Um Glioblastoma Rato modelo ortotópico Manter restrições Cérebro parênquima físicas e Adequado para intravital dois fótons Microscopia

Summary

Nós estabelecemos um modelo de glioblastoma ortotópico cortical em camundongos para microscopia de dois fótons intravital que recapitula as restrições biofísicas normalmente no jogo durante o crescimento do tumor. Uma janela de vidro crônica substituir o crânio acima do tumor permite o acompanhamento da progressão do tumor ao longo do tempo por meio de microscopia de dois fótons.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais agressiva de tumores cerebrais sem tratamentos curativos disponíveis até o momento.

Modelos murinos desta patologia contar com a injecção de uma suspensão de células de glioma no parênquima cerebral após a incisão da dura-máter. Considerando que as células têm de ser injetada superficialmente para ser acessível a microscopia de dois fótons intravital, as injeções superficiais deixam de recapitular as condições fisiopatológicas. Na verdade, escapando através do trato injeção maioria das células tumorais alcançar o espaço extra-dural onde expandir anormalmente rápido na ausência de restrições mecânicas do parênquima.

Nossos melhorias não consistem apenas em focalmente a implantação de um esferóide de glioma em vez de injecção de uma suspensão de células de glioma nas camadas superficiais do córtex cerebral, mas também no entupimento do local de injecção por um gel de dextrano hemi-cordão de ligação cruzada que é colada à surrounding parênquima e selou a dura-máter com cianoacrilato. Todas estas medidas aplicar a expansão fisiológica e infiltração de células tumorais no interior do parênquima cerebral. Craniotomia foi finalmente fechada com uma janela de vidro cimentados ao crânio para permitir imagens crônica ao longo de semanas, na ausência de desenvolvimento do tecido da cicatriz.

Aproveitando-se de animais transgênicos fluorescentes enxertados com células tumorais fluorescentes Nós mostramos que a dinâmica das interações que ocorrem entre as células de glioma, neurônios (ex-PCP Thy1 ratos) e vascularização (destacado por uma injeção intravenosa de um corante fluorescente) pode ser visualizado por intravital microscopia de dois fotões durante a progressão da doença.

A possibilidade de uma imagem de tumor com resolução microscópica em um ambiente cerebral minimamente comprometido representa uma melhoria de modelos animais atuais GBM que deve beneficiar o campo da neuro-oncologia e testes de drogas.

Introduction

Glioblastoma multiforme aparece como a forma mais agressiva de tumor cerebral em adultos com uma sobrevida média de 12 meses e uma taxa de sobrevida em 5 anos de 5%. O tratamento clínico depende de cirurgia, radioterapia e quimioterapia, muitas vezes utilizados em combinação. No entanto, os efeitos destes tratamentos paliativos permanecem ^1-3.

Até agora, a maioria dos estudos de neuro-oncologia contar com técnicas que só são capazes de fornecer uma visão estática e realizados em grandes grupos de animais portadores de tumor sacrificados em diferentes pontos temporais (ver, por exemplo, ^4,5). O recente desenvolvimento de métodos de acompanhamento com base em imagens intravital permite estudar o crescimento de glioma e as interações entre as células tumorais e seu microambiente fisiopatológico no mesmo animal ao longo do tempo. Isso abre o caminho para a peça exclusiva de informação que foi até agora inatingível ^6. Animais transgênicos expressando marcas fluorescentes em células de interesse pode ser usadod para estudar as interações específicas entre as células tumorais e ex neurônios neste papel.

Ao longo da última década, a microscopia de dois fótons intravital ⁷ tornou-se um padrão-ouro em estudos neuro-oncologia fundamentais e ensaios pré-clínicos ^8,9 por sua capacidade de realizar observação intravital profundo de cérebro do rato (> 500 mm abaixo da dura-máter) com uma resolução espacial micrométrica ^10. Utilizando microscopia de dois fotões intravital com modelos animais orthotopical implantados com uma janela craniana crónica ^11, é possível seguir a progressão do tumor ao longo do tempo no mesmo ^9,12 rato.

