소성을 Glioblastoma의 마우스 모델은 뇌 실질 물리적 제약 조건을 유지하고의 intravital 두 광자 현미경에 적합

Summary

우리는 종양의 성장하는 동안 재생에 일반적으로 생물 물리학 적 제약 조건을 되풀이되었습니다의 intravital 두 광자 현미경을위한 마우스에서 대뇌 피질의 소성을 glioblastoma의 모델을 설립했다. 종양 위의 두개골을 대체 만성 유리 창에는 두 개의 광자 현미경에 의해 시간이 지남에 따라 종양의 진행을 추적 할 수 있습니다.

Abstract

아교 모세포종의 multiforme (GBM)는 날짜에 사용할 수없는 치료 치료와 뇌 종양의 가장 적극적인 형태입니다.

이 병리의 쥐 모델은 경질 이잖아요의 절개 다음 뇌 실질에 신경 교종 세포 현탁액의 주입에 의존하고 있습니다. 세포의 intravital 두 광자 현미경에 액세스 할 수 피상적으로 주입해야하는 반면, 표면 주사는 physiopathological 조건을 요점을 되풀이하지. 실제로, 주입 관을 통해 탈출하는 대부분의 종양 세포들이 실질로부터의 기계적인 제약 조건의 부재하에 비정상적으로 빠른 확장 여분 경막 공간에 도달한다.

우리 개선 focally 교종 타원체 주입보다는 대뇌 피질의 표면층에서 신경 교종 세포의 현탁액을 주입 에서뿐만 아니라의 surroun에 접착되어 가교 덱스 트란 겔 헤미 - 비드로 주사 부위를 막힘뿐만 이루어져땡 실질 및 시아 노 아크릴 레이트와 경질 이잖아요 밀봉. 합해서 이러한 조치는 뇌 실질 내부 종양 세포의 생리 학적 팽창 및 침윤을 시행. 유리 창은 흉터 조직 발달의 부재시 주 이상의 만성 이미징을 허용하도록 두개골에 시멘트와 개두 최종적으로 닫혔다.

우리가 신경 교종 세포, 신경 세포 (예를 들어 Thy1-CFP 마우스)과 혈관 (형광 염료의 정맥 주사에 의해 강조) 사이에서 발생하는 상호 작용의 역학의 intravital으로 시각화 할 수있는 것으로 나타났습니다 형광 종양 세포를 이식 형광 형질 전환 동물을 활용 질병의 진행 중에이 광자 현미경.

최소한의 손상된 뇌 환경에서 현미경 해상도의 이미지 종양 가능성은 신경 종양학과 약물 검사의 필드를 수혜 현재 GBM 동물 모델의 개선을 나타냅니다.

Introduction

glioblastoma의 multiforme의 12 개월의 평균 생존과 성인의 뇌 종양의 가장 적극적인 형태와 5 %의 5 년 생존율로 나타납니다. 임상 관리는 수술, 방사선 치료 및 자주 조합에 사용되는 화학 요법에 의존합니다. 그러나, 이러한 치료의 효과는 ^1-3 완화 남아있다.

지금까지 신경 종양학 연구의 대부분은 (예를 들어 ^4.5에 대한 참조) 만 정적 뷰를 제공 할 수있는 종양 베어링 동물의 대규모 코호트에서 수행 다른 시간 지점에서 희생 기술에 의존하고 있습니다. 의 intravital 촬상에 근거 후속 방법의 최근 개발은 신경​​ 교종 성장 및 종양 세포 및 시간 이상의 동일한 동물에 미치는 병태 미시 사이의 상호 작용을 연구한다. 이 ⁶ 지금까지 이룰 수 있었다 정보의 독점적 인 조각의 길을 엽니 다. 그 세포에서 형광 물질을 발현하는 형질 전환 동물에 사용 될 수 있습니다이 논문에서 종양 세포 및 예를 들어 신경 세포 사이의 특정한 상호 작용을 연구하는 D.

지난 10 년간의 intravital 두 광자 현미경 ^(7)과 (> 500 DURA-이잖아요 아래 μm의) 기본적인 신경 종양학 연구와 임상 실험 쥐의 뇌의 깊은의 intravital 관찰을 수행 할 수있는 능력에 대한 ^8,9의 황금 표준이되었습니다 마이크로 미터 공간 해상도 ^10. 만성 뇌 창 ^(11)이 주입 orthotopical 동물 모델의 intravital 이광자 현미경을 사용하여, 동일 마우스 ^9,12에서 시간에 따른 종양의 진행을 수행하는 것이 가능하다.

