El mantenimiento de un modelo de ratón ortotópico Glioblastoma Restricciones cerebral parenquimatosa físicas y Conveniente para intravital microscopía de dos fotones

Summary

Hemos establecido un modelo ortotópico de glioblastoma cortical en ratones para intravital microscopía de dos fotones que recapitula las limitaciones biofísicas normalmente en juego durante el crecimiento del tumor. Una ventana de cristal crónica reemplazando el cráneo por encima de la del tumor permite el seguimiento de la progresión del tumor con el tiempo por microscopía de dos fotones.

Abstract

El glioblastoma multiforme (GBM) es el tipo más agresivo de los tumores cerebrales sin tratamientos curativos disponibles hasta la fecha.

Los modelos murinos de esta patología se basan en la inyección de una suspensión de células de glioma en el parénquima cerebral después de la incisión de la duramadre. Considerando que las células se tienen que inyectar superficialmente para ser accesible a intravital microscopía de dos fotones, las inyecciones superficiales dejar de recapitular las condiciones fisiopatológicas. De hecho, escapando a través del tracto inyección mayoría de las células tumorales alcanzan el espacio extra-dural donde se expanden con mayor velocidad en ausencia de limitaciones mecánicas de la parénquima.

Nuestros mejoras consisten no sólo en focalmente la implantación de un esferoide de glioma en lugar de la inyección de una suspensión de células de glioma en las capas superficiales de la corteza cerebral, pero también en la obstrucción del sitio de la inyección por un gel de dextrano hemi-Bead reticulado que está pegado a la surrounding parénquima y sellado de duramadre con cianoacrilato. En total, estas medidas hacen cumplir la expansión fisiológica y la infiltración de las células tumorales en el interior del parénquima cerebral. Craneotomía se cerró con una ventana de cristal cimentado en el cráneo para permitir imágenes crónica durante semanas en ausencia de desarrollo de tejido cicatricial.

Tomando ventaja de los animales transgénicos fluorescentes injertados con células tumorales fluorescentes hemos demostrado que la dinámica de las interacciones que se producen entre las células de glioma, las neuronas (por ejemplo, ratones Thy1-PPC) y la vasculatura (resaltado por una inyección intravenosa de un colorante fluorescente) se pueden visualizar por intravital microscopía de dos fotones durante la progresión de la enfermedad.

La posibilidad de una imagen del tumor en la resolución microscópica en un ambiente cerebral mínimamente comprometida representa una mejora de los actuales modelos de animales con GBM que debería beneficiar al campo de la neuro-oncología y la prueba de la droga.

Introduction

El glioblastoma multiforme se presenta como la forma más agresiva de tumor cerebral en adultos con una supervivencia media de 12 meses y una de 5 años la tasa de supervivencia de 5%. El manejo clínico se basa en la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia a menudo se usan en combinación. Sin embargo, los efectos de estos tratamientos siguen siendo paliativa ^1-3.

Hasta ahora, la mayoría de los estudios de neuro-oncología se basan en técnicas que sólo son capaces de proporcionar una visión estática y realizar en grandes cohortes de animales portadores de tumores se sacrificaron a diferentes puntos de tiempo (véase, por ejemplo, ^4,5). El reciente desarrollo de métodos de seguimiento basado en intravital de imágenes permite el estudio del crecimiento glioma y las interacciones entre las células tumorales y su microambiente fisiopatológico en el mismo animal con el tiempo. Esto abre el camino a la exclusiva pieza de información que era hasta ahora inalcanzable ^6. Los animales transgénicos que expresan etiquetas fluorescentes en las células de interés puede ser de usod para estudiar las interacciones específicas entre las células tumorales y por ejemplo, las neuronas en este documento.

Durante la última década, intravital microscopía de dos fotones ⁷ se ha convertido en un estándar de oro en los estudios neuro-oncología fundamentales y ensayos preclínicos ^8,9 por su capacidad para llevar a cabo la observación profunda intravital de cerebro de ratón (> 500 m por debajo de la duramadre) con una resolución espacial micrométrica ^10. Uso de intravital microscopía de dos fotones con modelos animales orthotopical implantados con una ventana craneal crónica ^11, es posible seguir la progresión del tumor con el tiempo en el mismo ^9,12 ratón.