Uma das principais desvantagens destes modelos animais anteriormente publicadas, no entanto, que eles não imitam as limitações físicas que governam o crescimento do tumor como a dura-máter não é selado após a injecção da suspensão celular ^9,13,14. Células de glioma podem vazar noespaço extradural transformar um modelo de glioma ortotópico em um heterotópico.

O modelo animal aqui apresentados consiste na injecção de um esferóide de células de glioma fluorescentes no córtex cerebral, a uma profundidade de 200 um, seguido pelo fecho da dura-máter com um gel de dextrano hemi-grânulo reticulado e cola de histo-compatibilidade . O crescimento do tumor é então restrito ao parênquima cerebral que mantém as restrições físicas fisiopatológicos. Uma janela de vidro crônica implantado acima do tumor permite um acesso óptico fácil para microscopia de dois fótons intravital. Usando animais transgênicos expressando marcas fluorescentes em células de interesse, é possível realizar um acompanhamento do crescimento glioma ao longo do tempo e estudar sua interação com seu microambiente (aqui com os neurônios e vasos destacados com dextrans fluorescentes).

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a legislação francesa e em conformidade com a directiva do Conselho da Comunidade Europeia de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) para o cuidado e uso de animais de laboratório. A pesquisa em animais foi autorizada pela Direção Départementale des Serviços vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licença D-13-055-21) e aprovado pelo comitê de ética da Provence Côte d'Azur n ° 14 (Projeto 87-04122012) .

