Summary
We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) is de meest agressieve vorm van hersentumoren zonder curatieve behandelingen beschikbaar tot op heden.
Murine modellen van deze pathologie vertrouwen op de injectie van een suspensie van glioma cellen in het hersenparenchym na incisie van de dura mater. Dat de cellen te oppervlakkig worden geïnjecteerd toegankelijk intravitaal twee-foton microscopie zijn, oppervlakkige injecties niet aan de fysiopathologische omstandigheden recapituleren. Inderdaad, het ontsnappen door de injectie-darmkanaal meest tumorcellen bereikt de extra-durale ruimte waar ze uitbreiden abnormaal snelle in afwezigheid van mechanische beperkingen van het parenchym.
De verbeteringen omvatten niet alleen focaal implanteren glioom sferoïde dan injecteren van een suspensie van glioma cellen in de oppervlakkige lagen van de cerebrale cortex, maar ook verstopping van de injectieplaats met een verknoopte dextran-gel hemi kraal die is vastgelijmd aan het surrounding parenchym en verzegeld tot dura-mater met cyanoacrylaat. Al met al deze maatregelen af te dwingen van de fysiologische uitbreiding en infiltratie van de tumorcellen in de hersenen parenchym. Craniotomie werd uiteindelijk afgesloten met een glazen venster gecementeerd aan de schedel om chronische beeldvorming gedurende weken staan in afwezigheid van littekenweefsel ontwikkeling.
Gebruikmakend van TL geënt met fluorescerende tumorcellen hebben we aangetoond dat de dynamiek van interacties die tussen glioma cellen, neuronen (bijv. Thy1-GVB muizen) en bloedvaten (gemarkeerd door een intraveneuze injectie van een fluorescente kleurstof) kan worden gevisualiseerd door intravitale transgene dieren twee-foton microscopie tijdens de progressie van de ziekte.
De mogelijkheid om een beeld van de tumor bij microscopisch resolutie in een minimaal aangetast cerebrale omgeving betekent een verbetering van de huidige GBM diermodellen die het gebied van neuro-oncologie en drugstesten moeten profiteren.
Introduction
Glioblastoma multiforme verschijnt als de meest agressieve vorm van hersentumoren bij volwassenen met een mediane overleving van 12 maanden en een 5-jaar overleving tarief van 5%. Klinische beheer voert chirurgie, radiotherapie en chemotherapie vaak in combinatie. Echter, de effecten van deze behandelingen blijven palliatieve 1-3.
Tot nu zijn de meeste van neuro-oncologie onderzoeken afhankelijk technieken die alleen in staat om een statische weergave verschaffen en uitgevoerd op grote cohorten van tumordragende dieren gedood op verschillende tijdstippen (zie bijvoorbeeld 4,5). De recente ontwikkeling van follow-up methoden op basis intravitale beeldvorming kan bestuderen groei glioom en de interacties tussen tumorcellen en hun pathofysiologische micromilieu op hetzelfde dier tijd. Dit opent de weg naar exclusieve stukje informatie dat tot nu toe onbereikbaar 6 was. Transgene dieren uiten fluorescerende tags in cellen van belang kan gebruik wordend om specifieke interacties tussen tumorcellen en bijvoorbeeld neuronen in dit document bestuderen.
In het afgelopen decennium, heeft intravitale twee-foton microscopie 7 uitgegroeid tot een gouden standaard in fundamentele neuro-oncologie onderzoek en preklinische proeven 8,9 voor haar vermogen om diep intravitale observatie van de hersenen van muizen te voeren (> 500 micrometer onder de dura-mater) met een micrometrisch ruimtelijke resolutie 10. Met intravitaal twee-foton microscopie met orthotopical diermodellen geïmplanteerd met een chronische craniale venster 11 is het mogelijk om de tumor progressie in de tijd op dezelfde muis 9,12 volgen.