Uno de los principales inconvenientes de estos modelos animales publicados anteriormente es sin embargo que no imitan las limitaciones físicas que gobiernan el crecimiento del tumor como la duramadre no se sella después de la inyección de la suspensión celular ^9,13,14. Células de glioma pueden tener fugas en elespacio extradural transformar un modelo de glioma ortotópico en uno heterotópico.

El modelo animal presentado aquí consiste en la inyección de un esferoide de células de glioma fluorescentes en la corteza cerebral a una profundidad de 200 micras seguido por el sellado de la duramadre con un gel de dextrano hemi-Bead reticulado y pegamento compatible con histo . El crecimiento del tumor se limita entonces a la parénquima cerebral que mantiene las limitaciones físicas fisiopatológicos. Una ventana de cristal crónica implantados por encima del tumor permite un acceso óptico fácil para intravital microscopía de dos fotones. El uso de animales transgénicos que expresan etiquetas fluorescentes en las células de interés que es posible realizar un seguimiento de el crecimiento del glioma en el tiempo y para estudiar su interacción con su microambiente (aquí con las neuronas y la vasculatura resaltados con dextranos fluorescentes).

Protocol

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la legislación francesa y en cumplimiento de la Directiva del Consejo de la Comunidad Europea del 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE) para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La investigación en animales ha sido autorizada por la Dirección Départementale des Servicios Veterinarios des Bouches-du-Rhône (licencia D-13-055-21) y aprobado por el comité ético de Provence Côte d'Azur n ° 14 (Proyecto 87-04122012) .

