En ortotopisk Glioblastoma Mouse Model Fastholdelse Brain Parenkymalt fysiske begrænsninger og velegnet til Intravital To-foton mikroskopi

Summary

Vi har etableret en kortikal ortotopisk glioblastom model i mus til intravital to-foton mikroskopi, der redegør for de biofysiske begrænsninger normalt på spil under væksten af ​​tumoren. En kronisk glasrude erstatte kraniet over tumor muliggør opfølgning af tumorprogression over tid ved to-foton mikroskopi.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) er den mest aggressive form for hjernesvulster med ingen helbredende behandlinger til rådighed til dato.

Murine modeller af denne patologi stole på injektion af en suspension af gliomaceller i hjernen parenkym efter indsnit i dura-mater. Betragtninger cellerne skal injiceres overfladisk at være tilgængelig for intravital to-foton mikroskopi, overfladiske injektioner undlader at rekapitulere de fysiopatologiske forhold. Faktisk flygter ved injektion tarmkanalen fleste tumorceller nå det ekstra dural rum, hvor de udvider unormalt hurtigt i mangel af mekaniske begrænsninger fra parenkym.

Vores forbedringer består ikke kun i fokalt implantere en gliom sfæroid snarere end at injicere en suspension af gliomaceller i de superficielle lag af hjernebarken, men også i tilstopning injektionsstedet med en tværbundet dextrangel hemi-vulst, som er limet til LYGTding parenkym og forseglet til dura-mater med cyanoacrylat. Tilsammen disse foranstaltninger håndhæve den fysiologiske ekspansion og infiltration af tumorcellerne inde i hjernen parenkym. Kraniotomi blev endeligt lukket med en glasrude cementeret til kraniet til at tillade kronisk billeddannelse over uger i fravær af arvæv udvikling.

Drage fordel af fluorescerende transgene dyr podet med fluorescerende tumorceller vi har vist, at dynamikken i samspillet forekommer mellem gliomceller, neuroner (f.eks Thy1-FFP mus) og vasculature (fremhæves med en intravenøs injektion af et fluorescerende farvestof) kan visualiseres ved intravital to-foton mikroskopi under progression af sygdommen.

Muligheden for at billedet en tumor ved mikroskopisk opløsning i et minimalt kompromitteret cerebral miljø repræsenterer en forbedring af de nuværende GBM dyremodeller, som skulle komme inden for neuro-onkologi og narkotika testning.

Introduction

Glioblastoma multiforme forekommer som den mest aggressive form for hjernesvulst hos voksne med en median overlevelse på 12 måneder og en 5-års overlevelse på 5%. Klinisk forvaltning afhængig kirurgi, strålebehandling og kemoterapi anvendes ofte i kombination. Men effekten af disse behandlinger er fortsat palliativ ^1-3.

Indtil nu er de fleste af neuro-onkologiske undersøgelser beror på teknikker, som kun er i stand til at give et statisk syn og udføres på store grupper af tumorbærende dyrene aflivet på forskellige tidspunkter (se for eksempel ^4,5). Den seneste udvikling af follow-up-metoder baseret på intravital billedbehandling giver studere gliom vækst og samspillet mellem tumorceller og deres patofysiologiske mikromiljø på det samme dyr over tid. Dette baner vejen for eksklusiv stykke af oplysninger, der var så langt uopnåelig ^6. Transgene dyr, der udtrykker fluorescerende tags i celler af interesse kan være brugd til at undersøge specifikke interaktioner mellem tumorceller og fx neuroner i dette papir.

Gennem det seneste årti, har intravital to-foton mikroskopi ⁷ bliver en guldstandard i grundlæggende neuro-onkologiske undersøgelser og prækliniske forsøg ^8,9 for sin evne til at udføre dybe intravital observation af mus hjerne (> 500 um under dura-mater) med mikrometrisk rumlig opløsning ^10. Ved hjælp af intravital to-foton mikroskopi med orthotopical dyremodeller implanteret med en kronisk kranie vindue ^11, er det muligt at følge tumorprogression over tid på den samme mus ^9,12.