Een van de belangrijkste nadelen van deze eerder gepubliceerd diermodellen is echter dat ze niet de fysieke beperkingen die tumorgroei regelen de dura mater niet is afgedicht na de injectie van de celsuspensie 9,13,14 nabootsen. Glioomcellen kunnen lekken in deextradurale ruimte transformeren van een orthotopic glioma model in een heterotopische een.
Het diermodel hier gepresenteerde bestaat uit de injectie van een sferoïde fluorescerende glioma cellen in de cerebrale cortex op een diepte van 200 urn, gevolgd door het afdichten van de dura mater met een verknoopte dextran-gel hemi parel en histo-compatibel lijm . De tumorgroei wordt dan beperkt tot het hersenparenchym dat pathofysiologische fysieke beperkingen stelt. Een chronische lood raam boven de tumor geïmplanteerd maakt een eenvoudige optische toegang voor intravitale twee-foton microscopie. Met behulp van transgene dieren uiten fluorescerende tags in cellen van belang is het mogelijk om een follow-up van de glioma groei uit te voeren in de tijd en om de interactie te bestuderen met zijn micro-omgeving (hier met neuronen en vaatstelsel gemarkeerd met fluorescerende dextranen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Franse wetgeving en in overeenstemming met de richtlijn Europese Gemeenschap van de Raad van 24 november 1986 (86/609/EEG) voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Het onderzoek op dieren is door de Direction Departementale des Services Veterinaires des Bouches-du-Rhône (rijbewijs D-13-055-21) en door de ethische commissie van de Provence Côte d'Azur n ° 14 (Project 87-04122012) goedgekeurd .
1. Sferoïden Bereiding
- Bereiding van de agarose gecoate petrischalen
- Meng 1 g agarose met 100 ml celkweekmedium niet aangevuld met foetaal runderserum. Gebruik een magnetron (850 Watt gedurende 40 seconden, dan 3 x 15 seconden; roer de oplossing tussen elke magnetron sessie) om de oplossing te koken en volledig op te lossen de agarose. Autoclaaf dit 1% agarose-oplossing gedurende 20 min bij 120 ° C te steri verzekeren. teit Opmerking: zorg dat je volledig op te lossen de agarose voordat de autoclaaf protocol. Inhomogeniteit kan de vorming van bolvormige deeltjes in gevaar brengen.
- Eenmaal opgehaald uit de autoclaaf, giet 10 ml van de 1% agarose opgelost in 100 x 20 mm petrischalen. Laat de Petrischalen 20 minuten bij kamertemperatuur om de 1% agarose-oplossing stollen.
- Voeg 10 ml PBS boven de agarose vochtigheidsgraad te handhaven. Sluit de deksel van de agarose gecoate petrischalen door omwikkelen met parafilm verdamping plaatsvindt. Petrischaaltjes kan worden opgeslagen voor maximaal 2 maanden bij 4 ° C indien goed bevochtigd door de PBS laag.
- Spheroïde cultuur
- In een 75 cm 2 kolf, de cultuur van de glioma cellen in hun aanbevolen medium als een monolaag.
- Vervang de PBS uit een van de 1%-agarose gecoate petrischaal met 1,5 ml "geconditioneerd medium" vanuit de kolf die de 2D monolaag van glioomcellijnens.
- Verwijder het medium uit de kolf die de 2D monolaag van glioma cellen.
- Voorzichtig afspoelen de monolaag met 10 ml PBS.
- Voeg 2 ml van 0,05% van trypsine / EDTA-oplossing en incubeer de kolf 4 minuten bij 37 ° C. Opmerking: De incubatietijd kan variëren afhankelijk van de gebruikte cellijn.
- Voeg 8 ml kweekmedium om de actie van trypsine te stoppen, voorzichtig spoelen van de celsuspensie. Opmerking: Zorg dat er geen lucht spoelen in de cel suspensie als het verhoogt celdood.
- Put 6 ml van de celsuspensie in een steriele flacon.
- Centrifugeer het buisje 4 min bij 800 rpm.
- Verwijder het supernatant en voorzichtig schorsen celsediment in 3 ml kweekmedium.
- Zaad van de celsuspensie in de voorbereide-agarose gecoate petrischaal.