이러한 이전에 발행 된 동물 모델의 주요 단점 중 하나는 경질 교인이 세포 현탁액 ^9,13,14의 주입 후 밀봉되지 않는 종양의 성장을 제어하는 물리적 제약을 모방하지 않는 것이 그러나이다. 신경 교종 세포에서 누출 될이소성 하나에 소성을 신경 교종 모델을 변환 경막 외 공간.

여기에 제시된 동물 모델은 가교 덱스 트란 젤 헤미 - 구슬과 조직을 호환 접착제로 경질-이잖아요의 밀봉 한 다음 200 ㎛의 깊이에서 대뇌 피질에있는 형광 신경 교종 세포의 회전 타원체의 주입으로 구성 . 종양의 성장은 다음의 병태 생리 학적 물리적 제약을 유지하는 뇌 실질 조직으로 제한됩니다. 종양 위에 이식 만성 유리창의 intravital 두 광자 현미경을위한 쉬운 광 액세스 할 수 있습니다. 시간이 지남 신경 교종의 성장의 후속을 수행하고 (형광 덱스 트란을 강조하는 신경과 혈관 구조와 여기)의 미세 환경과의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다 관심의 세포에 형광 물질을 발현하는 형질 전환 동물을 사용하여.

Protocol

모든 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 프랑스의 법률에 따라 11 월 24 일의 유럽 공동체위원회 지침, 1986 (86/609/EEC)을 준수 하였다. 동물에 대한 연구는 방향 Départementale 데 서비스 Vétérinaires 데 부슈 - 뒤 - 론 (라이센스 D-13-055-21)에 의해 승인 프로방스 코트 다 쥐르 N ° 14 (프로젝트 87-04122012)의 윤리위원회의 승인을 받았다 .