En af de store ulemper ved disse tidligere offentliggjorte dyremodeller er imidlertid, at de ikke efterligner de fysiske begrænsninger, der styrer tumorvækst dura-mater ikke er forseglet efter injektion af cellesuspensionen ^9,13,14. Gliomaceller kan lække iextradural rum omdanne en ortotopisk gliom model i en heterotopisk én.

Dyremodellen her består i injektion af en sfæroid af fluorescerende gliomaceller i hjernebarken i en dybde på 200 um efterfulgt af forsegling af dura-mater med en tværbundet dextrangel hemi-perle og histopatologisk kompatibel lim . Tumorvækst er derefter begrænset til hjerneparenkymet der fastholder patofysiologiske fysiske begrænsninger. En kronisk glasrude implanteret over tumoren tillader en nem optisk adgang for intravital to-foton mikroskopi. Brug transgene dyr, der udtrykker fluorescerende tags i celler af interesse, er det muligt at foretage en opfølgning af væksten gliom over tid og til at studere samspillet med dens mikromiljø (her med neuroner og vaskulaturen fremhævet med fluorescerende dextraner).

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med den franske lovgivning og i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskab Rådets direktiv af November 24, 1986 (86/609/EØF) til pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Forskningen på dyr blev godkendt af Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licens D-13-055-21) og godkendt af den etiske komité i Provence Cote d'Azur n ° 14 (Project 87-04.122.012) .