1. Esferóides Preparação

1. Preparação das placas de Petri revestidas com agarose
   1. Mistura-se 1 g de agarose com 100 ml de meio de cultura de células não suplementadas com soro fetal bovino. Usar um forno de microondas (850 Watts durante 40 seg, depois 3 x 15 seg; agita-se a solução entre cada sessão de microondas) para ferver a solução e para dissolver completamente a agarose. Autoclave esta solução de agarose a 1% durante 20 minutos a 120 ° C para garantir Steri. dade Nota: Tome cuidado para dissolver completamente o agarose antes do protocolo autoclave. Falta de homogeneidade pode comprometer a formação de esferóides.
   2. Uma vez recuperada a partir do autoclave, verter 10 ml da solução de agarose a 1% em 100 x 20 mm pratos Petri. Deixar a placas de Petri de 20 min à temperatura ambiente para permitir que a solução de agarose a 1% para solidificar.
   3. Adicionar 10 ml de PBS acima da agarose para manter a humidade. Selar a tampa das placas de Petri revestidas com agarose enrolando-os com parafilme para evitar a evaporação. As placas de Petri podem ser armazenados durante 2 meses a 4 ° C, se adequadamente humidificado pela camada de PBS.
2. Cultura esferóide
   1. Em de 75 cm ² frascos, a cultura das células de glioma em seu meio recomendado como uma monocamada.
   2. Substituir o PBS a partir de um dos 1% de agarose revestidas com uma placa de Petri com 1,5 ml de "meio de pré-condicionado" recolhidos a partir do recipiente que contém a monocamada de células de glioma de 2Ds.
   3. Remover o meio do frasco contendo a monocamada de 2D de células de glioma.
   4. Lave a monocamada com 10 ml de PBS.
   5. Adicionar 2 ml de 0,05% de uma solução de tripsina / EDTA e incubar o balão de 4 min a 37 ° C. Nota: O tempo de incubação pode variar de acordo com a linha celular utilizada.
   6. Adicione 8 ml de meio de cultura para impedir a ação da tripsina, lave delicadamente a suspensão de células Nota:. Tome cuidado para não lavar ar na suspensão de células à medida que aumenta a morte celular.
   7. Coloque 6 ml da suspensão de células num frasco estéril.
   8. Centrifuga-se o frasco de 4 minutos a 800 rpm.
   9. Remover o sobrenadante e suspender suavemente o sedimento de células em 3 ml de meio de cultura.
   10. Semente da suspensão de células no preparado revestida de agarose placa de Petri.
   11. Colocar a placa de Petri, a 37 ° C numa atmosfera de _{CO2 a} 5% durante 2 a 3 dias, até os esferóides de diâmetro desejado são formados.
2. Esferóide e Janela Implantação
1. Preparação do sistema de injecção
   1. Capilares de vidro limpo (1 mm de diâmetro) por sonicação em etanol a 70% durante 10 min. Lavar duas vezes com água antes colocação dentro de uma incubadora até secar.
   2. Puxe vários capilares de vidro limpo com um puxador de pipeta, a fim de preparar um pequeno estoque.
   3. Quebrar a ponta do capilar puxado por raspagem sobre a extremidade de um pedaço de papel de seda para se obter um extremidade chanfrada do tamanho desejado: normalmente um diâmetro externo de 300-350 ^ m e um diâmetro interno de 250-300 mM. Durante este processo de conformação, controlar o diâmetro do capilar utilizando um macroscópio cuja ocular está equipado com uma mira graduada.
   4. Ligue a extremidade não chanfrada do capilar para um colector de 3 vias utilizando um pedaço de tubo de plástico, cujo diâmetro interior se ajusta o diâmetro externo do tubo capilar.
   5. Usando tubin plásticog, ligar as duas outras formas de colector para uma 25 ul microlitro seringa e uma seringa de 1 ml carregado com óleo mineral histo-compatibilidade.
   6. Ajuste o seletor múltiplo para estabelecer um caminho entre a seringa microlitro ea seringa de 1ml. Remover o pistão da seringa microlitro e injetar óleo mineral para trás para dentro da seringa microlitro até que vaza, empurrando o êmbolo da seringa de 1ml. Substitua o pistão da seringa microlitro, enquanto tomando cuidado para não deixar bolhas de ar no tubo.
   7. Ajuste o seletor múltiplo para estabelecer um caminho entre o capilar ea seringa de 1 ml. Encha o capilar com óleo mineral até que vaza da ponta, tendo o cuidado para não deixar bolhas de ar no tubo.
   8. Ajustar o selector de colector para estabelecer uma ligação entre a seringa de microlitro e o capilar. Expelir a cerca de 10 ul de óleo mineral.
   9. Mergulhe a ponta capilar em solução PBSe usando o calibre da seringa microlitro, aspirar 5 ul de PBS no capilar. Note-se que o menisco entre o óleo e PBS é claramente visível.
   10. Fixar o capilar num micromanipulador 3 eixo encaixe sob o macroscópio cirurgia. Este sistema irá ser utilizado para orientar o capilar para o local da injecção sob controle visual.
2. Implantação esferóide
   1. Levemente sedar o mouse por inalação de isoflurano em uma câmara de indução (1,5% em ar durante 1 a 1,5 min).
   2. Anestesiar os animais com uma injecção intra-peritoneal de uma mistura de cetamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Note-se que a anestesia frequentemente reduz a temperatura do corpo do animal. Recomenda-se a prosseguir com a cirurgia em uma sala a 26 ° C e manter o animal aquecido com uma almofada de aquecimento thermocontrolled subjacente.
   3. Aplicar pomada para evitar a dessecação dos olhos.
   4. Raspar o couro cabeludo do animal.
   5. Lugaro animal em uma estrutura estereotáxica usando barras de ouvido e um bocal.
   6. Limpar a pele com iodo povidona (3% de sabão, em seguida, solução a 10%).
   7. Adicione a 1 cm de comprimento incisão longitudinal no meio do couro cabeludo com um bisturi. Com uma tesoura cortar e remover a pele acima dos ossos parietais.
   8. Com uma lâmina de bisturi remover suavemente o periósteo acima do crânio. Generosamente aplicar cianoacrilato no topo do osso para gerar uma superfície áspera para mais tarde a aderência de cimento.