1. 상체 준비

1. 아가로 오스 코팅 된 배양 접시의 준비
   1. 소 태아 혈청으로 보충되지 세포 배양액 100 ㎖로 아가로 오스 1g을 혼합한다. 전자 레인지 사용 (40 초 850 와트, 다음 3 × 15 초, 각 전자 세션 사이에서 솔루션을 저어) 솔루션을 끓여 완전히 아가 로스를 해소 할 수 있습니다. steri을 확보하기 위해 120 ° C에서 20 분 동안이 1 % 아가로 오스 솔루션을 압력솥. 품 질 참고 : 완전 오토 클레이브 프로토콜 전에 아가로 오스를 해산주의하십시오. 비균질성은 상체의 형성을 손상시킬 수 있습니다.
   2. 일단 오토 클레이브에서 검색, 100 X 20mm 배양 접시에 1 % 아가로 오스 용액 10 ㎖를 붓는다. 1 % 아가로 오스 용액을 응고시킬 실온에서 페트리 접시에서 20 분을 남긴다.
   3. 습도를 유지하기 위해, 아가 로스 상기 PBS 10 ㎖를 추가. 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로 그들을 포장하여 아가 로스 코팅 된 배양 접시의 뚜껑을 밀봉합니다. 제대로 PBS 층 가습 경우 배양 접시는 4 ° C에서 최대 2 개월 동안 저장 될 수있다.
2. 회전 타원체 문화
   1. 단일 층으로 권장되는 매체에서 75cm ² 플라스크, 문화에서 신경 교종 세포.
   2. 신경 교종 세포의 2 차원 단층을 함유하는 플라스크에서 수집 "프리 컨디셔닝 매체」의 1.5 ml의 기준을 1 % 아가 로스 코팅 페트리 접시 중 하나에서 PBS 바꾸기의.
   3. 신경 교종 세포의 2 차원 단층을 함유하는 플라스크에서 배지를 제거한다.
   4. 부드럽게 PBS 10 mL로 단일 층을 씻어.
   5. 트립신 / EDTA 용액의 0.05 %의 2 ML을 추가하고 37 ° C. 주에서 플라스크 4 분 배양 : 배양 시간은 사용 된 세포주에 따라 달라질 수 있습니다.
   6. 부드럽게 세포 현탁액을 세척, 트립신의 활동을 중지하는 문화 매체의 8 ML을 추가 참고 :.이 세포 죽음을 증가로 세포 현탁액에 공기를 세척하지 않도록주의하십시오.
   7. 멸균 유리 병에 세포 현탁액 6 ㎖를 넣어.
   8. 800 rpm에서 유리 병 4 분 원심 분리기.
   9. 뜨는을 제거하고 부드럽게 배지 3 ㎖의 세포 침전물을 일시 중지합니다.
   10. 제조 된 아가로 코팅 된 배양 접시에 세포 현탁액을 시드.
   11. 원하는 직경의 상체가 형성 될 때까지 환자가 2 ~ 3 일 전부터 시작된 5 % CO ₂ 분위기에서 37 ° C에서 배양 접시를 넣어.
2. 회전 타원체 및 창 주입
1. 분사 시스템의 제조
   1. 10 분 동안 70 % 에탄올로 초음파 처리하여 깨끗한 유리 모세관 (직경 1 ㎜). 건조까지 인큐베이터 안에 물 이전 배치로 2 회 씻어.
   2. 작은 주식을 준비하기 위해 피펫 풀러 여러 세정 된 유리 모세관을 당깁니다.
   3. 일반적으로 300 ~ 350 ㎛, 외부 직경 250 ~ 300 μm의 내부 직경 : 원하는 크기의 경 사진 말단을 얻기 위해 조직 종이에 극한을 긁어서 뽑아 모세관의 끝을 휴식. 이 성형 과정에서 안구 졸업 미라 탑재 macroscope을 이용​​한 모세관의 직경을 제어한다.
   4. 내경의 모세관의 외경 적합하다 플라스틱 배관의 조각을 사용하여 3 웨이 매니 폴드에 모세관의 비 경 말단을 연결한다.
   5. 플라스틱 tubin 사용g는, 매니 폴드의 다른 두 가지 방법을 연결 25 μL 마이크로 리터 주사기 및 조직을 호환 미네랄 오일로드 1 ML의 주사기에.
   6. 마이크로 리터 주사기 1ml의 주사기 사이의 경로를 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​을 조정합니다. 제거 마이크로 리터 주사기의 피스톤과는 1 ㎖ 주사기의 피스톤을 눌러 새어까지 마이크로 리터 주사기로 역방향 미네랄 오일을 주입. 을 돌보는 것은 튜브에 공기 방울을 남기지 않도록하는 동안 마이크로 리터 주사기의 피스톤을 교체합니다.
   7. 모세관은 1 ML의 주사기 사이의 경로를 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​을 조정합니다. 튜브에 공기 방울을 남기지 않도록주의하면서 그것이 끝에서 새어까지 미네랄 오일과 모세관을 입력합니다.
   8. 마이크로 리터 주사기와 모세관 사이의 연결을 설정하기 위해 매니 폴드 선택​​기를 조정한다. 미네랄 오일의 약 10 μl를 추방.
   9. PBS 용액에 모세관 팁을 찍어및 마이크로 리터 주사기의 게이지를 이용하여, 모세관의 PBS의 5μL 빨아. 석유와 PBS의 메 니스 커스가 명확하게 볼 수 있습니다.
   10. 수술 macroscope에서 맞는 3 축 미세 조작기에 모세관을 고정합니다. 이 시스템은 카메라 제어하에 주사 부위에 모세관을 대상으로 사용될 것이다.
2. 회전 타원체 주입
   1. 가볍게 (1-1.5 분 동안 공기 1.5 %) 유도 챔버에 아이소 플루 란을 흡입하여 마우스를 마취.
   2. 케타민 / 자일 라진 (120 ㎎ / kg, 12 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 마취는 종종 동물의 체온을 감소 유의. 그것은 26 ° C에서 방에 수술을 진행하고 기본 thermocontrolled 가열 패드로 동물을 따뜻하게 유지하는 것이 좋습니다.
   3. 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
   4. 동물의 두피를 면도.
   5. 장소귀 바, 마우스 피스를 사용하여 정위 프레임의 동물.
   6. 포비돈 요오드 (3 % 비누, 다음 10 % 용액)로 피부를 청소합니다.
   7. 메스와 두피의 중앙에 길이 방향으로 1 cm 긴 절개를합니다. 가위 정수리 뼈 위의 피부를 잘라 제거를 사용.
   8. 메스의 칼날로 부드럽게 두개골 위의 골막을 제거합니다. 아낌없이 나중에 시멘트 준수를위한 거친 표면을 생성하는 뼈의 상단에 시아 노 아크릴 레이트를 적용합니다.