- Plaats de petrischaal bij 37 ° C in een 5% CO2 atmosfeer gedurende 2 tot 3 dagen tot sferoïden van gewenste diameter worden gevormd.
2. Sferoïde en Window Implantatie - Voorbereiding van het inspuitsysteem
- Schone glazen capillairen (diameter 1 mm) door sonicatie in 70% ethanol gedurende 10 minuten. Spoel twee keer met water voordat plaatsing in een couveuse tot het droog is.
- Trek meerdere gereinigd glas capillairen met een pipet trekker om een kleine voorraad bereiden.
- Breek het uiteinde van de capillair getrokken door krabben het uiteinde een stukje tissuepapier een afgeschuinde uiteinde van de gewenste grootte te verkrijgen: typisch een uitwendige diameter van 300-350 urn en een inwendige diameter van 250-300 urn. Tijdens vormgevingsproces, de controle van de diameter van het capillair met een macroscoop waarvan oculair is voorzien van een gegradueerde mira.
- Sluit de niet-afgeschuinde uiteinde van de capillair een 3 weg verdeelstuk met een stuk plastic buis waarvan binnendiameter past de buitendiameter van het capillair.
- Met behulp van plastic Tubing, sluit de twee andere manieren van het spruitstuk naar een 25 ui microliter injectiespuit en een 1 ml injectiespuit geladen met histo-compatibele minerale olie.
- Stel het spruitstuk selector om een route tussen de microliter spuit en de 1 ml spuit vast. Verwijderen de zuiger van de microliter injectiespuit en injecteer minerale olie naar achteren in de microliter spuit totdat hij lekt door het indrukken van de zuiger van de 1 ml spuit. Vervang de zuiger van de microliter spuit terwijl de zorg niet om luchtbellen te laten in de buis.
- Stel het spruitstuk selector om een route tussen de capillaire en de 1 ml spuit vast. Vul het capillair met minerale olie totdat hij lekt uit de punt, terwijl de zorg luchtbellen niet te verlaten in de buis.
- Stel het verdeelstuk selector een verbinding tussen microliter injectiespuit en de capillaire stellen. Verdrijven ongeveer 10 pl minerale olie.
- Dompel de capillaire tip in PBS-oplossingen het gebruik van de meter van de microliter spuit, zuigen in 5 pl PBS in het capillair. Merk op dat de meniscus tussen olie en PBS duidelijk zichtbaar.
- Bevestig de capillaire op een 3-as micromanipulator montage onder de operatie macroscoop. Dit systeem wordt gebruikt om de capillaire richten op de injectieplaats onder visuele controle.
- Spheroïde implantatie
- Licht verdoven de muis door inademing van isofluraan in een inductie kamer (1,5% in lucht gedurende 1 tot 1,5 min).
- Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine / xylazine (120 mg / kg, 12 mg / kg). Let anesthesie vermindert vaak de lichaamstemperatuur van het dier. Aanbevolen doorgaan met chirurgie in een kamer bij 26 ° C en de dieren warm houden met een onderliggende thermocontrolled verwarmingskussen.
- Solliciteer oogzalf om uitdrogen van de ogen te vermijden.
- Scheer de hoofdhuid van het dier.
- Plaatshet dier in een stereotactische frame met behulp van oor bars en een mondstuk.
- Reinig de huid met povidonjood (3% zeep, vervolgens 10% oplossing).
- Voeg een 1 cm lange insnijding in lengterichting in het midden van de hoofdhuid met een scalpel. Met een schaar knippen en verwijder de huid boven de pariëtale botten.
- Met een scalpel verwijder voorzichtig het beenvlies boven de schedel. Strooi royaal cyanoacrylaat bovenop het bot een ruw oppervlak voor later cement hechting genereren.
- Boor de pariëtale bot onder een chirurgische macroscoop een craniotomie van 4 mm diameter genereren. Royaal add ijskoude PBS bevattende penicilline (1000 U / ml) en Streptomicin (1 mg / ml) gedurende de gehele procedure verwarming te voorkomen. Verwijder de kleine botfragmenten met een pincet en een nat steriel gaasje. Zorg ervoor dat ten minste 1 mm boor weg van pariëtale schedel hechtingen om bloedingen te voorkomen.