1. Preparación Esferoides

1. Preparación de los platos de agarosa recubiertas de Petri
   1. Mezclar 1 g de agarosa con 100 ml de medio de cultivo celular no suplementado con suero bovino fetal. Utilice un horno de microondas (850 vatios durante 40 segundos, a continuación, 3 x 15 seg, y mezclar la solución entre cada sesión de microondas) a hervir la solución y para disolver completamente la agarosa. Autoclave esta solución de agarosa al 1% durante 20 min a 120 ° C para asegurar Steri. dad Nota: Tenga cuidado para disolver completamente la agarosa antes de que el protocolo de autoclave. Falta de homogeneidad puede comprometer la formación de esferoides.
   2. Una vez recuperado de la autoclave, se vierten 10 ml de la solución de agarosa al 1% en 100 x 20 mm placas de Petri. Deje la placas Petri 20 min a temperatura ambiente para permitir la solución de agarosa al 1% que se solidifique.
   3. Añadir 10 ml de PBS por encima de la agarosa para mantener la humedad. Sellar la tapa de los platos de agarosa recubiertas de Petri envolviéndolos con parafilm para evitar la evaporación. Cajas de Petri se pueden almacenar durante un máximo de 2 meses a 4 ° C si humedecido adecuadamente por la capa de PBS.
2. Cultura esferoide
   1. En un frasco, la cultura 75 cm ² las células de glioma en su medio recomendado como una monocapa.
   2. Sustituir el PBS de uno de los 1% de agarosa recubiertas de placa de Petri por 1,5 ml de "medio preacondicionado" recogidos desde el matraz que contiene la monocapa celular de glioma de 2Ds.
   3. Retire el medio del matraz que contenía la monocapa 2D de células de glioma.
   4. Enjuague suavemente la monocapa con 10 ml de PBS.
   5. Añadir 2 ml de 0,05% de una solución de tripsina / EDTA y se incuba el matraz de 4 min a 37 ° C. Nota: El tiempo de incubación puede variar de acuerdo con la línea celular utilizada.
   6. Añadir 8 ml de medio de cultivo para detener la acción de la tripsina, lave suavemente la suspensión celular Nota:. Tenga cuidado de no eliminar el aire en la suspensión de células a medida que aumenta la muerte celular.
   7. Ponga 6 ml de la suspensión celular en un vial estéril.
   8. Centrifugar el vial de 4 min a 800 rpm.
   9. Eliminar el sobrenadante y suavemente de suspender el sedimento celular en 3 ml de medio de cultivo.
   10. Sembrar la suspensión de células en la placa de Petri de agarosa recubiertas de preparado.
   11. Poner la placa de Petri a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO ₂ durante 2 a 3 días hasta que se forman esferoides de diámetro deseado.
2. Esferoide y ventana de implantación
1. Preparación del sistema de inyección
   1. Capilares de vidrio limpio (1 mm de diámetro) por sonicación en etanol al 70% durante 10 min. Enjuague dos veces con agua antes de colocar dentro de una incubadora hasta que se seque.
   2. Tire de varios capilares de vidrio limpios con un extractor de pipeta con el fin de preparar un pequeño stock.
   3. Romper la punta del capilar tirado por rascado la extremidad en un trozo de papel de seda para obtener un extremo biselado del tamaño deseado: típicamente un diámetro externo de 300-350 micras y un diámetro interno de 250-300 micras. Durante este proceso de conformación, controlar el diámetro del capilar usando un macroscopio cuya ocular está equipado con una mira graduada.
   4. Conectar el extremo no biselado del capilar a un colector de 3 vías usando un pedazo de tubo de plástico cuyo diámetro interior se ajusta al diámetro exterior del capilar.
   5. Usando tubin plásticog, conecte las otras dos formas del colector a un 25 l microjeringa y para una jeringa de 1 ml cargado con aceite mineral con capacidad para un histo.
   6. Ajuste el selector de colector para establecer una vía entre la jeringa de microlitro y la jeringa de 1 ml. Eliminar el pistón de la jeringa de microlitro e inyectar aceite mineral hacia atrás en la jeringa de microlitro hasta que se escapa por empujar el pistón de la jeringa de 1 ml. Vuelva a colocar el émbolo de la jeringa de microlitro, teniendo cuidado de no dejar burbujas de aire en el tubo.
