En Orthotopic Glioblastoma musmodell Underhålla hjärnan parenkymal fysiska begränsningar och Passar Intravital Två-foton mikroskopi

Summary

Vi har etablerat en kortikal orthotopic glioblastom modell hos möss för intravital två foton mikroskopi som rekapitulerar de biofysiska begränsningar normalt på spel under tillväxten av tumören. En kronisk glasfönster ersätter skallen ovanför tumören möjliggör uppföljning av tumörprogression över tiden genom att två-foton-mikroskopi.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) är den mest aggressiva formen av hjärntumörer utan botande behandlingar som är tillgängliga hittills.

Murina modeller av denna patologi förlita sig på injektion av en suspension av gliomaceller i hjärnparenkymet följande snitt av dura-mater. De celler måste injiceras ytligt att vara tillgänglig för intravital två foton mikroskopi, ytliga injektioner misslyckas med att rekapitulera de fysiopatologiska förhållanden. Faktum är att fly genom injektionskanalen flesta tumörceller når den extra-dural utrymme där de expanderar onormalt snabbt i avsaknad av mekaniska begränsningar från parenkymet.

Våra förbättringar består inte bara i fokalt implantera en gliom sfäroid snarare än att injicera en suspension av gliomaceller i de ytliga lagren av hjärnbarken, utan även i tilltäppning injektionsstället genom att en tvärbunden dextrangel hemi-vulst som är limmad till den omgiding parenkymet och tätas till dura-mater med cyanoakrylat. Sammantaget dessa åtgärder genomdriva den fysiologiska expansion och infiltration av tumörcellerna inuti hjärnparenkymet. Kraniotomi slutligen avslutades med ett glasfönster cementerad på skallen för att tillåta kronisk avbildning över veckor i frånvaro av ärrvävnad utveckling.

Med utnyttjande av fluorescerande transgena djur ympade med fluorescerande tumörceller vi har visat att dynamiken i samspelet som uppstår mellan gliomceller, neuroner (t.ex. Thy1-GFP möss) och kärl (markeras av en intravenös injektion av en fluorescerande färg) kan visualiseras genom intravital två-foton-mikroskopi under utvecklingen av sjukdomen.

Möjligheten att avbilda en tumör på mikroskopisk upplösning i ett minimalt nedsatt cerebral miljö är en förbättring av nuvarande GBM djurmodeller som bör gynna området neuro-onkologi och drogtester.

Introduction

Glioblastoma multiforme visas som den mest aggressiva formen av hjärntumör hos vuxna med en medianöverlevnad på 12 månader och en 5-års överlevnad på 5%. Klinisk ledning bygger på kirurgi, strålbehandling och kemoterapi ofta i kombination. Men effekterna av dessa behandlingar förblir palliativ ^1-3.

Hittills har de flesta av neuro-onkologi studier förlitar sig på tekniker som bara kan ge en statisk syn och utförs på stora grupper av tumörbärande djur avlivades vid olika tidpunkter (se t.ex. ^4,5). Den senaste utvecklingen av uppföljning metoder baserade på intravital imaging tillåter studera gliom tillväxt och samspelet mellan tumörceller och deras patofysiologiska mikromiljö på samma djur över tiden. Detta öppnar vägen till exklusivt bit information som var så långt ouppnåeligt ^6. Transgena djur som uttrycker fluorescerande taggar i celler av intresse kan vara användningd för att studera specifika interaktioner mellan tumörceller och t.ex. nervceller i detta dokument.

Under det senaste årtiondet har intravital två foton mikroskopi ⁷ blivit en guldmyntfot i grundläggande neuro-onkologi studier och prekliniska studier ^8,9 för sin förmåga att utföra djupa intravital observation av musen hjärnan (> 500 ^ under dura-mater) med mikrometer rumslig upplösning ^10. Med hjälp av intravital två foton mikroskopi med orthotopical djurmodeller implanterade med en kronisk kraniell fönster ^11, är det möjligt att följa tumörprogression över tid på samma mus ^9,12.

En av de stora nackdelarna med dessa tidigare publicerade djurmodeller är emellertid att de inte efterlikna de fysiska begränsningar som reglerar tumörtillväxt som dura-mater inte förslutits efter injektion av cellsuspensionen ^9,13,14. Gliomceller kan läcka iextradural utrymme omvandla en orthotopic gliom modell i en heterotopisk ett.