   9. 4 개 mm 직경의 개두술을 생성하는 수술 macroscope에서 정수리 뼈를 뚫습니다. 아낌없이 가열을 방지하기 위해 전체 공정 중에 Pencillin (1,000 U / ㎖) 및 Streptomicin (1 ㎎ / ㎖)을 함유하는 빙냉 PBS를 추가한다. 집게와 젖은 멸균 거즈로 작은 뼈 조각을 제거합니다. 멀리 출혈을 방지하기 위해 정수리 두개골 봉합 적어도 1mm 드릴주의하십시오.
   10. 유리 창문이 밀폐 될 개두술의 국경에서 얇은 뼈. 목표는 전자입니다뇌와 유리 사이의 최대 접촉 표면과 유리 창 nsure 저장 평면형 포지셔닝. 천천히 집게를 사용하여 뼈를 제거하고 PBS 용액으로 노출 DURA-이잖아요을 청소합니다.
   11. , 5 mm 직경의 원형 유리 커버 슬립을 알코올로 청소하고 휴지 말립니다. 개두술의 덮개로 커버 슬립을 사용하여 뇌의 대형 평면 표면이 유리와 접촉에 들어간 것을 확인하려고합니다. 필요한 경우 커버 슬립에 더 얇은 쪽의 뼈를 제거합니다. 조심스럽게 제자리에 한 번 커버 슬립에 압력을 적용하면 뇌가 평면 압착 얻을 수있을 때까지 계속 진행합니다.
   12. 다시 알코올로 커버 슬립을 청소 티슈로 건조, 따로 따로 저장합니다.
   13. 26 게이지 바늘로 아직 주요 혈관을 피하는 개두술의 중심에 두라 - 이잖아요에 구멍을 만든다. 그냥 두라 - 이잖아요을 열려면이 단계의 목적으로 뇌 실질 조직입니다 손상되지 않도록해야합니다.
   14. 조심스럽게 경질 이잖아요 위스콘신 청소출혈성 혈액을 제거하는 PBS 솔루션을 토륨. 구형 주입을 준비하는 동안 휴지 조각으로 커버.
   15. 2.1 단계에서 제조 된 구형 사출 시스템으로, 단계 1.2에서 제조 된 배양 접시에서 모세 혈관 내경 (약 200 ~ 250 μm의) 적당한 둥근 구형을 빨아. 회전 타원체는 약 5 ㎕의 배지와 함께 와야한다. 그것은 그것의 무게에 모세관의 끝을 아래로 떨어질 것이다.
   16. 개두술을 커버하고 분사 시스템에서 동물을 배치하는 데 사용되는 물티슈 용지를 제거합니다.
   17. 그것은 경질 이잖아요에서 만든 구멍에 닿을 때까지 주입 피펫을 낮 춥니 다. 그 후, 250 μm의 다시 내려. 30 초를 기다립니다.
   18. 천천히 티슈 페이퍼의 얇은 조각으로 과량의 액체를 펌핑하는 동안 마이크로 리터 주사기의 피스톤 (2-3 μL)을 사용하여 회전 타원체를 주입. 30 초를 기다린 후 부드럽게 표면을 향해 50 ㎛에 의해 주입 피펫을 올립니다. 30 초와 반복 하오 다시 기다립니다표면까지 50 ㎛의 단계로 절차를 밟아야 톤. 대기 시간은 피펫에 충실 할 것 회전 타원체의 추출을 방지 할 수 있습니다.
   19. 형광 macroscope을 사용하여 뇌의 회전 타원체의 존재를 확인합니다.
   20. 100 ~ 300 μm의 직경에게 페트리 접시에 PBS 용액으로 가교 덱스 트란 젤 구슬을 섞는다. 1 분을 기다린 후 약간의 수화 구슬 물고기. 개두술에 인접한 뼈에 배치.
   21. 거시적 제어에서 경질-이잖아요 개구부의 크기와 비슷한 직경을 가진 하나의 구슬을 선택합니다. 집게를 사용하여 두 개의 반쪽의 가교 덱스 트란 젤 구슬을 잘라.
   22. 부드럽게 회전 타원체를 향해 볼록한 얼굴 주입 구멍에 가교 덱스 트란 젤 헤미 - 구슬을 넣어. 오목의 국경이 주변의 경질 이잖아요과 접촉 얻을 때까지 조심스럽게 아래로 회전 타원체를 눌러를 제거하지 않도록주의하십시오.
   23. 유리 슬라이드에 시아 노 아크릴 레이트 접착제 한 방울을 넣어 DRO에 이쑤시개의 끝을 찍어접착제의 소량 걸리는 P. 신속 주위 접착제를 스탬핑하여 인접한 경질 교인에 가교 덱스 트란 겔 헤미 - 비드의 가장자리를 밀봉. 이쑤시개에 가교 덱스 트란 젤 헤미 구슬을 접착 방지하기 위해 신속하고 정확한 움직임을 수행하기 위해주의하십시오. 건조하면 영상을 방지하지 않을 경우 확산 방해 할 수 접착제의 과잉을 피하십시오. 접착제가 건조하고 PBS 용액으로 개두술과 주변 뼈를 청소하는 2 분을 기다립니다.
3. 윈도우 주입
   1. 개두술 위의 coverslip의 둘레에 5 mm 직경의를 착용 할 것 (2.2.12 참조). 커버 슬립의 가장자리는 개두술의 외부에 얇아진 두개골에 있어야합니다. 커버 슬립의 가장자리에 두라 - 교인과 얇게 뼈와 접촉해야합니다. 그것은 그렇지 않으면 흉터 조직은 광학 선명도를 개발하고 방해 할 수있는 경질-이잖아요과 유리 커버 슬립 사이의 직접 접촉을하는 것이 매우 중요합니다.
   2. 티슈로, 일에 PBS를 흡수커버 슬립의 중앙에 작은 압력을 적용 할 때 전자의 coverslip의 가장자리는 해당 솔루션 있도록 완전히 개두술을 포함하지 않습니다. 이것은 뼈, 유리, 뇌는 관심 영역의 측면에 접착되어 있는지 확인합니다.
   3. 부드럽게 뼈와 커버 슬립 사이의 경계에서 시아 노 아크릴 레이트를 적용하는 동안 집게로 커버 슬립의 중심에 작은 압력을 유지한다. 접착제는 자발적 PBS 용액과의 계면까지 확산된다. 해결 방법은 접착제의 소수성 주어진 장벽 역할을합니다. 씰링 분 안에 효과가 있지만 해결 될 때까지 커버 슬립을 이동하지 않도록 매우주의해야한다. 이것은 그렇지 않으면 경질 이잖아요 따라서 수술의 실패로 이어질에 시아 노 아크릴 레이트를 노출시키는 결과를 가져올 것입니다.
   4. 접착제는 유리의 상단에 확산했을 경우가 그렇지 않은 경우 광학 선명도를 줄일 수 있으므로, 나선형의 움직임을 수행하여 마이크로 메스 블레이드를 사용하여 제거합니다. 유리 coverslip에 DURIN을 깰하지 조심g 과도한 압력에 의한 절차.
   5. 인접한 두개골 향하여 커버 슬립의 가장자리에 치과 용 시멘트를 적용하여 유리 고정 통합. 두피까지 전체 노출 된 두개골을 포함해야합니다. 여분의 시멘트를 사용하여, 목적의 침적에 필요한 풀을 생성하는 커버 슬립 주위 측벽을 구축. 치과 용 시멘트보다 10 분에서 치료됩니다.