   9. Perfurar o osso parietal sob uma macroscópio cirúrgico para gerar uma craniotomia, de 4 mm de diâmetro. Generosamente adicionar PBS gelado contendo penicilina (1000 U / ml) e estreptomicina (1 mg / ml) durante todo o processo para evitar um aquecimento. Retire os pequenos fragmentos de osso com uma pinça e uma gaze estéril molhado. Tome cuidado para perfurar pelo menos um milímetro de distância de suturas do crânio parietais para evitar hemorragias.
   10. Fina osso na fronteira da craniotomia em que a janela de vidro será selado. Objetivo é eNsure posicionamento posterior plana da janela de vidro com superfície de contacto máxima entre o cérebro e o vidro. Lentamente, retire o osso usando uma pinça e limpar a dura-máter exposta com a solução de PBS.
   11. Tome a 5 mm de diâmetro rodada lamela de vidro, limpe-o com álcool e seque-a com papel de seda. Tentar usar a lamela como uma tampa para a craniotomia e confirmar que uma grande superfície plana do cérebro fica em contacto com o vidro. Se for necessário retirar a lamela mais a densidade dos ossos laterais. Prossiga até que o cérebro pode ficar espremido plana se aplicar suavemente a pressão sobre a lamela uma vez no lugar.
   12. Limpe novamente a lamela com o álcool, seque-a com papel de seda, e guardá-lo à parte.
   13. Com uma agulha de calibre 26 fazer um buraco na dura-máter no centro da craniotomia ainda evitar vasos sanguíneos principais. Certifique-se de não danificar o parênquima cerebral como o objetivo desta etapa é apenas para abrir a dura-máter.
   14. Limpe suavemente o wi dura-máterª solução PBS para remover sangue hemorrágico. Cubra com um pedaço de papel de seda enquanto prepara a injeção esferóide.
   15. Com o sistema de injecção de esferóide, preparado no passo 2.1, chupar um esferóide rodada montagem do diâmetro interno capilar (aproximadamente 200-250 mm) a partir da placa de Petri, preparado no passo 1.2. Esferóide deve vir junto com cerca de 5 mL de meio de cultura. Ele deve cair para a ponta da capilaridade sob o seu peso.
   16. Remover o papel de seda molhado utilizadas para cobrir a craniotomia e posicionar o animal sob o sistema de injecção.
   17. Abaixe a pipeta de injeção até tocar no buraco feito na dura-máter. Em seguida, coloque-o novamente por 250 um. Espere 30 segundos.
   18. Lentamente injectar o esferóide utilizando o êmbolo da seringa de microlitros (2-3 ul), enquanto bombeia para fora o excesso de líquido com um pequeno pedaço de papel de seda. Espere 30 segundos e, em seguida, levante cuidadosamente a pipeta de injeção de 50 mm em direção à superfície. Espere 30 segundos e novamente REPEAt o processo de elevação por passos de 50 mM até a superfície. Tempo de espera evita a extração do esferóide que iria ficar para a pipeta.
   19. Confirmar a presença do esferóide no cérebro utilizando uma macroscópio fluorescência.
   20. Misturar 100-300 diâmetro mM reticulados contas de gel dextrano com solução de PBS numa placa de Petri. Espere 1 minuto e pescar algumas contas hidratados. Colocá-los no osso adjacente ao craniotomia.
   21. Sob o controlo macroscópica, escolher um cordão com um diâmetro semelhante ao tamanho da abertura da dura-máter. Cortar o talão de gel de dextrano reticulado em duas metades, utilizando fórceps.
   22. Com cuidado, coloque um dextrano gel hemi-talão reticulado no orifício de injeção com a face convexa em direção ao esferóide. Tome cuidado para não remover o esferóide e pressione suavemente para baixo até a fronteira do côncavo entrar em contato com a dura-máter circundante.
   23. Coloque uma gota de cola de cianoacrilato sobre uma lâmina de vidro; molhe a ponta de um palito no drop para levar uma pequena quantidade de cola. Rapidamente selar as bordas do gel de dextrano hemi-grânulo reticulado para a dura-máter adjacente por estampagem em torno de cola. Ter o cuidado de executar movimentos rápidos e precisos, a fim de evitar a colagem do dextrano reticulado em gel de hemi-grânulo para o palito. Evite o excesso de cola que pode se espalhar e impedir se não impedir imagem depois de secas. Espere 2 minutos para a cola secar e, em seguida, limpar a craniotomia e osso circundante com solução PBS.
3. Implantação Janela
   1. Coloque a 5 mm de diâmetro rodada lamela acima da craniotomia (ver 2.2.12). As arestas da lamela deve ser diluído no crânio no exterior da craniotomia. A lamela deve estar em contato com a dura-máter eo osso diluído nas bordas. É muito importante ter um contato direto entre a dura-máter ea lamela de vidro de outra forma o tecido da cicatriz pode desenvolver e impedir a claridade óptica.
   2. Com um lenço de papel, absorver o PBS no tharestas e de lamelas, de modo que solução não cobre totalmente a craniotomia, quando da aplicação de uma pequena pressão no centro da lamela. Isto irá garantir que o osso, de vidro e cérebro são coladas no lado da região de interesse.
   3. Manter uma pequena pressão no centro da lamela com um fórceps enquanto aplicando suavemente cianoacrilato na fronteira entre o osso e a lamela. A cola vai espalhar-se espontaneamente até a interface com a solução de PBS. Solução vai agir como uma barreira dada a hidrofobicidade da cola. Vedação deve ser eficaz em menos de um minuto, mas tomar um extremo cuidado para não mover a lamela até que seja corrigido. Isso de outro modo resultar em fuga de cianoacrilato sobre a dura-máter, portanto, conduzir a uma falha da cirurgia.
   4. Em caso de cola teriam se espalhado em cima do vidro, removê-lo usando uma lâmina de micro-bisturi, fazendo movimentos em espiral, uma vez que, de outra forma reduzir a claridade óptica. Cuidado para não quebrar a lamela de vidro during o processo, devido a pressão excessiva.
   5. Consolidar a fixação de vidro, aplicando cimento dental nas bordas da lamínula em direção ao crânio adjacente. Certifique-se de cobrir todo o crânio exposto até o couro cabeludo. Usando cimento extra, construir paredes laterais ao redor da lamela para criar o pool necessário para a imersão do objetivo. O cimento dental vai curar em menos de 10 min.