Modellen djur presenteras här består i insprutning av en sfäroid av fluorescerande gliomceller i hjärnbarken på ett djup av 200 | im, följt av förslutning av dura-mater med en tvärbunden dextrangel hemi-pärla och histo-kompatibelt lim . Tumörtillväxten är då begränsat till hjärnparenkymet som bibehåller patofysiologiska fysiska begränsningar. En kronisk glasfönster implanteras ovanför tumören gör en enkel optisk access för intravital två foton mikroskopi. Med hjälp av transgena djur som uttrycker fluorescerande taggar i celler av intresse är det möjligt att utföra en uppföljning av gliom tillväxt över tiden och att studera dess interaktion med sin mikromiljö (här med nervceller och kärl markerade med fluorescerande dextraner).

Protocol

Alla experimentella procedurer har utförts i enlighet med fransk lagstiftning och i enlighet med Europeiska gemenskapen Rådets direktiv av den 24 november 1986 (86/609/EEG) för vård och användning av försöksdjur. Forskningen på djur godkändes av Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licens D-13-055-21) och godkänd av etisk kommitté av Provence Cote d'Azur n ° 14 (Project 87 till 04.122.012) .

1. Spheroids Förberedelse

1. Framställning av agarosen dragePetriSkålar
   1. Blanda 1 g agaros med 100 ml av cellodlingsmedium inte kompletterat med fetalt bovint serum. Använd en mikrovågsugn (850 watt för 40 sek, sedan 3 x 15 sek, rör om lösningen i mellan varje mikrovågsugn session) för att koka lösningen och att helt upplösa agaros. Autoklavera detta 1% agaros-lösning under 20 min vid 120 ° C för att försäkra steri. het OBS: Se till att helt lösa upp agaros innan autoklav-protokollet. Inhomogenitet kan äventyra bildandet av sfäroider.
   2. När hämtas från autoklaven, häll 10 ml av agaroslösningen 1% i 100 x 20 mm petriskålar. Låt Petri-skålar 20 minuter vid rumstemperatur för att tillåta agaroslösningen 1% stelna.
   3. Tillsätt 10 ml PBS över agaros för att bibehålla fuktighet. Täta locket på agaros-belagda petriskålar genom att linda dem med parafilm för att undvika avdunstning. Petriskålar kan lagras i upp till 2 månader vid 4 ° C om ordentligt fuktas av PBS lagret.
2. Sfäroid kultur
   1. I en 75 cm ^2-kolv, kultur de gliomceller i deras rekommenderade mediet som ett monoskikt.
   2. Byt ut PBS från en av de 1% agaros-belagda petriskål med 1,5 ml av "konditioneras medium" som samlats in från kolven som innehåller 2D-monolager av gliom celler.
   3. Ta ut mediet från kolven som innehåller 2D-monolager av gliomceller.
   4. Skölj försiktigt monolager med 10 ml PBS.
   5. Tillsätt 2 ml av 0,05% av en trypsin / EDTA-lösning och inkubera kolven 4 min vid 37 ° C. Anmärkning: Inkubationstiden kan variera beroende på vilken cellinje som användes.
   6. Lägg till 8 ml odlingsmedium för att stoppa effekten av trypsin, spola cellsuspensionen försiktigt Anm. Se till att inte spola luft i cellsuspensionen eftersom det ökar celldöd.
   7. Sätt 6 ml av cellsuspensionen i ett sterilt rör.
   8. Centrifugera röret 4 min vid 800 rpm.
   9. Avlägsna supernatanten och försiktigt suspendera cell sediment i 3 ml odlingsmedium.
   10. Seed cellsuspensionen i det beredda agaros-belagda petriskål.
   11. Placera petriskål vid 37 ° C i en 5% _CO2 atmosfär under 2-3 dagar tills sfäroider av önskad diameter bildas.
2. Sfär och Fönster implantation
1. Framställning av injektionssystemet
   1. Ren glaskapillärer (1 mm i diameter) genom sonikering i 70% etanol under 10 min. Skölj två gånger med vatten före placering inuti en inkubator tills torr.
   2. Dra flera rengjorda glas kapillärer med en pipett avdragare för att förbereda ett litet lager.
   3. Bryt spetsen dras kapillär genom att skrapa den ände på en bit av tissuepapper för erhållande av en avfasad ände av önskad storlek: typiskt en yttre diameter av 300 till 350 ^ m och en inre diameter av 250 till 300 | im. Under denna formningsprocess, styra diametern hos kapillären med användning av en makroskop vars okular är försett med en graderad mira.