3. 수술 후 관리 및 이미징을위한 준비

1. 수술 후 관리
   1. 정위 프레임에서 마우스를 제거 Dexamethazon (0.2 ㎎ / ㎏)과 Rimadyl 골반 지역에 (5 ㎎ / ㎏) 사우스 캐롤라이나를 주입하고 따뜻한 조직 둥지 새장에 그녀를 배치합니다.
   2. 마취의 효과가 사라 때까지 동물을 모니터링합니다. 수술 후 일반적으로 2 ~ 3 시간에, 마우스는 완전히 이동할 수 있습니다. 동물이 음식과 물에 쉽게 액세스 할 수 있는지 확인하십시오. 아가로 오스가 포함 포도당 (과 동물을 제공 아가로 오스3 %, 글루코스 3 %).
   3. 매일 동물의 체중을 모니터링하고 수술 후 첫 10D에 Dexamethazon (0.2 ㎎ / ㎏)과 Rimadyl (5 ㎎ / ㎏) 사우스 캐롤라이나를 주입. 손실은 원래 체중의 15 %를 초과 할 때, 윤리적 고려 사항은, 마우스를 안락사. 두개 내 압력은 동물 용 모터 장애로 이어지는 종양의 크기에 따라 증가한다. 이 종속 종양 세포 라인과 다양한 지연 수술 후 발생합니다. 특별한주의가 사용한 세포주와 실험의 끝점을 특성화하기 위해주의해야한다.
2. 이미징을위한 준비
   1. 가볍게 유도 챔버 (1-1.5 분 동안 공기 1.5 %)에서 아이소 플루 란을 흡입하여 마우스를 마취.
   2. 케타민 / 자일 라진 (100 ㎎ / kg, 10 ㎎ / kg)의 혼합물을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 이러한 마취는 일반적으로 관찰 45 분 수 있습니다. 이상 촬상 세션을 수행하기 위해, 마우스를 아이소 플루 란으로의 연속 흡입하에 배치공기 (0.25-0.75 %).
   3. 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
   4. 정위 프레임에 동물을 넣고 earbars와 두개골을 차단합니다.
   5. 혈관을 시각화하기 위해, 형광 염료는 정맥 내 주입 될 수있다.
   6. 윈도우가 더러워 나타나면 부드럽게 얇은 칼날과 조직의 모서리와 이물질을 제거하여 세정 될 수있다. 항상 치과 시멘트와 호환되지 않습니다하고 창 아래의 뇌를 냉각 수있는 창을 청소하기 위해 알코올을 사용하지 마십시오.