3. Cuidados pós-operatórios e Preparação for Imaging

1. Cuidados pós-operatórios
   1. Retire o mouse do quadro estereotáxico, injetar Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc sobre as regiões pélvica e deitá-la em uma jaula com um caloroso tecido-ninho.
   2. Monitorar o animal até os efeitos da anestesia ter desaparecido. Em geral 2 a 3 horas após a cirurgia, os ratos são totalmente móvel. Certifique-se que o animal tem um fácil acesso a comida e água. Fornecer o animal com agarose contendo glicose (agarose3%, glicose a 3%).
   3. Monitorizar o peso dos animais diariamente e injectar Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc para o primeiro 10d após a cirurgia. Por considerações éticas, eutanásia os ratos quando a perda for superior a 15% do seu peso original. A pressão intracraniana aumenta com o tamanho do tumor levando a deficiências motoras para o animal. Esta é a linha de células tumorais dependente e ocorre em vários atrasos pós-cirurgia. Cuidados especiais devem ser tomados para caracterizar o ponto final do experimento com a linhagem celular utilizada.
2. Preparação para a imagem latente
   1. Levemente sedar o ratinho por inalação de isoflurano numa câmara de indução (1,5% em ar durante 1 a 1,5 minutos).
   2. Anestesiar os animais com uma injecção intra-peritoneal de uma mistura de cetamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Tal permite que a anestesia tipicamente 45 minutos de observação. Para realizar as sessões de imagem mais longos, o mouse é colocado sob a inalação contínua de isoflurano emar (0,25-0,75%).
   3. Aplicar pomada para evitar a dessecação dos olhos.
   4. Coloque o animal em um quadro estereotáxico e bloquear o crânio com os earbars.
   5. Para visualizar os vasos sanguíneos, um corante fluorescente pode ser injectado por via intravenosa.
   6. Se a janela estiver suja, pode ser limpa, removendo delicadamente os escombros com uma lâmina fina e no canto de um tecido. Não use álcool para limpar a janela, uma vez que nem sempre é compatível com cimento dental e pode resfriar o cérebro abaixo da janela.