   4. Anslut den icke avfasade änden av kapillären till ett 3-vägs grenrör med hjälp av en bit av ett plaströr, vars innerdiameter passar den yttre diametern hos kapillären.
   5. Att använda plast Tubing, koppla ihop de två andra sätt att fördelaren till en 25 pl mikroliter spruta och till en 1 ml spruta laddad med histo-kompatibla mineralolja.
   6. Justera fördelarväljaren för att upprätta en väg mellan mikroliter spruta och 1 ml spruta. Ta bort kolven i mikroliter spruta och injicera mineralolja bakåt in i mikroliterspruta tills den läcker ut genom att trycka in kolven i 1 ml spruta. Byt kolv av mikroliter sprutan samtidigt noga med att inte lämna luftbubblor i slangen.
   7. Justera fördelarväljaren för att upprätta en väg mellan kapillär och 1 ml sprutan. Fyll kapillär med mineralolja tills det läcker ut från spetsen samtidigt noga med att inte lämna luftbubblor i slangen.
   8. Justera grenrörsväljaren för att upprätta en anslutning mellan mikroliterspruta och kapillären. Häll ca 10 ^ il mineralolja.
   9. Doppa den kapillära spetsen i PBS-lösningoch med hjälp av mätare på mikroliter spruta, suga i 5 pl PBS i kapillär. Observera att menisken mellan olja och PBS syns tydligt.
   10. Fäst kapillär på en 3 axel mikromanipulator montering under operationen makroskop. Detta system kommer att användas för att målsöka kapillären på injektionsstället under visuell kontroll.
2. Sfäroid implantation
   1. Lätt söva musen genom inandning av isofluran i en induktion kammare (1,5% i luft under 1-1,5 min).
   2. Bedöva djur med en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin / xylazin (120 mg / kg, 12 mg / kg). Observera att anestesi minskar ofta kroppstemperaturen hos djuret. Det rekommenderas att fortsätta med kirurgi i ett rum vid 26 ° C och att hålla djuret varmt med en underliggande thermocontrolled värmedyna.
   3. Applicera ögonsalva för att undvika uttorkning av ögonen.
   4. Raka hårbotten av djuret.
   5. Platsdjuret i en stereotaktisk ram med hjälp av örat barer och ett munstycke.
   6. Rengör huden med povidonjod (3% tvål, sedan 10% lösning).
   7. Gör ett 1 cm långt snitt i längdriktningen i mitten av hårbotten med en skalpell. Använda sax klippa och ta bort huden ovanför parietalben.
   8. Med en skalpell blad försiktigt bort benhinnan ovanför skallen. Applicera rikligt cyanoakrylat på toppen av benet för att alstra en grov yta för senare cementvidhäftning.
   9. Borra den parietal ben under ett kirurgiskt makroskop för att generera en kraniotomi av 4 mm diameter. Väl tillfoga iskall PBS innehållande penicillin (1000 U / ml) och Streptomicin (1 mg / ml) under hela förfarandet för att förhindra upphettning. Ta bort de små benfragment med pincett och en våt steril gasbinda. Var noga med att borra minst 1 mm bort från parietal skallen suturer för att undvika blödningar.
   10. Tunna benet vid gränsen av kraniotomi där glasfönster ska tätas. Syftet är att eNsure senare plana placeringen av fönster med maximal kontaktyta mellan hjärnan och glaset. Sakta ut benet med hjälp av en tång och rengör den exponerade dura-mater med PBS-lösning.
   11. Ta en 5 mm diameter rund täckglas, rengör den med alkohol och torka med läskpapper. Försök att använda täckglas som ett lock för kraniotomi och bekräfta att en stor platt yta i hjärnan kommer i kontakt med glaset. Vid behov tar bort täckglas för att ytterligare tunna sido ben. Fortsätt tills hjärnan kan få pressas platt om försiktigt sätta press på täck gång på plats.
   12. Rengör igen täckglas med alkohol, torka den med silkespapper, och spara den isär.
   13. Med en 26 gauge nål göra ett hål i dura-mater i centrum av kraniotomi ändå undvika huvudsakliga blodkärl. Se till att inte skada hjärnparenkymet eftersom syftet med detta steg är bara att öppna dura-mater.
   14. Rengör försiktigt dura-mater with PBS-lösning för avlägsnande av hemorragiskt blod. Täck med en bit silkespapper samtidigt förbereda sfäroiden injektionen.