Representative Results

수술 프로토콜 (도 1)이 수행되면, 동물들은 희생 될 때까지 주 동안 형광 현미경에 의해 관찰 될 수있다. 염증 반응은 1 ~ 2 주 이내에 사라 수술 후 관찰 할 수있다. 종양의 성장 형광 macroscopy 두 광자 현미경 (그림 2) 등 다양한 기술 현미경으로 관찰 할 수있다. 여기에 묘사 된 예제 이미지는 형광 macroscope 및 펨토초 펄스 적외선 파장 가변 레이저와 집 수정 20X 침수 목적 (1.0NA) 아래 동물 위치 할 수 있도록 결합 된 두 광자 현미경에 실현되었다.

종양의 개발은 시야 반사율 이미징 및 표면 형광 방출 (그림 2A-2C)를위한 비스듬한 조명을 결합 형광 macroscope를 사용하여 시간이 지남에 따라 추정되었다. 형광의 임계 쉽게 종양 영역에 대한 액세스를 제공하는 동안 superficial의 혈관은 가시 광선 이미지의 흰색 배경의 어두운 구조를 분리합니다. 다른 손의 intravital에서 두 광자 현미경 Z-절편 및 세포 이하의 해상도로보기의 큰 분야의 직교 복원 (그림 2D의 수상 돌기를 참조) 할 수 있습니다. (예를 들어, 신경의 시안 형광 단백질을 표현 Thy1-CFP 마우스는 그림 2D 녹색 의사 컬러) 그것의 신경 세포의 미세 환경에서의 종양의 진행을 관찰 할 수 있습니다 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 동물을 사용하여. 그러나, 종양 세포의 밀도가 증가 된 확산 광자 침투 깊이뿐만 아니라 방출 광자 검출을 제한 할 수 있음에 유의해야한다. 공간 해상도가 건강한 뇌 실질 조직에서 종양의 경질 문제 아래에 200 ㎛로 감소하기 시작하지만 같은이 명확하게 그림 2D에서 볼 수 있습니다. 또한, 제 2 고조파 발생 신호가 발생 아프로M은 I과 III 콜라겐 경질-이잖아요 (그림 2D 및 화살표의 시안 의사 색)의 서명을 제공하는 형식으로 비 centrosymetric 분자의 패턴을 조직했다. 그것은 우리의 외과 프로토콜로, 종양의 개발은 뇌의 물리적 제약에 의해 지배되는 뇌 실질에 경질-이잖아요 아래 성장 주목해야한다. 가교 덱스 트란 겔 헤미 - 비드 경질 교인의 밀봉 경막 공간에서 신경 교종 세포의 이탈을 방지한다.