1.. Spheroids Forberedelse

1. Fremstilling af agarose-coatede petriskåle
   1. Bland 1 g agarose med 100 ml cellekulturmedium ikke suppleret med føtalt bovint serum. Brug en mikrobølgeovn (850 watt i 40 sek, derefter 3 x 15 sek røre løsningen i mellem hver mikrobølgeovn session) for at koge den løsning, og for at opløse agarose. Autoklave denne 1% agarose opløsning i 20 minutter ved 120 ° C for at sikre Steri. heden Bemærk: Pas for at opløse agarose før autoklaven protokollen. Inhomogenitet kan kompromittere dannelsen af ​​sfæroiderne.
   2. Når hentet fra autoklaven, hældes 10 ml af 1% agarose-opløsning i 100 x 20 mm petriskåle. Lad Petri-skåle i 20 minutter ved stuetemperatur for at tillade 1% agaroseopløsning at størkne.
   3. Der tilsættes 10 ml PBS over agarose at bevare fugt. Forsegle låget på agarose-coatede petriskåle ved indpakning dem med parafilm at undgå fordampning. Petriskåle kan opbevares i op til 2 måneder ved 4 ° C, hvis korrekt befugtet af PBS lag.
2. Klumpformet kultur
   1. I en 75 ^cm2 kolbe, dyrke gliomceller i deres anbefalede medium som et monolag.
   2. Udskift PBS fra en af ​​de 1% agarose-coatede petriskål med 1,5 ml "konditioneres medium" indsamlet fra kolben indeholdende 2D monolag af gliomacelleliniesek.
   3. Fjern mediet fra kolben indeholdende 2D monolag af gliomaceller.
   4. Forsigtigt skylles monolaget med 10 ml PBS.
   5. Tilsæt 2 ml 0,05% af en trypsin / EDTA-opløsning og inkuberes kolben 4 min ved 37 ° C. Bemærk: Inkubationstiden kan variere i henhold til den cellelinje.
   6. Tilføj 8 ml næringssubstrat at stoppe virkningen af trypsin, skylles forsigtigt cellesuspensionen Bemærk:. Pas på ikke at skylle luft i cellen suspension, da det øger celledød.
   7. Sæt 6 ml af cellesuspensionen i et sterilt hætteglas.
   8. Centrifugér hætteglasset 4 minutter ved 800 rpm.
   9. Fjern supernatanten og forsigtigt suspendere celle sediment i 3 ml dyrkningsmedium.
   10. Seed cellesuspensionen i den fremstillede agarose-coatede petriskål.
   11. Sæt petriskålen ved 37 ° C i en 5% _{CO2-atmosfære} i 2 til 3 dage, indtil sfæroider med ønsket diameter dannes.
2.. Sfæroide og Window Implantation
1. Fremstilling af indsprøjtningssystemet
   1. Rent glaskapillarer (1 mm i diameter) efter sonikering i 70% ethanol i 10 min. Skyl to gange med vand inden placering inde i en inkubator indtil tør.
   2. Træk adskillige rengjorte glaskapillarer med en pipette aftrækker for at forberede en lille bestand.
   3. Bryde spidsen af ​​trukket kapillær ved at skrabe ekstremiteten på et stykke silkepapir for at opnå en skrå ende af den ønskede størrelse, typisk en ydre diameter på 300-350 um og en indre diameter på 250-300 um. Under denne formningsproces, styre diameteren af ​​kapillarrøret ved anvendelse af en makroskop hvis okulær er udstyret med en gradueret Mira.
   4. Slut ikke-affasede ende af kapillarrøret til en 3-vejs manifold hjælp af et stykke plastslange, hvis indre diameter passer den ydre diameter af kapillarrøret.
   5. Brug plast Tubing, forbinde de to andre måder at manifolden til en 25 pi mikroliter sprøjte og en 1 ml sprøjte fyldt med histopatologisk kompatibel mineralolie.
   6. Juster manifold vælgeren for at etablere en sti mellem mikroliter sprøjte og 1 ml sprøjte. Fjern stemplet i mikroliter sprøjte og injiceres mineralolie bagud i mikroliter sprøjte, indtil det siver ud ved at skubbe stemplet i 1 ml sprøjte. Udskift stemplet i mikroliter sprøjte samtidig sørge for ikke at efterlade luftbobler i røret.
   7. Juster manifold vælgeren for at etablere en sti mellem kapillær og 1 ml sprøjte. Fyld kapillarrør med mineralolie, indtil det siver ud fra spidsen samtidig sørge for ikke at efterlade luftbobler i røret.
   8. Juster manifold vælgeren til at etablere en forbindelse mellem mikroliter sprøjte og kapillarrøret. Udvise omkring 10 pi mineralsk olie.
   9. Dyp kapillære spids ind i PBS-opløsningog ved hjælp af måleren af ​​mikroliter sprøjte, suger 5 pi PBS i kapillarrøret. Bemærk, at menisken mellem olie og PBS er klart synlig.
   10. Fastgør kapillarrøret på en 3-akse mikromanipulator montering under operationen makroskop. Dette system vil blive anvendt til at målrette kapillarrøret injektionsstedet under visuel kontrol.
2. Klumpformet implantation
   1. Let bedøve mus ved indånding af Isofluran i en induktion kammer (1,5% i luften i løbet af 1 til 1,5 min.)
   2. Bedøve dyret med en intra-peritoneal injektion af en blanding af ketamin / xylazin (120 mg / kg, 12 mg / kg). Bemærk, at anæstesi reducerer ofte kropstemperaturen af ​​dyret. Det anbefales at fortsætte med kirurgi i et rum ved 26 ° C og for at holde dyret varmt med en underliggende thermocontrolled varmepude.
   3. Anvend øjet salve for at undgå udtørring af øjnene.
   4. Barbere hovedbunden af ​​dyret.
   5. Steddyret i en stereotaktisk ramme under anvendelse øre barer og et mundstykke.
   6. Rens huden med povidon-iod (3% sæbe, derefter 10% opløsning).
   7. Lav en 1 cm lang snit på langs i midten af ​​hovedbunden med en skalpel. Brug saks klippe og fjerne huden over parietale knogler.
   8. Med en skalpel forsigtigt fjerne periost over kraniet. Påfør cyanoacrylat oven på knogle til at frembringe en ru overflade til senere cement vedhæftning.