Representative Results

Uma vez que o protocolo cirúrgico é realizado (Figura 1), os animais podem ser observados por meio de microscopia de fluorescência ao longo de semanas até ao sacrifício. Uma reação inflamatória pode ser observada após a cirurgia, que desaparece dentro de uma ou duas semanas. O crescimento do tumor pode ser observada através de várias técnicas de microscopia, incluindo a microscopia de fluorescência e análise macroscópica de dois fotões (Figura 2). Imagens de exemplo descritos aqui foram realizados em um macroscópio fluorescência e um microscópio de dois fotões acoplado a uma pulsada laser ajustável infravermelho femtosegundo e home-modificado para permitir o posicionamento de animais abaixo do objetivo de imersão em água 20X (1.0NA).

O desenvolvimento tumoral foi avaliado ao longo do tempo usando uma combinação de fluorescência macroscópio iluminação oblíqua para o campo luminoso reflectância de imagem e de emissão de epifluorescência (Figuras 2A-2C). Thresholding da fluorescência facilmente dá acesso à área do tumor, enquanto superficial vasculatura separar estruturas escuras fora do fundo branco da imagem de luz visível. Por outro lado intravital microscopia de dois fótons permite z-secção e reconstruções ortogonais de grandes campos de visão com resolução subcelular (ver dendrites na Figura 2D). Utilizando os animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes em células de interesse (por exemplo, murganhos Thy1-PCP que expressam a Proteína Fluorescente Ciano em neurónios, pseudo-cor verde na Figura 2D), é possível observar a progressão do tumor no seu micro-ambiente neuronal. No entanto, deve notar-se que a densidade de células de tumor pode limitar a profundidade de penetração de fotões, bem como a detecção de fotões emitidos, devido ao aumento da difusão. Isto é claramente visível na Figura 2D, como a resolução espacial começa a diminuir a 200 um abaixo da dura-máter em que o tumor, mas não no parênquima do cérebro saudável. Além disso, o sinal de geração de segundo harmônico decorrentes from organizado padrões de moléculas não centrosymetric como colágeno I e III fornece uma assinatura da dura-máter (ciano pseudo-cor na Figura 2D e setas). Deve-se notar que com o nosso protocolo cirúrgico, o tumor cresce abaixo da dura-máter no parênquima do cérebro, onde o seu desenvolvimento é regulado pelas restrições físicas do cérebro. A vedação da dura-máter com um gel de dextrano hemi-grânulo reticulado evita a fuga de células de glioma no espaço extradural.