   7. Ajuste el selector de colector para establecer una vía entre el capilar y la jeringa de 1 ml. Llene el capilar con aceite mineral hasta que se escapan de la punta, teniendo cuidado de no dejar burbujas de aire en el tubo.
   8. Ajuste el selector de colector para establecer una conexión entre la jeringa de microlitro y el capilar. Expulsar aproximadamente 10 l de aceite mineral.
   9. Sumerja la punta capilar en solución de PBSy utilizando el medidor de la jeringa de microlitros, aspirar 5μl de PBS en el capilar. Tenga en cuenta que el menisco entre el aceite y PBS es claramente visible.
   10. Fijar el capilar en un ajuste bajo la macroscopio cirugía micromanipulador 3 ejes. Este sistema se puede usar para dirigir el capilar para el sitio de la inyección bajo control visual.
2. Implantación del esferoide
   1. Ligeramente sedar el ratón por inhalación de isoflurano en una cámara de inducción (1,5% en el aire durante 1 a 1,5 min).
   2. Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Tenga en cuenta que la anestesia a menudo reduce la temperatura del cuerpo del animal. Se recomienda proceder con la cirugía en una habitación a 26 º C y para mantener al animal caliente con una almohadilla térmica termolaminado subyacente.
   3. Aplicar pomada para los ojos para evitar la desecación de los ojos.
   4. Afeitar el cuero cabelludo del animal.
   5. Lugarel animal en un marco estereotáctico usando barras de oído y una boquilla.
   6. Limpiar la piel con povidona yodada (3% de jabón, a continuación, solución al 10%).
   7. Hacer un 1 cm de largo incisión longitudinalmente en el centro del cuero cabelludo con un escalpelo. Con una tijera cortar y quitar la piel encima de los huesos parietales.
   8. Con una hoja de bisturí eliminar suavemente el periostio encima del cráneo. Aplicar generosamente cianoacrilato en la parte superior del hueso de generar una superficie rugosa para la adhesión posterior de cemento.
   9. Perforar el hueso parietal bajo un macroscopio quirúrgica para generar una craneotomía de 4 mm de diámetro. Añadir generosamente PBS enfriado con hielo que contiene penicilina (1000 U / ml) y estreptomicina (1 mg / ml) durante todo el procedimiento para evitar el calentamiento. Quite los pequeños fragmentos de hueso con una pinza y una gasa estéril húmeda. Tenga cuidado para perforar al menos 1 mm de distancia de las suturas craneales parietales para evitar hemorragias.
   10. Thin hueso en el borde de la craneotomía en la que se selló la ventana de cristal. Objetivo es esegurar más tarde de posicionamiento plano de la ventana de vidrio con superficie de contacto máxima entre el cerebro y el vidrio. Retire lentamente el hueso utilizando una pinza y limpie la duramadre expuesta con la solución de PBS.
   11. Tome un cubreobjetos de cristal redonda de 5 mm de diámetro, límpielo con alcohol y secarla con papel de seda. Trate de usar el cubreobjetos como una tapa para la craneotomía y confirmar que una gran superficie plana del cerebro entra en contacto con el vidrio. Si es necesario quitar el cubre a más delgado que los huesos laterales. Continúe hasta que el cerebro puede quedar apretado plano, si la aplicación de una suave presión sobre el portaobjetos una vez en su lugar.
   12. Limpie nuevamente el cubreobjetos con alcohol, séquela con un pañuelo de papel y guárdelo aparte.
   13. Con una aguja de calibre 26 hacer un orificio en la duramadre en el centro de la craneotomía pero evitando principales vasos sanguíneos. Asegúrese de no dañar el parénquima cerebral como el propósito de este paso es sólo para abrir la duramadre.
   14. Limpie suavemente la wi duramadreth solución PBS para eliminar la sangre hemorrágica. Cubrir con un trozo de papel de seda mientras se prepara la inyección de esferoide.
   15. Con el sistema de inyección de esferoide preparado en la etapa 2.1, chupar un esferoide ronda de montar el diámetro interno capilar (aproximadamente 200-250 micras) de la placa de Petri preparado en la etapa 1.2. Esferoide debe venir junto con aproximadamente 5 l de medio de cultivo. Se debe caer hacia abajo a la punta de la capilaridad en virtud de su peso.
   16. Retire el papel de tejido húmedo se utiliza para cubrir la craneotomía y coloque el animal en el sistema de inyección.
