任意の脳の撮像モダリティに供することができる。まだ2光子顕微鏡の特定の調製は、生きている動物の脳の中に細胞内分解能を達成するためのユニークな機会を提供しています。我々のプロトコルは、神経膠腫細胞が損傷した硬膜を通して中枢神経系を残すことができればそれが起こるよう超durally脳実質への腫瘍の成長を強制するのではなくするために利点を提供する。それらは実質16に浸透する必要がないように、脳の環境によって及ぼされる物理的な制約の非存在下では、腫瘍細胞は確かに速く増殖することができる。以前に公開されている方法は、彼らはむしろスフェロイドよりも細胞の懸濁液を注入されたよりも一層問題があった移植後硬膜をシールしようとしませんでした9,13,14。耐久母校への深さからピペットを引き抜く際に、個々の細胞が体系的に注入管に沿って播種するように、細胞の懸濁液は、確かに局所的に適用することは不可能である。
現在のプロトコルは、トランスジェニック動物および免疫抑制を含む様々なマウス系統に適用することができる。種々の神経膠腫細胞株であれば、それらが安定的に蛍光レポーター前のグラフト化を発現するようにトランスフェクトされたとして直接ヒト生検に由来する細胞を含む、グラフト化及び可視化することができる。外科的プロトコルは、典型的には1時間で行うことができ、動物のコホートを迅速に得ることができる。したがって、この手法は、腫瘍への血管リモデリング、血管新生および腫瘍増殖に対する薬物治療の効果、ならびに免疫細胞の動員を研究するために使用することができる。必要なときに神経膠腫細胞の遊走および神経膠腫細胞の微小環境との間の動的な相互作用は、いくつかの侯のために、即座に観察することができるRS。
イメージングは、500μmの深さにわたって行うことができるように、腫瘍体積の大部分をカバーすることができる最初に耐久硬膜下の200μmの移植。最大撮像深度を確保するために、特別な注意は耐久母校とカバーガラスの間の物理的接触を作成するために手術中に注意する必要があります。これは確かにそうでなければ、光学的透明度を損なうだろう瘢痕組織の形成を減少させる。手術環境の絶対無菌性も一過ウィンドウをぼかし、術後の炎症を制限することが観察されるべきである。私たちは、とにかく最適な撮影条件を得るために、手術と最初の観測セッションの間に15日を待つことをお勧めします。その後、ウィンドウは腫瘍球の注入を除いて、全体のプロトコルを受けた偽手術動物の手術後1年までの明確なままであることが見出された。
結論として、ここに記載されているプロトコルは、既存のオルトの改善を示してotopic神経膠腫のマウスモデルは、慢性生体2光子顕微鏡に捧げた。腫瘍球の表面注射、架橋デキストランゲルヘミビーズおよび耐久硬膜のシールが本当に正常に疾患の進行を支配する物理的な制約を再現脳環境において腫瘍の発達を強制注射トラックの詰まり。この方法では、神経膠腫の病態生理に関する基礎的研究サービスを提供しますが、それはまた、前臨床試験中の薬理学的な結果の関連性を向上させるだけではなく。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
著者は、暖かく博士KK Fenrich、博士のMCに感謝します。 Amoureux、P.ウェーバーで親切な議論のためのA. Jaouen; M.ホチン、C.ムニエ、M. Metwaly、S. Bensemmane、J. Bonnardel、IBDMLの動物施設と技術サポートのためのIBDMLでPicSILのイメージングプラットフォームのスタッフのスタッフ。この作品は、研究所国立デュがん（INCA-DGOS-INSERM6038）からGR、アジャン国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR JCJC PathoVisu3Dyn）への補助金によって支えられて、連盟は連盟フェローシップにより、FDにLAルシェルシュシュールルCerveau（FRC）を注ぐCRにデ·ラ·ルシェルシュMédicaleとCancéropoleご覧の皆様。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock - Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
References
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