   15. Med sfäroiddiametern insprutningssystemet förberett i steg 2.1, suga en rund sfäroid montera kapillär innerdiameter (ca 200-250 nm) från petriskål förberedd i steg 1.2. Sfäroid bör komma med ungefär 5 l odlingsmedium. Det bör falla ner till spetsen av den kapillaritet under dess vikt.
   16. Ta bort den våta tissuepapper som används för att täcka kraniotomi och placera djuret i insprutningssystemet.
   17. Sänk insprutnings pipetten tills den vidrör hål i dura-mater. Därefter, sänk den igen genom 250 pm. Vänta 30 sek.
   18. Spruta långsamt sfäroid med hjälp av kolven i mikroliter spruta (2-3 l) medan pumpa ut överflödig vätska med ett tunt silkespapper. Vänta 30 sekunder och sedan försiktigt lyfta injektions pipett med 50 nm mot ytan. Vänta igen 30 sek och repeat lyftförfarandet i steg om 50 | im till dess yta. Väntetider undviker extraktion av sfäroid som skulle hålla sig till pipetten.
   19. Bekräfta närvaron av den sfäroid i hjärnan med användning av en fluorescensmakroskop.
   20. Blanda 100 till 300 ^ m diameter tvärbunden dextran gelpärlor med PBS-lösning i en petriskål. Vänta 1 min och fiska några hydratiserade pärlor. Placera dem på benet intill kraniotomi.
   21. Enligt makroskopisk kontroll väljer en pärla med en diameter som liknar storleken av dura-mater öppning. Skär tvärbunden dextrangel pärla i två halvor med hjälp av pincett.
   22. Lägg varsamt en tvärbunden dextrangel hemi-vulsten in i insprutningshålet med den konvexa sidan mot sfäroid. Se till att inte ta bort sfäroid och tryck försiktigt nedåt tills gränsen till den konkava komma i kontakt med den omgivande dura-mater.
   23. Sätt en droppe cyanoakrylat lim på en glasplatta; doppa spetsen av en tandpetare i drop att ta en liten mängd lim. Snabbt försegla kanterna av tvärbunden dextrangel hemi-vulsten till den angränsande dura-mater genom stans lim runt. Var noga med att utföra snabba och exakta rörelser i syfte att undvika limning av tvärbunden dextran gel hemi-kula till tandpetare. Undvik överskott av lim som kan sprida sig och hindra om inte förhindra avbildning gång torkat. Vänta 2 minuter för limmet att torka och rengöra kraniotomi och det omgivande benet med PBS-lösning då.
3. Fönster implantation
   1. Sätt 5 mm diameter rund täckglas över kraniotomi (se 2.2.12). Kanterna på täckglas måste vara på den uttunnade skallen på utsidan av kraniotomi. Den täckglas måste vara i kontakt med den dura-mater och förtunnas ben på kanterna. Det är mycket viktigt att ha en direkt kontakt mellan dura-mater och glastäck annars ärrvävnad kan utvecklas och hindra optisk klarhet.
   2. Med en vävnad, absorbera PBS på the täck kanterna så att lösningen inte helt täcker kraniotomi vid tillämpning av ett litet tryck i mitten av täckglas. Detta kommer att säkerställa att ben, glas och hjärna är hoplimmade på den sida av området av intresse.
   3. Upprätthålla ett litet tryck i mitten av täckglas med en pincett, medan du försiktigt cyanoakrylat vid gränsen mellan benet och täckglas. Limmet kommer spontant spridas till gränssnittet med PBS-lösning. Lösning kommer att fungera som ett hinder med tanke på hydrofobicitet limmet. Tätning ska vara effektiv på mindre än en minut, men ta ett extremt noga med att inte flytta täckglas tills den är fast. Detta skulle annars leda till cyanoakrylat läckage på dura-mater därmed leda till ett misslyckande av operationen.
   4. I fall skulle lim har spridit ovanpå glaset, ta bort den med hjälp av en mikro-skalpell blad genom att göra spiralrörelser eftersom det annars kan minska optisk klarhet. Se upp att inte bryta glaset täckglas During förfarandet på grund av högt tryck.
   5. Konsolidera glas fixering genom att tillämpa dentala cement på kanterna på täckglas mot den intilliggande skallen. Se till att täcka hela exponerade skallen tills hårbotten. Med hjälp av extra cement, bygga upp sidoväggar runt täckglaset för att skapa poolen krävs för nedsänkning av målet. Den dentala cement kommer att härda på mindre än 10 min.