- Dunne het bot aan de rand van de craniotomie waar het glasraam worden verzegeld. Doel is om eNSure latere vlakke ligging van het raam met maximaal contactvlak tussen de hersenen en het glas. Het bot Verwijder langzaam met behulp van een tang en reinig de blootgelegde dura-mater met de PBS-oplossing.
- Neem een 5 mm diameter ronde glazen dekglaasje schoon met alcohol en droog het met een papieren zakdoekje. Probeer het dekglaasje als een deksel voor de craniotomie en bevestigen dat een groot vlak oppervlak van de hersenen in aanraking komt met het glas. Indien nodig verwijdert u de dekglaasje verder dun de kant botten. Overgaan tot de hersenen kan krijgen platgedrukt als voorzichtig druk uit te oefenen op het dekglaasje eenmaal in de plaats.
- Reinig opnieuw het dekglaasje met alcohol, droog het met een papieren zakdoekje, en sla het uit elkaar.
- Met een 26 gauge naald een gat in de dura mater in het midden van de craniotomie Nog belangrijkste bloedvaten voorkomen. Zorg ervoor dat de hersenen parenchym niet beschadigt als het doel van deze stap is alleen maar om de dura-mater openen.
- Reinig de dura-mater with PBS oplossing voor hemorragische bloed te verwijderen. Dek af met een stukje weefsel papier, terwijl de voorbereiding van de bolvormige injectie.
- Met de bolvormige injectiesysteem bereid in stap 2.1, zuigen een ronde bolvormige montage van de capillaire binnendiameter (ongeveer 200-250 micrometer) van de petrischaal bereid in stap 1.2. Sferoïde moeten komen samen met ongeveer 5 ul kweekmedium. Het moet vallen op het uiteinde van de capillaire onder zijn gewicht.
- Verwijder het vochtige doekje papier gebruikt om de craniotomie bedekken en plaats het dier onder het injectiesysteem.
- Laat de injectie pipet tot tegen het gat in de dura mater. Dan weer omlaag draaien met 250 micrometer. Wacht 30 sec.
- Injecteer langzaam de bolvormige behulp van de zuiger van de microliter injectiespuit (2-3 pi) tijdens het pompen het overtollige vloeistof met een dun stukje vloeipapier. Wacht 30 sec en dan til de injectie pipet met 50 micrometer naar de oppervlakte. Wacht nogmaals 30 sec en Repeat het tillen in stappen van 50 pm tot het oppervlak. Wachttijden vermijdt extractie van de bolvormige die zou vasthouden aan de pipet.
- Bevestigen de aanwezigheid van de bolvormige in de hersenen met behulp van een fluorescentie macroscoop.
- Meng 100-300 urn diameter verknoopte dextran gel kralen met PBS oplossing in een petrischaal. Wacht 1 minuut en vis sommige gehydrateerd kralen. Plaats ze op het bot naast de craniotomie.
- Onder macroscopisch control, kies een kraal met een diameter gelijk aan de grootte van de dura mater-opening. Snijd de verknoopte dextran gelkorrel in twee helften behulp van een tang.
- Zet zachtjes een verknoopt dextran gel hemi-kraal in de injectie gat met de bolle gezicht naar de spheroïde. Zorg ervoor dat u de bolvormige en druk voorzichtig naar beneden te verwijderen totdat de grens van de concave in contact komen met het omringende dura-mater.
- Doe een druppel cyanoacrylaat lijm op een glasplaatje; dip de punt van een tandenstoker in het drop een kleine hoeveelheid lijm nemen. Snel afdichting van de randen van de verknoopte dextran gel hemi-kraal aan de aangrenzende dura mater door stansen lijm over. Zorg snelle en nauwkeurige bewegingen uitvoeren om te voorkomen lijmen van de verknoopte dextran gel hemi-kraal aan de tandenstoker. Vermijd overtollige lijm die kan verspreiden en belemmeren zo niet beeldvorming voorkomen eenmaal gedroogd. Wacht 2 min voor de lijm drogen en reinigen van de craniotomie en het omringende bot met PBS oplossing.