   9. Bor parietal knogle under en kirurgisk makroskop at generere en kraniotomi på 4 mm i diameter. Generøst tilføje iskold PBS indeholdende penicillin (1.000 U / ml) og Streptomicin (1 mg / ml) under hele proceduren for at undgå opvarmning. Fjern de små knoglerester med pincet og en våd gaze. Vær omhyggelig med at bore mindst 1 mm væk fra parietale kraniet suturer at undgå blødninger.
   10. Tynd knoglen ved grænsen af ​​kraniotomi hvor glasset vil blive forseglet. Målet er at eOATINGMATERIALETS senere plane positionering af glas vindue med maksimal kontaktflade mellem hjernen og glasset. Langsomt fjerne knoglen ved hjælp af en pincet og rengør blottede dura-mater med PBS-opløsning.
   11. Tag en 5 mm runde dækglas, rense det med alkohol og tør det med silkepapir. Forsøger at bruge dækglasset som låg for kraniotomi og bekræfte, at en stor flad hjernens overflade kommer i kontakt med glasset. Hvis det er nødvendigt at fjerne dækglasset yderligere tynde sidebenene. Fortsæt, indtil hjernen kan blive klemt flad, hvis forsigtigt lægge pres på dækglasset en gang på plads.
   12. Rengør igen dækglasset med alkohol, tør det med silkepapir, og gemme det fra hinanden.
   13. Med en 26 gauge nål lave et hul i dura-mater i centrum af kraniotomi endnu undgå store blodkar. Sørg for ikke at beskadige hjernen parenkym, idet formålet med dette trin er blot at åbne dura-mater.
   14. Rengør forsigtigt dura-mater with PBS-opløsning for at fjerne hæmoragisk blod. Dæk med et stykke silkepapir, mens udarbejdelsen af ​​klumpformet injektion.
   15. Med klumpformet indsprøjtningssystem forberedt i trin 2.1, sutte en rund klumpformet montering kapillær indre diameter (ca. 200-250 um) fra petriskålen forberedt i trin 1.2. Klumpformet skulle komme sammen med omtrent 5 ul dyrkningsmedium. Det skal falde ned til spidsen af ​​kapillaritet under dens vægt.
   16. Fjern vådt silkepapir anvendes til at dække kraniotomi og placere dyret under indsprøjtningssystemet.
   17. Sænk indsprøjtning pipette, indtil den rører hul i dura-mater. Derefter sænkes igen ved 250 um. Vent 30 sek.
   18. Injicer langsomt sfæroiden ved hjælp af stemplet i mikroliter sprøjte (2-3 ul) samtidig at pumpe overskydende væske med et tyndt stykke silkepapir ud. Vent 30 sekunder, og derefter forsigtigt løfte indsprøjtning pipetten med 50 mM mod overfladen. Vente igen 30 sek og repeat løftet i trin på 50 pm indtil overfladen. Ventetider undgår udvinding af sfæroidet der ville holde sig til pipette.
   19. Bekræfte tilstedeværelsen af ​​sfæroidet i hjernen ved hjælp af en fluorescens makroskop.
   20. Bland 100-300 um diameter tværbundne dextran gelperler med PBS-opløsning i en petriskål. Vent 1min og fiske nogle hydreret perler. Læg dem på knoglen støder op til kraniotomi.
   21. Under makroskopisk kontrol vælge en kugle med en diameter, der svarer til størrelsen af ​​dura mater-åbning. Skær tværbundet dextrangel perle i to halvdele ved hjælp af pincet.
   22. Forsigtigt sætte en tværbundet dextrangel hemi-perle i injektion hullet med den konvekse flade mod klumpformet. Pas på ikke at fjerne klumpformet og tryk forsigtigt nedad, indtil den grænse konkave kommer i kontakt med det omgivende dura-mater.
   23. Put en dråbe cyanoacrylat lim på et objektglas; dyppe spidsen af ​​en tandstik ned i drop for at tage en lille mængde lim. Hurtigt forsegle kanterne af tværbundet dextrangel hemi-perle til den tilstødende dura-mater ved stansning lim omkring. Vær omhyggelig med at udføre hurtige og præcise bevægelser for at undgå at lime cross-linked dextrangel hemi-perle til tandstikker. Undgå overskud af lim, der kan sprede sig og hindrer hvis ikke forhindre billeddannelse, når tørret. Vent 2 minutter til limen tørre og derefter rense kraniotomi og den omgivende knogle med PBS-løsning.
3. Vindue implantation
   1. Sæt diameter 5 mm runde dækglas over kraniotomi (se 2.2.12). Kanterne af dækglasset skal være på den indsnævrede kraniet på ydersiden af ​​kraniotomi. Dækglasset skal være i kontakt med dura mater-og tyndet knogle på kanterne. Det er meget vigtigt at have en direkte kontakt mellem dura-mater og dækglas ellers arvæv kan udvikle og hindre optisk klarhed.
   2. Med en væv, absorbere PBS på the dækglas kanter, så denne løsning ikke fuldt ud dækker kraniotomi, når de anvender en lille tryk i midten af ​​dækglasset. Dette vil sikre, at ben, glas og hjerne er limet sammen på den side af området af interesse.
   3. Oprethold et lille tryk på midten af ​​dækglasset med en pincet, mens forsigtigt anvende cyanoacrylat ved grænsen mellem knoglen og dækglasset. Limen spontant vil spredes, indtil grænsefladen med PBS-opløsning. Løsning vil fungere som en barriere givet hydrofobiciteten af ​​lim. Forsegling bør være effektive i mindre end et minut, men tage en ekstrem omhu for ikke at flytte dækglasset, indtil den er fast. Dette ville ellers resultere i cyanoacrylat lækage på dura-mater dermed føre til en fejl i operationen.
   4. I tilfælde lim ville have spredt sig på toppen af ​​glasset, skal det fjernes ved hjælp af en mikro-skalpelblad ved at gøre spiral bevægelser, da det ellers kan reducere optisk klarhed. Pas på ikke at bryde dækglas During proceduren på grund af for stort tryk.
   5. Konsolidere glasset fiksering ved at anvende dentalcement på kanterne af dækglasset mod den tilstødende kraniet. Sørg for at dække hele udsatte kraniet indtil hovedbunden. Ved hjælp af ekstra cement, opbygge sidevægge omkring dækglasset at skabe den pulje der kræves for nedsænkning af målet. Dental cement vil hærde i mindre end 10 min.