3. Postoperativ vård och förberedelse för Imaging

1. Postoperativ vård
   1. Ta bort musen från den stereotaktiska ramen, injicera Dexamethazon (0,2 mg / kg) och Rimadyl (5 mg / kg) fm över bäckenregionen och lägga henne i en bur med en varm vävnads boet.
   2. Övervaka djuret tills effekterna av anestesi har försvunnit. I allmänhet är 2 till 3 timmar efter kirurgi, möss är fullt rörlig. Se till att djuret har en enkel tillgång till mat och vatten. Ge djuret med agaros innehållande glukos (agaros3%, glukos 3%).
   3. Övervaka djurets vikt varje dag och injicera Dexamethazon (0,2 mg / kg) och Rimadyl (5 mg / kg) sc för första 10d efter det kirurgiska ingreppet. Av etiska skäl, avliva möss när skadan överstiger 15% av sin ursprungliga vikt. Intrakraniella trycket ökar med tumörstorlek leder till motoriska försämringar för djuret. Detta är tumörcellinje beroende och inträffar vid olika fördröjningar efter operation. Särskild försiktighet bör iakttas för att karakterisera slutpunkten av experimentet med den cellinje som används.
2. Förberedelse för avbildning
   1. Lätt söva musen genom inandning av isofluran i en induktion kammare (1,5% i luft under 1-1,5 min).
   2. Bedöva djur med en intraperitoneal injektion av en blandning av ketamin / xylazin (100 mg / kg, 10 mg / kg). En sådan anestesi tillåter vanligtvis 45 min för observation. För att utföra längre avbildning sessioner, är musen placeras under kontinuerlig inandning av isofluran iluft (0,25-0,75%).
   3. Applicera ögonsalva för att undvika uttorkning av ögonen.
   4. Placera djuret på en stereotaktisk ram och blockera skallen med earbars.
   5. För att visualisera blodkärl, kan ett fluorescerande färgämne injiceras intravenöst.
   6. Om fönstret visas smutsig, kan den rengöras genom att försiktigt avlägsna skräp med ett tunt blad, och i hörnet av en vävnad. Använd inte alkohol för att rengöra fönstret som det inte alltid är kompatibla med tandcement och det kan kyla hjärnan under fönstret.

Representative Results

När den kirurgiska protokollet utförs (fig. 1), kan djuren observeras medelst fluorescensmikroskopi under veckor till dess offer. En inflammatorisk reaktion kan observeras efter operationen som försvinner inom en eller två veckor. Tumörtillväxt kan observeras genom olika mikroskopitekniker inklusive fluorescerande makroskopi och två-photon mikroskopi (Figur 2). Exempel bilder som avbildas här realiserades på en fluorescens makroskop och en två-photon mikroskop kopplat till en femtosecond pulsad infraröd avstämbara laser och hem-ändras så att djur positionering under 20x nedsänkning i vatten mål (1.0 nA).

Den tumörutveckling uppskattades över tid med hjälp av en fluorescensmakroskop kombinerar sned belysning för ljusa fält reflektans avbildning och epifluorescence utsläpp (figur 2A-2C). Tröskelvärden för fluorescens ger lätt tillgång till tumörområdet samtidigt superficial kärl loss som mörka strukturer av den vita bakgrunden av det synliga ljusbild. Å andra sidan intravital två foton mikroskopi ger z-sektionering och ortogonala rekonstruktioner av stora synfält med subcellulär upplösning (se dendriter i figur 2D). Med användning av transgena djur som uttrycker fluorescerande proteiner i celler av intresse (t.ex. Thy1-GFP möss som uttrycker cyan fluorescerande protein i neuroner, grönt pseudo-färg i figur 2D) är det möjligt att observera tumörprogression hos dess neuronal mikromiljö. Dock måste det noteras att tumörcelltäthet kan begränsa fotonpenetrationsdjup och den emitterade fotonen upptäckt på grund av ökad diffusion. Detta syns tydligt i figur 2D som den rumsliga upplösningen börjar minska vid 200 nm under dura-materia i tumören men inte i den friska hjärnparenkymet. Dessutom, den andra övertonen generationens signal uppstår tillbakam organiserade mönster av icke-centrosymetric molekyler såsom typ I och III kollagen ger en underskrift av dura-mater (cyan pseudo-färg i figur 2D och pilar). Det bör noteras att med vår kirurgiska protokoll, växer tumören under dura-mater i hjärnparenkymet där dess utveckling styrs av de fysiska begränsningarna i hjärnan. Tätningen av dura-mater med en tvärbunden dextrangel hemi-vulsten förhindrar utströmning av gliomaceller i extradural utrymme.