Quando seguido por microscopia de dois fotões intravital a progressão do tumor entre os diferentes pontos de tempo pode ser comparado com a resolução celular. Imagem da mesma área em D16 e D27 de pós-operatório (Figura 3A) encontramos alguns vasos sanguíneos como o destacado por flechas que eram estáveis ​​durante um período de 11 dias; por outro lado frente do tumor claramente infiltrada no parênquima saudável em relação ao mesmo período. Para avaliar a progressão do tumor, a sua margin observado em D27 foi delineado com uma linha pontilhada amarelo e sobreposto à foto tirada em D16. Uma mudança de 520 mM da borda frontal foi observado de forma consistente com o perfil relatado proliferativa do modelo GL261 glioma ^15. Os padrões da rede vascular no interior do tumor eram muito diferentes em D16 e D27, indicando que a remodelação vascular significativa ocorre em áreas patológicas (Figura 3A). Às margens do tumor, também encontramos casos de células de glioma destacando a partir do núcleo do tumor como esperado de um tumor invasivo. A resolução microscópica das nossas imagens mostram não só que essas células emitem saliências citoplasmáticos para sentir o ambiente, mas também que eles podem usar os vasos sanguíneos como matriz para a sua progressão (pontas de seta e z-reconstrução na Figura 3B). Microscopia de dois fótons permite, assim, para estudar as interações celulares em um contexto verdadeiramente fisiológica. Usando animais transgênicos onde cada população celular em causa éidentificado pelo seu próprio repórter fluorescente torna-se possível olhar para a existência de interações físicas entre as células tumorais eo seu ambiente como reguladores-chave da progressão da doença (Figura 3B, à direita).

Figura 1. Resumo da cirurgia. Craniotomia A é realizado no osso parietal esquerdo (A). Os limites do osso parietal esquerdo são contornadas com uma linha tracejada e a parte removida é preenchido amarelo (B). Uma vez que a craniotomia realizada, o córtex parietal é exposto (C), a área para a injeção do esferóide é selecionada com cuidado para evitar os vasos sanguíneos principais (seta em D) e uma agulha de calibre 26 é usado para abrir a dura-máter ( arrow em E). O esferóide éinjectado e o orifício na dura-máter é obstruído por um gel de dextrano hemi-grânulo reticulado selada com cola cianoacrilato (seta em C). Uma lamela de vidro é colado ao osso, mantendo o contacto com o cérebro. A lamela é ainda colada à cabeça exposta para garantir uma fixação sólida a longo prazo da janela craniana para observações crónicas (GI). O protocolo é brevemente todo esquematizado na J. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2. Crescimento do tumor é restringida para o parênquima cerebral e pode ser monitorizada ao longo do tempo. AC. O crescimento do tumor (linha de células expressando GL261 DsRed2) é observado por macroscopy no dia da cirurgia (DO, A) e no dia 21 (B) e 27 (C). A seta em C destaca uma gota de cimento odontológico que não foi removida durante a etapa 2.3.5. D. Reconstruções ortogonais obtidos a partir de um campo de 3 x 3 adquirido de 0 a 300 mM abaixo da dura-máter em um mouse Thy1-PCP tendo um tumor GL261 por microscopia de dois fótons em D20 pós-cirurgia. Tumor (vermelho), dura-máter observado por geração de segundo harmônico (setas, ciano) e neurônios (verde). Note-se que o tumor cresce abaixo da dura-máter no parênquima cerebral. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 3. Vascular remodelação e células tumorais invasão pode ser monitorado ao longo do tempo, com resolução espacial de celular por microscopia de dois fótons intravital. Um tumor. GL261 (vermelho) observado em D16 e D27 de pós-cirurgia após uma injeção intravenosa de dextrano Cascade-azul de 70 kDa para destacar vasos sanguíneos. A linha pontilhada: margem de tumor no D27; Setas: exemplo de vasos sanguíneos que podem ser utilizados como pontos de referência para localizar a mesma área em D16 e D27 B.. Células tumorais individuais (vermelho) invadem o parênquima saudável cérebro (neurônios; verde), utilizando vasos sanguíneos como matriz para invasão (setas). As imagens foram tiradas a uma profundidade que varia desde 100 a 150 um abaixo da dura-máter. Linha pontilhada:. Região onde a reconstrução ortogonal retratado no painel central inferior foi realizada Clique aqui para ver imagem ampliada.