   17. Baje la pipeta de inyección hasta que toque el orificio hecho en la duramadre. Luego, baje de nuevo por 250 micras. Espere 30 seg.
   18. Inyecte lentamente el esferoide con el émbolo de la jeringa de microlitro (2-3 l) mientras se bombea el exceso de líquido con un trozo de papel de seda. Espere 30 segundos y luego levante suavemente la pipeta de inyección por 50 m hacia la superficie. Espere 30 segundos y de nuevo REPEAt el procedimiento de elevación por pasos de 50 micras hasta la superficie. Tiempos de espera evita la extracción del esferoide que se adhieren a la pipeta.
   19. Confirmar la presencia de la esferoide en el cerebro utilizando un macroscopio de fluorescencia.
   20. Mezclar 100 a 300 micras de diámetro perlas de gel de dextrano reticulado con una solución de PBS en una placa de Petri. Espere 1 minuto y pescar algunos granos hidratados. Colóquelos en el hueso adyacente a la craneotomía.
   21. Bajo el control macroscópico, elegir una bola con un diámetro similar al tamaño de la abertura de duramadre. Cortar el cordón de gel de dextrano reticulado en dos mitades utilizando fórceps.
   22. Coloque cuidadosamente un dextrano gel hemi-grano entrecruzado en el agujero de la inyección con la cara convexa hacia el esferoide. Tenga cuidado de no eliminar el esferoide y presione suavemente hacia abajo hasta la frontera de la parte cóncava entrar en contacto con la duramadre que rodea.
   23. Ponga una gota de pegamento de cianoacrilato en un portaobjetos de vidrio; moje la punta de un palillo en el visualizadorp para tomar una pequeña cantidad de pegamento. Sellar rápidamente los bordes del gel de dextrano hemi-Bead reticulado a la duramadre adyacente por estampación pegamento alrededor. Tenga cuidado al realizar movimientos rápidos y precisos para evitar el pegado del dextrano gel hemi-grano entrecruzado con el palillo de dientes. Evite el exceso de pegamento que se puede propagar e impedir, si no prevenir de imágenes una vez seco. Espere 2 minutos para que el pegamento se seque y luego limpiar la craneotomía y el hueso circundante con solución de PBS.
3. Implantación ventana
   1. Ponga el diámetro 5 mm ronda cubreobjetos encima de la craneotomía (véase 2.2.12). Los bordes del cubreobjetos deben estar en el cráneo adelgazada en el exterior de la craneotomía. El cubreobjetos debe estar en contacto con la duramadre y el hueso adelgazado en los bordes. Es muy importante tener un contacto directo entre la duramadre y el cubreobjetos de vidrio de otro modo el tejido cicatrizal puede desarrollar e impiden la claridad óptica.
   2. Con un pañuelo de papel, absorber el PBS en thbordes e cubreobjetos de modo que la solución no cubre totalmente la craneotomía al aplicar una pequeña presión en el centro del cubreobjetos. Esto asegurará que el hueso, el vidrio y el cerebro se pegan juntos en el lado de la región de interés.
   3. Mantener una pequeña presión en el centro del cubreobjetos con un fórceps mientras se aplica suavemente cianoacrilato en la frontera entre el hueso y el cubreobjetos. El pegamento se extendió de forma espontánea hasta que la interfaz con solución de PBS. Solución actuará como una barrera debido a la hidrofobicidad de la cola. Sellado debe ser efectiva en menos de un minuto, pero tomar un extremo cuidado de no mover el cubreobjetos hasta que esté arreglado. Esto sería lo contrario provocar fugas de cianoacrilato en la duramadre, por tanto llevar a un fracaso de la cirugía.
   4. En caso de que el pegamento se habría extendido en la parte superior de la copa, y eliminar el uso de una cuchilla de micro-bisturí haciendo movimientos en espiral, ya que de lo contrario puede reducir la claridad óptica. Tenga cuidado de no romper el cubreobjetos During el procedimiento debido a la presión excesiva.
   5. Consolidar la fijación de vidrio mediante la aplicación de cemento dental en los bordes del cubreobjetos hacia el cráneo adyacente. Asegúrese de cubrir todo el cráneo expuesto hasta el cuero cabelludo. El uso de cemento extra, construir paredes laterales alrededor del cubreobjetos para crear el grupo necesario para la inmersión del objetivo. El cemento dental se cura en menos de 10 min.