3.. Postoperativ pleje og forberedelse til Imaging

1. Postoperativ pleje
   1. Fjern musen fra stereotaktisk ramme, injicere Dexamethazon (0,2 mg / kg) og Rimadyl (5 mg / kg) sc over bækkenregionen og lagde hende i et bur med en varm væv-reden.
   2. Overvåg dyret indtil virkningerne af anæstesi er forsvundet. I almindelighed 2 til 3 timer efter kirurgi, mus er fuldt mobile. Sørg for, at dyret har en nem adgang til mad og vand. Giv dyret med agarose indeholdende glucose (agarose3%, glucose 3%).
   3. Overvåg dyrets vægt hver dag og injicere Dexamethazon (0,2 mg / kg) og Rimadyl (5 mg / kg) sc første 10d efter operationen. Af etiske overvejelser, aflive mus når tab overstiger 15% af sin oprindelige vægt. Intrakranielt tryk stiger med tumorstørrelse fører til motoriske svækkelser for dyret. Dette er tumor cellelinie afhængige og forekommer ved forskellige forsinkelser efter kirurgi. Der skal udvises særlig omhu for at karakterisere slutpunktet for forsøget med den cellelinje anvendes.
2. Forberedelse til billedbehandling
   1. Let bedøve mus ved indånding af Isofluran i en induktion kammer (1,5% i luft for 1 til 1,5 min.)
   2. Bedøve dyret med en intra-peritoneal injektion af en blanding af ketamin / xylazin (100 mg / kg, 10 mg / kg). En sådan anæstesi typisk giver 45 min observation. For at udføre længere billeddannelse sessioner, er musen placeret under kontinuerlig inhalation af isofluran hosluft (0,25-0,75%).
   3. Anvend øjet salve for at undgå udtørring af øjnene.
   4. Sæt dyret på en stereotaktisk ramme og blokere kraniet med earbars.
   5. At visualisere blodkar, kan et fluorescerende farvestof injiceres intravenøst.
   6. Hvis vinduet virker snavset, kan den rengøres ved forsigtigt at fjerne resterne med en tynd klinge og hjørnet af en væv. Brug ikke alkohol til at rense vinduet, som det ikke altid er foreneligt med dentalcement, og det kan afkøle hjernen under vinduet.