Discussion

Esta abordagem permite a utilização de métodos de imagiologia óptica para monitorizar ao longo de dias e semanas, o crescimento de glioma ortotopicamente implantado. O mesmo animal pode ser subsequentemente submetido a virtualmente qualquer modalidade de imagem do cérebro durante o decorrer da patologia; no entanto, a preparação específica microscopia de dois fótons oferece a oportunidade única de alcançar resolução subcelular dentro do cérebro do animal vivo. Nosso protocolo apresenta a vantagem de fazer cumprir o crescimento do tumor para o parênquima cerebral, em vez de extra-durally como acontece se as células de glioma pode sair do sistema nervoso central através da dura danificado. Na ausência de restrições físicas exercidas pelo ambiente cérebro, células tumorais podem realmente proliferar mais rápido que eles não precisam se infiltrar no parênquima ^16. Métodos anteriormente publicados não tentou selar a dura-máter após a enxertia, que foi o mais problemático do que eles injetaram suspensão de células em vez de esferóides^9,13,14. Suspensões de células são, de fato impossível aplicar focally como células individuais são sistematicamente semeado ao longo do trato injeção ao retirar a pipeta da profundidade para a dura-máter.

O actual protocolo pode ser aplicado em várias estirpes de ratinhos transgénicos e incluindo animais imunossuprimidos. Diversas linhas de células de glioma pode ser enxertado e visualizados, incluindo as células provenientes directamente de biópsias humanas, contanto que são transfectadas de forma estável para expressar um repórter fluorescente enxertia antes. Protocolo cirúrgico pode ser tipicamente realizada em 1 h e grupos de animais pode ser rapidamente obtido. Esta abordagem pode, assim, ser usadas para estudar a remodelação vascular, os efeitos de tratamentos farmacológicos na angiogénese e o crescimento do tumor, bem como o recrutamento das células imunes para o tumor. Quando necessário a migração de células de glioma e interacções dinâmicas entre as células de glioma e o microambiente pode ser observada em tempo real para vários hours.

Tal como a imagem pode ser feito ao longo profundidades de 500 um, é possível cobrir a maior parte do volume do tumor implantado inicialmente 200 um abaixo da dura-máter. Para garantir a máxima profundidade da imagem de cuidados especiais devem ser tomados durante a cirurgia para criar o contato físico entre a dura-máter ea lamela de vidro. Isto efectivamente reduz a formação de tecido cicatricial que de outra forma comprometer a clareza óptica. Esterilidade absoluta do ambiente cirúrgico também deve ser observado para limitar a inflamação pós-cirurgia que transitoriamente borra a janela. Nós de qualquer maneira aconselho a esperar 15 dias entre a cirurgia ea primeira sessão de observação para obter condições de imagem ideal. Depois disso, a janela foi encontrada para permanecer claro até um ano após a cirurgia sham operado em animais que foram submetidos a todo o protocolo, exceto a injeção do esferóide tumor.

Em conclusão, o protocolo descrito aqui representa uma melhoria de orte existentemodelo otopic glioma rato dedicado a microscopia de dois fótons intravital crônica. A injecção superficial de um esferóide do tumor, o entupimento da injecção rastrear com um gel de dextrano hemi-cordão de ligação cruzada e a vedação da dura-máter reforçar o desenvolvimento do tumor no cérebro ambiente que verdadeiramente recapitula os constrangimentos físicos normalmente regulam a progressão da doença. Não só este método irá servir estudos fundamentais sobre glioma fisiopatologia, mas também irá melhorar a relevância dos resultados farmacológicos durante ensaios pré-clínicos.

Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores agradecem calorosamente Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. e A. Weber Jaouen para discussões úteis; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, o pessoal do biotério em IBDML eo pessoal da plataforma de imagem PicSIL em IBDML para suporte técnico. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional do Câncer du (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), pour la Recherche Fédération sur le Cerveau (FRC) para FD, por bolsas de estudo da Federação Recherche Médicale de la e Cancéropôle PACA ao CR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

1. DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
2. Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
3. Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
4. Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
5. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
6. Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
7. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
8. Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
9. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
10. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
12. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
14. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
15. Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
16. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).

Tags

Medicina Edição 86 glioblastoma multiforme intravital dois fótons de imagem o modelo animal janela craniana crônica tumores cerebrais neuro-oncologia.