3. Cuidados postoperatorios y Preparación de la Imagen

1. El cuidado post-operatorio
   1. Retire el ratón del marco estereotáctico, inyecte Dexamethazon (0,2 mg / kg) y Rimadyl (5 mg / kg) sc sobre las regiones pélvicas y su sentar en una jaula con un pañuelo de papel-nido cálido.
   2. Monitorear el animal hasta que los efectos de la anestesia hayan desaparecido. En general de 2 a 3 horas después de la cirugía, los ratones son totalmente móviles. Asegúrese de que el animal tiene un fácil acceso a los alimentos y el agua. Proporcionar al animal con agarosa que contiene glucosa (agarosa3%, glucosa 3%).
   3. Monitorear el peso de los animales todos los días y se inyecta Dexamethazon (0,2 mg / kg) y Rimadyl (5 mg / kg) sc por primera 10d después de la cirugía. Por razones éticas, la eutanasia a los ratones cuando la pérdida supera el 15% de su peso original. La presión intracraneal se incrementa con el tamaño del tumor que lleva a deficiencias motoras para el animal. Esta es la línea de células tumorales dependientes y se produce a diversos retrasos después de la cirugía. Especial cuidado se debe tomar para caracterizar el punto final del experimento con la línea celular utilizada.
2. Preparación para la formación de imágenes
   1. Ligeramente sedar el ratón por inhalación de isoflurano en una cámara de inducción (1,5% en aire durante 1 a 1,5 min).
   2. Anestesiar al animal con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Tal anestesia permite típicamente 45 minutos de observación. Para llevar a cabo sesiones de formación de imágenes más largos, el ratón se coloca debajo de la inhalación continua de isoflurano enaire (0,25-0,75%).
   3. Aplicar pomada para los ojos para evitar la desecación de los ojos.
   4. Ponga el animal en un marco estereotáctico y bloquear el cráneo con los earbars.
   5. Para visualizar los vasos sanguíneos, un colorante fluorescente puede ser inyectado por vía intravenosa.
   6. Si la ventana se ve sucio, se puede limpiar suavemente quitando los escombros con una hoja delgada y la esquina de un pañuelo de papel. No utilice alcohol para limpiar la ventana, ya que no siempre es compatible con el cemento dental y puede enfriar el cerebro por debajo de la ventana.

Representative Results

Una vez que el protocolo quirúrgico se lleva a cabo (Figura 1), los animales pueden ser observados por medio de microscopía fluorescente sobre semanas hasta el sacrificio. Una reacción inflamatoria puede ser observada después de la cirugía que desaparece en una o dos semanas. El crecimiento del tumor se puede observar por diversas técnicas de microscopía incluyendo macroscopía fluorescente y microscopía de dos fotones (Figura 2). Imágenes de ejemplo representadas aquí se realizaron en un macroscopio fluorescencia y un microscopio de dos fotones acoplada a un láser infrarrojo de impulsos de femtosegundos sintonizables y modificada en el hogar para permitir la colocación de animales por debajo del objetivo de inmersión en agua 20X (1.0NA).

El desarrollo del tumor se estimó en el tiempo utilizando un macroscopio fluorescencia combinando iluminación oblicua para campo claro de imágenes de reflectancia y la emisión de epifluorescencia (Figuras 2A-2C). Umbral de la fluorescencia fácilmente da acceso a la zona del tumor, mientras superfvasculatura icial separar estructuras oscuras del fondo blanco de la imagen de luz visible. Por otro lado intravital microscopía de dos fotones permite z-seccionamiento y reconstrucciones ortogonales de grandes campos de visión con resolución subcelular (ver dendritas en la Figura 2D). El uso de animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en las células de interés (por ejemplo, los ratones Thy1-PPC que expresan la proteína fluorescente cian en las neuronas, pseudo-verde en la figura 2D) es posible observar la progresión del tumor en su neuronal microambiente. Sin embargo, debe señalarse que la densidad de las células tumorales puede limitar la profundidad de penetración de fotones, así como la detección de fotones emitida debido al aumento de la difusión. Esto es claramente visible en la Figura 2D como la resolución espacial comienza a disminuir a 200 micras por debajo de la duramadre de materia en el tumor pero no en el parénquima cerebral sano. Por otra parte, la señal de generación de segundo armónico que surja lado a otrom organizó patrones de moléculas no centrosymetric como tipo I y colágeno III figura una firma de la duramadre (cian pseudo-color en la Figura 2D y flechas). Debe tenerse en cuenta que con nuestro protocolo quirúrgico, el tumor crece por debajo de la duramadre en el parénquima cerebral donde su desarrollo se rige por las limitaciones físicas del cerebro. El sellado de la duramadre con un gel de hemi-Bead dextrano reticulado impide el escape de células de glioma en el espacio epidural.