의 intravital 이광자 현미경이어서 때 서로 다른 시간 포인트 간의 종양 진행은 셀룰러 해상도에서 비교 될 수있다. D16과 D27 수술 후 (그림 3A) 우리는 11 일의 기간에 걸쳐 안정 화살표로 강조 표시 한 일부 혈관을 발견, 같은 지역 이미징; 반면에 종양 전면 깨끗이 같은 기간 건강 실질에 침투. 종양의 진행, 그 엄마를 평가하려면D27에서 관찰 rgin는 노란색 점선으로 설명하고 D16에서 찍은 사진에 중첩되었다. 전방 에지의 520 μM 시프트 GL261 교종 모델 ^{(15)의보고} 증식 프로파일과 일관되게 관찰 하였다. 종양 내부의 혈관 네트워크의 패턴은 중요한 혈관 리모델링 병리학 영역 (그림 3A)에서 발생하는 것을 나타내는 D16과 D27에 매우 달랐다. 종양 마진, 우리는 또한 침략 종양에서 예상대로 종양 코어에서 분리 신경 교종 세포의 경우를 발견했다. 우리의 심상 미세한 분해능이 세포는 그들의 진행성 (화살촉 및도 3b에 Z-재건)에 대한 매트릭스로서 혈관을 사용할 수 있다는 또한 환경을 감지 세포질 돌기를 방출하지만뿐만 보였다. 두 광자 현미경, 따라서 진정한 생리 학적 맥락에서 세포의 상호 작용을 연구 할 수 있습니다. 또한 각각의 세포 집단은 트랜스 제닉 동물을 사용이 질병의 진행 (그림 3B, 오른쪽)의 주요 규제 등의 종양 세포와 그 환경 사이의 물리적 상호 작용의 존재를 찾을 수있게된다 자신의 형광 기자에 의해 확인.

수술의 그림 1. 개요. 개두술 왼쪽 정수리 뼈 (A)에서 수행됩니다. 왼쪽 정수리 뼈의 한계는 점선으로 설명되고 제거 된 부분은 노란색 (B)에 가득합니다. 개두술이 수행되면, 두정엽 피질 (C)를 ​​노출, 회전 타원체의 주입을위한 영역은 주요 혈관 (D 화살표)와 26 게이지 바늘이 경질-이잖아요을 여는 데 사용됩니다 (않도록주의하면서 선택 ) E 화살표. 회전 타원체는주입 경질-이잖아요의 구멍은 시아 노 아크릴 레이트 접착제 (F 화살표)로 밀봉 가교 덱스 트란 젤 헤미 - 비드에 의해 막혀 있습니다. 뇌와의 접촉을 유지하면서 유리 커버 슬립은 뼈에 붙어있다. coverslip에 더욱 만성 관찰 (GI)의 두개골 윈도우의 장기 고체 첨부 파일을 확인하기 위해 노출 된 두개골에 접합된다. 전체 프로토콜은 간단히 J에 도식화되어있다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 종양의 성장은 뇌 실질에 제한 시간. AC를 통해 모니터링 할 수 있습니다. 종양의 성장 (DsRed2을 표현 GL261 세포 라인) m에 의해 관찰수술 당일 (DO, A)과 21 일 (B)에 acroscopy 27 (C). C의 화살촉 단계 2.3.5. D 동안 제거되지 않은 치과 용 시멘트의 드롭을 강조한다. D20 수술 후 두 광자 현미경으로 GL261 종양 베어링 Thy1-CFP 마우스의 경질 이잖아요 아래 300 μm의 0에서 인수 한 3 × 3 필드에서 얻은 직교 복원. 종양 (빨간색), 두 번째 고조파 발생 (화살표, 시안) 뉴런 (녹색)에 의해 관찰 DURA-이잖아요. 종양이 뇌 실질 조직의 경질 이잖아요 아래로 성장합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 버지니아에게scular 리모델링 및 종양 세포 침공의 intravital 두 광자 현미경으로 세포의 공간 해상도와 시간에 모니터링 할 수 있습니다. . GL261 종양 (빨간색)은 혈관을 강조 폭포 블루 덱스 트란 70 kDa의의 정맥 주사 후 D16과 D27의 수술 후 관찰. 점선 : D27에서 종양 마진; 화살표 :. D16과 D27 B에서 같은 지역을 집중하는 명소로 사용할 수있는 혈관의 예. 침입 (화살촉)에 대한 매트릭스로서 혈관을 사용함; 개별 종양 세포 (적색) 건강한 뇌 실질 (녹색 뉴런) 침입. 이미지는 100에서 경질 문제 아래 150 μm의에 이르기까지 깊이에서 촬영했다. 점선 :. 지역 하단 중앙 패널에 묘사 된 직교 재건이 실현 된 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이러한 접근 방식은 광학 이미징 방법의 사용이 일 주간 orthotopically 주입 된 신경 교종의 증식을 통해 모니터링 할 수있다. 같은 동물은 이후 병리의 과정에서 거의 모든 뇌 영상 기법을 실시 할 수있다; 아직 두 광자 현미경 특정 준비는 살아있는 동물의 뇌 속에있는 세포 이하의 해상도를 달성 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 우리의 프로토콜은 신경 교종 세포가 손상된 경막을 통해 중추 신경계를 남겨 둘 수있는 경우에 발생으로 오히려 추가 durally보다 뇌 실질 조직에 종양의 성장을 적용 할 수있는 장점을 제공한다. 뇌의 환경에 의해 가해지는 물리적 제약의 부재에서, 종양 세포는 실제로 그들이 실질 ^{16에 침투} 할 필요가 없습니다으로 빠르게 증식 할 수 있습니다. 이전에 발행 된 방법은 오히려 상체보다 세포 현탁액을 주입보다 더욱 문제가 있었다 이식 후 경막을 밀봉하지 않았다^9,13,14. 세포 현탁액은 참으로 깊이에서 DURA-이잖아요에 피펫을 철회 할 때 각각의 세포를 체계적으로 주입 관을 따라 시드대로 focally 적용하는 것이 불가능하다.