När följt av intravital två foton mikroskopi tumörprogression mellan olika tidpunkter kan jämföras på cellulär upplösning. Imaging samma område på D16 och D27 efter operationen (Figur 3A) vi hittade några blodkärl som den som markeras med pilar som var stabil under en period på 11 dagar; å andra sidan tumör främre tydligt infiltreras i den friska parenkymet under samma period. För att utvärdera tumörprogression, dess margin observeras vid D27 drogs upp med en gul streckad linje och överlagras på bilden tagen på D16. En 520 | im förskjutning av den främre kanten observerades i överensstämmelse med de rapporterade proliferativ profil GL261 gliom modell ^15. Mönstren av kärlnätet inne i tumören var mycket annorlunda på D16 och D27 som indikerar att betydande kärlremodellering sker i patologiska områden (Figur 3A). Vid tumörmarginaler, fann vi även fall av gliom celler lossnar från tumörens kärna som förväntat från en invasiv tumör. Den mikroskopiska upplösning på våra bilder visade inte bara att dessa celler avger cytoplasmiska utsprång för att känna av miljön, men också att de kan använda blodkärl som en matris för deras progression (pilspetsar och z-rekonstruktion i figur 3B). Två-foton mikroskopi tillåter alltså att studera cellulära interaktioner i en verkligt fysiologisk sammanhang. Med hjälp av transgena djur, där varje cell population av intresse äridentifieras med hjälp av sin egen fluorescerande reporter blir det möjligt att söka efter förekomsten av fysikaliska växelverkningar mellan tumörceller och deras omgivning som viktiga regulatorer av sjukdomsprogression (Figur 3B, höger).

Figur 1. Översikt av kirurgi. Kraniotomi utförs på den vänstra parietala benet (A). Gränserna för den vänstra parietala benet är märkta med en prickad linje, och den avlägsnade delen är fylld i gult (B). När kraniotomi utförs, är det parietal cortex exponerade (C), är området för injektionen av sfäroid väljas med omsorg för att undvika stora blodkärl (pilen i D) och en 26 gauge nål används för att öppna dura-mater ( arrow in E). Den sfäroid ärinjicerade och hålet i dura-mater är tilltäppt av en tvärbunden dextrangel hemi-bead förseglad med cyanoakrylatlim (pilen i F). Ett täckglas är limmad till benet och samtidigt hålla kontakt med hjärnan. Den täckglas är vidare hård till den exponerade skallen för att säkerställa långtids fast infästning av kraniell fönster för kroniska observationer (GI). Hela protokollet kort schematiseras i J. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Tumörtillväxt är begränsad till hjärnparenkymet och kan övervakas över tiden. AC. Tumörtillväxt (GL261 cellinje som uttrycker DsRed2) observeras av macroscopy på operationsdagen (DO, A) och vid dag 21 (B) och 27 (C). Den pilspets i C belyser en droppe av dentalcement som inte togs bort under steg 2.3.5. D. Ortogonala rekonstruktioner erhållna från en 3 x 3 fältet förvärvas 0-300 pm under dura-mater i en Thy1-GFP mus som bär en GL261 tumör genom två-foton-mikroskopi vid D20 efter operationen. Tumör (röd), dura-mater observerats av andra harmoniska generationen (pilar, cyan) och neuroner (grön). Observera att tumören växer under dura-mater i hjärnparenkymet. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Vascular ombyggnad och tumörceller invasion kan följas över tid med cell rumsliga upplösningen av intravital två foton mikroskopi. A. GL261 tumör (röd) observerades vid D16 och D27 efter operation efter en intravenös injektion av Cascade-blått dextran 70 kDa för att markera blodkärl. Prickad linje: tumörmarginalen på D27; pilar: Exempel på blodkärl som kan användas som landmärken för att lokalisera samma område på D16 och D27 B.. Individuella tumörceller (röd) invadera frisk hjärnparenkymet (neuroner, grön) med hjälp av blodkärl som en matris för invasion (pilspetsar). Bilder togs vid djup mellan 100 och 150 | im under dura-materia. Prickade linjen:. Region där den ortogonala rekonstruktion avbildas i den nedre mittpanelen realiserades Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att använda optiska avbildningsmetoder för att övervaka över dagar och veckor framväxten av en orthotopically implanterad gliom. Samma djur kan därefter utsättas för i stort sett alla hjärn avbildningsmodalitet under loppet av patologin; men de två-photon mikroskopi specifik förberedelse erbjuder en unik möjlighet att åstadkomma subcellulär upplösning inne i hjärnan hos levande djur. Vår protokoll har den fördelen att upprätthålla tumörtillväxt i den cerebrala parenkymet snarare än extra-durally som det händer om gliomceller kan lämna det centrala nervsystemet genom den skadade dura. I avsaknad av fysiska begränsningar som utövas av hjärnan miljön, kan tumörcellen verkligen föröka sig snabbare eftersom de inte behöver för att infiltrera parenkymet ^16. Tidigare publicerade metoder försökte inte försegla dura mater efter ympning som var desto mer problematisk än de injicerade suspension av celler i stället spheroids^9,13,14. Suspensioner av celler är verkligen omöjligt att tillämpa focally som enskilda celler systematiskt seedade längs injektionskanalen när man tar ut pipetten ur djupet till dura-mater.