Representative Results

Når den kirurgiske protokol udføres (figur 1), kan dyr observeres ved hjælp af fluorescensmikroskopi over uger indtil aflivning. En inflammatorisk reaktion kan observeres efter operationen, som forsvinder inden for en eller to uger. Tumorvækst kan observeres ved forskellige mikroskopi teknikker, herunder fluorescerende makroskopi og to-foton mikroskopi (figur 2). Billederne afbildet her blev realiseret på et fluorescens makroskop og en to-foton mikroskop koblet til en femtosekund pulserende infrarødt afstemmelige laser og hjem-modificeret til at tillade dyr positionering under 20X nedsænkning i vand mål (1.0NA).

Den tumorudvikling blev estimeret over tid ved hjælp af en fluorescens makroskop kombinerer skrå belysning til lysfelt reflektans billedbehandling og epifluorescens emission (figur 2A-2C). Tærskelværdiansættelse af fluorescensen giver let adgang til tumorområdet mens superficial vaskulatur frigøre som mørke strukturer ud af den hvide baggrund af det synlige lys billede. På den anden side intravital to-foton mikroskopi giver z-sektionering og retvinklede rekonstruktioner af store synsfelter med subcellulær opløsning (se dendritter i figur 2D). Brug transgene dyr, der udtrykker fluorescerende proteiner i celler af interesse (f.eks Thy1-FFP mus, der udtrykker Cyan fluorescerende protein i neuroner, grøn pseudo-farve i figur 2D) er det muligt at observere tumorprogression i sin neuronal mikro-miljø. Dog skal det bemærkes, at tumor celle tæthed kan begrænse foton indtrængningsdybde samt den udsendte foton afsløring på grund af øget diffusion. Det ses tydeligt i figur 2D som den rumlige opløsning begynder at falde på 200 um under dura frembringelser i tumoren, men ikke i den sunde hjerneparenkymet. Desuden anden harmonisk generation signal opstår from organiserede mønstre af ikke-centrosymetric molekyler såsom type I og III kollagen giver en underskrift af dura-mater (cyan pseudo-farve i figur 2D og pile). Det skal bemærkes, at med vores kirurgiske protokol, tumoren vokser under dura-mater i hjernen parenkym, hvor udviklingen er underlagt fysiske begrænsninger i hjernen. Lukningen af ​​dura-mater med en tværbundet dextrangel hemi-vulst forhindrer udslip af gliomaceller i extradural rum.

Når efterfulgt af intravital to-foton mikroskopi tumor progression mellem forskellige tidspunkter kan sammenlignes på cellulær opløsning. Imaging samme område på D16 og D27 post-kirurgi (figur 3A) fandt vi nogle blodkar som den ene fremhævet med pile, der var stabil over en periode på 11 dage; på den anden side tumor foran klart infiltreret ind i sunde parenkym i samme periode. At vurdere tumor progression, dens margin observeret ved D27 blev skitseret med en gul stiplet linje og lagt oven på billedet taget ved D16. A 520 um skift af forkanten blev observeret konsekvent med den rapporterede proliferative profil GL261 gliom model ^15.. Mønstrene af vaskulære netværk inde i svulsten var meget anderledes på D16 og D27 indikerer, at en betydelig vaskulær remodellering forekommer i patologiske områder (figur 3a). På randen af ​​tumoren, fandt vi også tilfælde af gliomaceller adskillelse fra tumorkernen som forventet fra en invasiv tumor. Den mikroskopiske opløsning af vores billeder, viste ikke blot, at disse celler udsender cytoplasmatiske fremspring at fornemme miljøet, men også at de kan bruge blodkar som en matrix for deres progression (pilespidser og z-genopbygning i figur 3B). To-foton mikroskopi således mulighed for at studere cellulære interaktioner i en virkelig fysiologisk kontekst. Brug transgene dyr, hvor hver celle population af interesseidentificeret ved sin egen fluorescerende reporter bliver det muligt at se, om der findes fysiske samspil mellem tumorceller og deres miljø som centrale regulatorer af sygdomsprogression (figur 3B, højre).