Cuando se sigue por intravital microscopía de dos fotones de la progresión del tumor entre los diferentes puntos de tiempo se puede comparar con una resolución celular. Imagine la misma área en D16 y D27 después de la cirugía (Figura 3A) encontramos algunos vasos sanguíneos como el que se señala con flechas que eran estables durante un período de 11 días; Por otro lado la parte delantera del tumor claramente infiltró en el parénquima sano durante el mismo período. Para evaluar la progresión del tumor, su margin observado a D27 se esbozó con una línea de puntos de color amarillo y superpuesta a la imagen tomada en la D16. Se observó un cambio de 520 m del borde frontal consistente con el perfil proliferativa informado del modelo de glioma GL261 ^15. Los patrones de la red vascular dentro del tumor eran muy diferentes en D16 y D27 indica que la remodelación vascular significativa se produce en áreas patológicas (Figura 3A). En los márgenes del tumor, también encontramos casos de células de glioma de desprendimiento del núcleo del tumor como se espera de un tumor invasivo. La resolución microscópica de nuestras imágenes mostró no sólo que estas células emiten protrusiones citoplasmáticas para detectar el medio ambiente, sino también que pueden usar los vasos sanguíneos como una matriz para su progresión (puntas de flecha y z-reconstrucción en la Figura 3B). Por tanto, la microscopía de dos fotones permite estudiar las interacciones celulares en un contexto verdaderamente fisiológico. El uso de animales transgénicos que cada población celular de interés seidentificado por su propio indicador fluorescente se hace posible buscar la existencia de interacciones físicas entre las células tumorales y su entorno como reguladores clave de la progresión de la enfermedad (Figura 3B, derecha).

Figura 1. Descripción general de la cirugía. La craneotomía se realiza en el hueso parietal izquierda (A). Los límites del hueso parietal izquierdo se indican con una línea de puntos y la parte retirada se llena de amarillo (B). Una vez que la craneotomía lleva a cabo, la corteza parietal está expuesto (C), se selecciona el área para la inyección del esferoide teniendo cuidado de evitar principales vasos sanguíneos (flecha en D) y una aguja de calibre 26 se utiliza para abrir la duramadre ( flecha en E). El esferoide esinyecta y el agujero en la duramadre está obstruido por un gel de dextrano hemi-Bead reticulado sellado con pegamento de cianoacrilato (flecha en C). Un cubreobjetos de vidrio se pega al hueso mientras se mantiene el contacto con el cerebro. El cubreobjetos se consolidó aún más con el cráneo expuesto para asegurar el apego sólido a largo plazo de la ventana del cráneo para las observaciones crónicas (GI). Todo el protocolo se esquematiza brevemente en J. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. El crecimiento del tumor se limita a la parénquima cerebral y se puede controlar a través del tiempo. CA. El crecimiento del tumor (línea celular expresando GL261 DsRed2) es observado por macroscopy en el día de la cirugía (DO, A) y al día 21 (B) y 27 (C). La punta de flecha en C, se destacan una gota de cemento dental que no se retira durante el paso 2.3.5. D. Reconstrucciones ortogonales obtenidos a partir de un campo de 3 x 3 adquirida de 0 a 300 micras por debajo de la duramadre en un ratón Thy1-PPC teniendo un tumor GL261 por microscopía de dos fotones a D20 después de la cirugía. Tumor (rojo), duramadre observado por la generación de segundo armónico (flechas, cyan) y neuronas (verde). Tenga en cuenta que el tumor crece por debajo de la duramadre en el parénquima cerebral. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Varemodelación y células tumorales invasión scular se puede monitorizar en el tiempo con una resolución espacial celular por intravital microscopía de dos fotones. Una. Tumoral GL261 (rojo) observado a D16 y D27 después de la cirugía después de una inyección intravenosa de dextrano azul Cascade-70 kDa a resaltar los vasos sanguíneos. Curva de puntos: margen del tumor en D27; flechas: Ejemplo de vasos sanguíneos que se pueden utilizar como puntos de referencia para localizar la misma área en D16 y D27 B.. Las células tumorales individuales (rojo) invaden el parénquima cerebral sano (neuronas; verde) usando los vasos sanguíneos como una matriz para la invasión (puntas de flecha). Las imágenes fueron tomadas en profundidad que va desde 100 hasta 150 m por debajo de la duramadre-materia. Curva de puntos:. Región donde se realizó la reconstrucción ortogonal representa en el panel inferior central Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Discussion