현재의 프로토콜은 유전자 변형과 면역 억제 동물 등 다양한 마우스 종자에 적용 할 수 있습니다. 각종 신경 교종 세포주 그래프트 직접만큼 그들이 안정적으로 형광 리포터 전에 식립을 표현 형질로 생검 인간 유래의 세포를 포함하여, 시각화 될 수있다. 외과 프로토콜은 일반적으로 1 시간에서 수행 될 수 있고, 동물의 코호트 빠르게 얻을 수있다. 이 방식은, 따라서 종양에 혈관 리모델링, 혈관 형성 및 종양 성장에 대한 약리 치료의 효과뿐만 아니라 면역 세포의 모집을 연구하는데 사용될 수있다. 필요한 경우 신경 교종 세포의 이동과 신경 교종 세포와 미세 환경 사이의 역동적 인 상호 작용은 여러 HOU에 대해 실시간으로 관찰 할 수있다RS.

촬상 500 μm의 깊이에 걸쳐 수행 될 수있는 바와 같이 그 종양 부피의 대부분이 초기 경질 mater를 200 ㎛ 이하로 이식 커버하는 것이 가능하다. 보장하기 위해 최대 촬상 깊이 특별한주의가 경질-이잖아요과 유리 커버 슬립 사이의 물리적 접촉을 만들기 위해 수술하는 동안주의해야합니다. 이것은 참, 그렇지 않으면 광학 선명도를 손상 것이다 반흔 조직의 형성을 감소시킨다. 수술 환경의 절대 불임은 일시적으로 창을 흐리게 수술 후 염증을 제한하기 위해 준수해야합니다. 어쨌든 우리는 최적의 영상 조건을 얻기 위해 수술과 첫 번째 관찰 세션 사이에 십오일 기다려야 조언한다. 그 후, 창은 종양 회전 타원체의 주입을 제외한 모든 프로토콜을 시행 한 모의 운영 동물의 수술 후 1 년에 맑은까지 남아있는 것으로 밝혀졌다.

결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 기존 ORTH의 개선을 나타낸다otopic 신경 교종 마우스 모델은 만성의 intravital 두 광자 현미경 최선을 다하고 있습니다. 종양 타원체의 표면 분사는 분사의 막힘은 가교 결합 된 덱스 트란 겔 헤미 - 비드 및 경질 교인 진정한 일반적 질병의 진행을 관리하는 물리적 제약 되풀이되었습니다 뇌 환경에서 종양 발생을 적용의 씰링 추적. 이 방법은 신경 교종의 병태 생리에 대한 기초 연구를 제공 할뿐만 아니라 임상 시험 기간 동안 약물 학적 결과의 관련성을 향상시킬뿐만 아니라.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 따뜻하게 박사 KK Fenrich 박사 MC 감사합니다. Amoureux, P. 웨버와 도움이 토론 A. JAOUEN; M. Hocine, C. 무니, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, IBDML의 동물 시설 및 기술 지원 IBDML에서 PicSIL 이미징 플랫폼의 직원의 직원. 이 작품은 GR, 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), 연맹 문화원 국립 뒤 암 (INCA-DGOS-INSERM6038)에서 교부금에 의해 지원 된 연맹에서 장학금으로, FD 라 공들인 쉬르 르 Cerveau (FRC)을 부어 CR에 드 라 공들인 Médicale 및 Cancéropole PACA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

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