Fig. 1. Oversigt over operationen. Kraniotomi udføres på venstre parietal knogle (A). Grænserne for venstre parietal knogle er skitseret med en stiplet linje og den fjernede del fyldes i gul (B). Når kraniotomi udføres, parietalcortex eksponerede (C), er området for indsprøjtning af klumpformet valgte at tage sig for at undgå store blodkar (pil i D) og en 26 gauge nål bruges til at åbne dura-mater ( pil i E). Sfæroiden erinjiceres og hullet i dura-mater er tilstoppet af et tværbundet dextrangel hemi-perle forseglet med cyanoacrylat lim (pil i F). Et dækglas er limet til benet og samtidig holde kontakt med hjernen. Dækglasset er yderligere cementeret til den udsatte kraniet for at sikre langsigtet solid fastgørelse af kranie vindue for kroniske observationer (GI). Hele protokollen er kortvarigt skematiseret i J. Klik her for at se større billede.

Figur 2. Tumorvækst begrænset til hjerneparenkymet og kan overvåges over tid. AC. Tumorvækst (GL261 cellelinje, der udtrykker DsRed2) er observeret ved macroscopy på dagen for kirurgi (DO, A) og på dag 21 (B) og 27 (C). Pilespidsen i C fremhæver en dråbe af dental cement, der ikke blev fjernet under trin 2.3.5. D. Ortogonale rekonstruktioner opnået fra en 3 x 3 felt erhvervet 0-300 um under dura-mater i en Thy1-CFP mus bærer en GL261 svulsten ved to-foton mikroskopi ved D20 post-kirurgi. Tumor (rød), dura-mater observeret af anden-harmonisk generation (pile, cyan) og neuroner (grøn). Bemærk, at tumoren vokser under dura-mater i hjernen parenkym. Klik her for at se større billede.

Figur 3. Vascular ombygninger og tumorceller invasion kan overvåges over tid med cellulær rumlig opløsning ved intravital to-foton mikroskopi. A. GL261 tumor (rød) observeret ved D16 og D27 post-operation efter en intravenøs injektion af Cascade-blå dextran 70 kDa at fremhæve blodkar. Punkteret linje: tumor margen på D27; pile: eksempel af blodkar, der kan bruges som pejlemærker for at lokalisere det samme område på D16 og D27 B.. Individuelle tumorceller (rød) invadere sund hjerne parenkym (neuroner, grøn) ved hjælp af blodkar som en matrix til invasion (pilespidser). Billeder blev taget på en dybde på 100 til 150 pm under dura frembringelser. Stiplede linje:. Region, hvor den retvinklede genopbygning afbildet i bunden center panel blev realiseret Klik her for at se større billede.

Discussion

Denne fremgangsmåde giver mulighed for brug af optiske billeddiagnostiske metoder til at overvåge over dage og uger væksten af ​​en orthotopisk implanteret gliom. Det samme dyr kan efterfølgende udsættes for stort set alle hjernen afbildningsmodalitet i løbet af patologien; endnu to-foton mikroskopi specifik forberedelse giver en unik mulighed for at opnå subcellulært opløsning inde i hjernen på levende dyr. Vores protokol har den fordel, at håndhæve tumorvæksten i cerebral parenchym end ekstra durally som det sker, hvis gliomaceller kan forlade det centrale nervesystem gennem den beskadigede dura. I fravær af fysiske begrænsninger, der udøves af hjernen miljø, kan tumorcelle faktisk prolifererer hurtigere, da de ikke behøver at infiltrere parenkym ^16. Tidligere offentliggjorte metoder forsøgte ikke at forsegle dura mater efter podning, som var så meget mere problematisk end de injicerede suspension af celler i stedet spheroids^9,13,14. Suspensioner af celler er faktisk umuligt at anvende focally som individuelle celler systematisk udsås langs indsprøjtning tarmkanalen, når man hæver pipetten fra dybden til dura-mater.