Este enfoque permite el uso de métodos de formación de imágenes ópticas para supervisar más de días y semanas el crecimiento de un glioma de ortotópicamente implantado. El mismo animal, posteriormente, puede ser sometido a prácticamente cualquier modalidad de formación de imágenes del cerebro durante el curso de la patología; sin embargo, la preparación específica microscopía de dos fotones ofrece la oportunidad única de conseguir una resolución subcelular dentro del cerebro del animal vivo. Nuestro protocolo presenta la ventaja de hacer cumplir el crecimiento del tumor en el parénquima cerebral en lugar de extra-durally como es el caso si las células de glioma pueden dejar el sistema nervioso central a través de la duramadre dañada. En ausencia de limitaciones físicas ejercidas por el medio ambiente cerebro, tumor de células de hecho puede proliferar más rápido, ya que no es necesario infiltrar el parénquima ^16. Métodos previamente publicados no intentaron sellar la duramadre después del injerto, que era más problemático de lo que inyectó la suspensión de células en lugar de esferoides^9,13,14. Las suspensiones de células son de hecho imposible de aplicar de manera focal como células individuales se sembraron de forma sistemática a lo largo de las vías de inyección al retirar la pipeta de la profundidad a la duramadre.

El protocolo actual se puede aplicar en varias cepas de ratón transgénico incluyendo y animales inmunosuprimidos. Varias líneas celulares de glioma pueden ser injertados y se visualizaron, incluyendo las células directamente derivados de biopsias humanas, siempre que se transfectan para expresar de forma estable un reportero de injerto antes fluorescente. Protocolo quirúrgico puede realizarse normalmente en 1 hr y las cohortes de animales rápidamente se puede obtener. Este enfoque de este modo se puede utilizar para estudiar la remodelación vascular, los efectos de los tratamientos farmacológicos sobre la angiogénesis y el crecimiento tumoral, así como el reclutamiento de células inmunes en el tumor. Cuando sea necesario la migración de células de glioma y de las interacciones dinámicas entre células de glioma y el microambiente se pueden observar en tiempo real para varios Hours.

Como la imagen se puede hacer más de profundidades de 500 m, es posible cubrir la mayor parte del volumen del tumor inicialmente implantado 200 m por debajo de la duramadre. Para garantizar la máxima profundidad de imagen especial cuidado se debe tomar durante la cirugía para crear un contacto físico entre la duramadre y el cubreobjetos de vidrio. Esto reduce de hecho la formación de tejido de cicatriz que de otro modo comprometer la claridad óptica. Esterilidad absoluta del ambiente quirúrgico también se debe observar para limitar la inflamación después de la cirugía que desdibuja transitoriamente la ventana. De todos modos, recomendamos esperar 15 días entre la cirugía y la primera sesión de observación para obtener condiciones óptimas de imagen. A partir de entonces, la ventana se encontró que quedar claro hasta un año después de la cirugía en operación simulada animales que se sometieron a todo el protocolo, salvo la inyección del esferoide tumor.

En conclusión, el protocolo descrito aquí representa una mejora de Orth existenteotopic modelo de glioma ratón dedica a intravital microscopía de dos fotones crónica. La inyección superficial de un esferoide de tumor, la obstrucción de la inyección de la pista con un gel de dextrano hemi-Bead reticulado y el sellado de la duramadre hacer cumplir el desarrollo de tumores en el entorno de cerebro que recapitula verdaderamente las limitaciones físicas que rigen normalmente progresión de la enfermedad. No sólo este método servirá estudios fundamentales sobre la fisiopatología glioma sino que también mejorará la relevancia de los resultados farmacológicos durante los ensayos preclínicos.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Los autores agradecen calurosamente al Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber y A. Jaouen útil para los debates; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, el personal del Bioterio del IBDML y el personal de la plataforma de imágenes PicSIL en IBDML para soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) para FD, por becas de la Federación de la Recherche Médicale y Cancéropole PACA a CR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

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