Den nuvarande protokollet kan appliceras på olika musstammar inklusive transgena och immunsupprimerade djur. Olika gliomacellinjer kan ympas och visualiseras, inklusive celler som direkt härrör från mänskliga biopsier så länge de transfekterade att stabilt uttrycka en fluorescerande reporter före ympning. Kirurgisk protokoll kan normalt utföras i 1 timme och grupper av djur kan snabbt erhållas. Kan således användas för detta tillvägagångssätt för att studera vaskulär remodellering, effekterna av farmakologiska behandlingar på angiogenes och tumörtillväxt, samt rekrytering av immunceller in i tumören. Vid behov kan observeras gliom cellmigration och dynamiska interaktioner mellan gliomceller och mikromiljön i realtid för flera hours.

Som avbildning kan ske över djup 500 nm är det möjligt att täcka de flesta av tumörvolymen ursprungligen implanterade 200 nm under dura-mater. För att garantera maximal bilddjupet särskild försiktighet måste iakttas under operation för att skapa fysisk kontakt mellan dura-mater och glaset täckglas. Detta minskar i själva verket bildningen av ärrvävnad som annars skulle äventyra optisk klarhet. Bör även observeras Absolut sterilitet hos kirurgiska miljön att begränsa efter operationen inflammation som transient suddar fönstret. Vi rekommenderar ändå att vänta 15 dagar mellan operation och den första observationssession för att få optimala avbildningsförhållanden. Därefter fönster fann förbli klart upp till ett år efter operationen på skenopererade djur som genomgick hela protokollet utom injektion av tumör sfäroiden.

Sammanfattningsvis, det protokoll som beskrivs här är en förbättring av befintlig orthotopic gliom musmodell tillägnad kronisk intravital två foton mikroskopi. Den ytliga injektion av en tumör sfäroid, tilltäppning av injektions spår med en tvärbunden dextrangel hemi-pärla och förseglingen av den dura-mater driva tumörutveckling i hjärnan miljö som verkligen rekapitulerar de fysiska begränsningarna som normalt styr sjukdomsprogression. Inte bara denna metod kommer att tjäna grundläggande studier om gliom patofysiologi, men det kommer också att förbättra relevansen av farmakologiska resultat under prekliniska studier.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna varmt tacka Dr KK Fenrich, Dr MC. Amoureux, P. Weber och A. Jaouen för bra diskussioner; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. BONNARDEL, personalen på djuranläggningen vid IBDML och personalen på PicSIL imaging plattform IBDML för teknisk support. Detta arbete har finansierats med bidrag från Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) till GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) till FD, genom stipendier från Fédération de la Recherche Médicale och Cancéropole PACA till CR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

1. DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
2. Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
3. Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
4. Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
5. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
6. Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
7. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
8. Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
9. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
10. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
12. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
14. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
15. Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
16. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).

Tags

Medicin Glioblastoma multiforme intravital två-photon imaging djurmodell kronisk kraniell fönster hjärntumörer neuro-onkologi.