Den nuværende protokol kan anvendes på forskellige musestammer, herunder transgene og immunsupprimerede dyr. Forskellige gliom cellelinjer kan blive podet og visualiseres, herunder celler direkte afledt af humane biopsier, så længe de er transficeret til stabilt udtrykke en fluorescerende reporter forudgående podning. Kirurgisk protokol kan typisk udføres i 1 time, og kan hurtigt opnås kohorter af dyr. Denne fremgangsmåde kan således anvendes til at studere vaskulær remodellering, virkningerne af farmakologiske behandlinger på angiogenese og tumorvækst, samt immunceller i tumoren. Efter behov gliom cellemigration og dynamiske interaktioner mellem gliomaceller og mikromiljø kan observeres i realtid for flere Hours.

Som imaging kan gøres over dybder på 500 um, er det muligt at dække det meste af tumor volumen oprindeligt implanteret 200 um under dura-mater. Skal træffes for at sikre maksimal billedbehandling dybde særlig pleje under operationen for at skabe fysisk kontakt mellem dura-mater og dækglas. Dette reducerer faktisk dannelsen af ​​arvæv, der ellers ville kompromittere optisk klarhed. Skal endvidere bemærkes, Absolute sterilitet kirurgisk miljø til at begrænse post-kirurgi betændelse, der transient slører vinduet. Vi alligevel råde til vente 15 hverdage mellem kirurgi og den første observation session for at opnå optimale billeddiagnostiske forhold. Derefter blev vindue fundet at forblive klar op til et år efter operationen på skinopererede dyr, der undergik hele protokol, medmindre injektion af tumor klumpformet.

Konklusionen er, at protokollen er beskrevet her er en forbedring af den eksisterende orthotopic gliom musemodel dedikeret til kronisk intravital to-foton mikroskopi. Den overfladiske injektion af en tumor klumpformet, tilstopning af injektionen spor med en tværbundet dextrangel hemi-perle og forsegling af dura-mater håndhæve tumor udvikling i hjernen miljø, der virkelig redegør for de fysiske begrænsninger, der normalt gælder for sygdomsprogression. Ikke kun denne metode vil tjene grundlæggende undersøgelser af gliom patofysiologi, men det vil også forbedre relevansen af ​​farmakologiske resultater i prækliniske forsøg.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker varmt Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber og A. Jaouen for nyttige drøftelser; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, personale af dyret facilitet på IBDML og personalet i PicSIL imaging platform på IBDML for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) til GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) til FD ved stipendier fra Fédération de la Recherche Médicale og Cancéropole PACA til CR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drill	Dremel (Germany)	398	any high quality surgical bone drill would suffice
Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)	World Precision Instruments (USA)	501860 (#1/4)	also sold by Harvard Apparatus
Tissue scissors	World Precision Instruments (USA)	14395
Dumont tweezers M5S	World Precision Instruments (USA)	501764
Dental cement	GACD (USA)	12-565 & 12-568
Cyanoacrylate	Eleco-EFD (France)	Cyanolit 201
Glass capillaries without filament	Clark Electromedical Instruments (UK)	GC100-15
Microliter syringe (25 µl)	Hamilton (USA)	702
Micromanipulator	World Precision Instruments (USA)	Kite-R
T derivation (3-way stopcock - Luer lock)	World Precision Instruments (USA)	14035-10
Stereotactic frame (mouse adaptor)	World Precision Instruments (USA)	502063
Glass coverslips	Warner Instruments (USA)	CS-5R (64-0700)
Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads	Available from various suppliers including Sigma (Germany)
Eye ointment	TVM (France)	Ocry-gel
Fluorescence macroscope	Leica MZFLIII (Germany)		also sold by other companies
Two-photon microscope	Zeiss LSM 7MP (Germany)		also sold by other companies (Nikon, …)
Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï)	Spectra Physics (USA)		also sold by other companies

References

1. DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
2. Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
3. Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
4. Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
5. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
6. Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
7. Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
8. Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
9. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
10. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
12. Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
13. Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
14. Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
15. Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
16. Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).

Tags

Medicine glioblastom multiforme intravital to-foton billedbehandling dyremodel kronisk kraniel vindue hjernetumorer neuro-onkologi.