- Window implantatie
- Zet de 5 mm diameter ronde dekglaasje boven de craniotomie (zie 2.2.12). De randen van het dekglaasje moet de verdunde schedel op de buitenzijde van de craniotomie. Het dekglaasje moet in contact met de dura mater en verdund bot aan de randen. Het is zeer belangrijk om een direct contact tussen de dura mater en de glazen dekglaasje hebben anders littekenweefsel ontstaan en belemmeren optische helderheid.
- Met een tissue, absorberen de PBS op the dekglaasje randen zodat oplossing niet dekken de craniotomie bij de toepassing van een kleine druk in het centrum van het dekglaasje. Dit zorgt ervoor dat bot, glas en hersenen elkaar gelijmd aan de zijde van het gebied van belang.
- Handhaaf een kleine druk op het centrum van het dekglaasje met een tang onder zacht toepassing cyanoacrylaat op de grens tussen het bot en het dekglaasje. De lijm zal spontaan uitbreiden totdat de interface met PBS-oplossing. Oplossing zal fungeren als een barrière gezien de hydrofobe eigenschappen van de lijm. Sealing moeten doeltreffend zijn in minder dan een minuut, maar neem een uiterste zorg niet aan het dekglaasje bewegen totdat het probleem is opgelost. Dit zou anders leiden tot cyanoacrylaat lekkage op de dura-mater dus leiden tot een mislukking van de operatie.
- Mocht lijm hebben verspreid bovenop het glas verwijderen met behulp van een micro-scalpel doende spiraalvormige bewegingen anders optische helderheid kan verminderen. Kijk uit het glas dekglaasje Durin niet te brekeng van de procedure als gevolg van overmatige druk.
- Consolidatie van de glazen fixatie door toepassing tandcement aan de randen van het dekglaasje naar de aangrenzende schedel. Zorg ervoor dat u het hele blootgestelde schedel te dekken tot de hoofdhuid. Met behulp van extra cement, bouwen zijwanden rond de dekglaasje aan het zwembad die nodig zijn voor de onderdompeling van het doel te creëren. De tandcement genezen in minder dan 10 minuten.
- Post-operatieve zorg
- Verwijder de muis uit de stereotactische frame, injecteren Dexamethazon (0,2 mg / kg) en Rimadyl (5 mg / kg) sc over de bekken regio's en leg ze in een kooi met een warm weefsel-nest.
- Bewaak het dier totdat de effecten van narcose zijn verdwenen. In het algemeen 2 tot 3 uur na de operatie, muizen volledig mobiel. Zorg ervoor dat het dier heeft een gemakkelijke toegang tot voedsel en water. Zorg voor het dier met agarose bevattende glucose (agarose3% 3% glucose).
- Controleer het gewicht dier elke dag en injecteer Dexamethazon (0,2 mg / kg) en Rimadyl (5 mg / kg) sc voor de eerste 10d na de operatie. Om ethische overwegingen, euthanaseren de muizen wanneer verliezen meer bedragen dan 15% van zijn oorspronkelijke gewicht. Intracraniële druk toeneemt met de grootte van de tumor leidt tot motorische stoornissen voor het dier. Dit is tumorcellijn afhankelijk en gebeurt op verschillende vertragingen na de operatie. Speciale aandacht moet worden genomen om het eindpunt van het experiment met de gebruikte cellijn karakteriseren.
- Voorbereiding voor de beeldvorming
- Licht verdoven de muis door inademing van isofluraan in een inductie kamer (1,5% in lucht gedurende 1 tot 1,5 min).
- Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine / xylazine (100 mg / kg, 10 mg / kg). Zo'n verdoving maakt meestal 45 min van de waarneming. Om langer beeldvorming sessies uit te voeren, wordt de muis onder voortdurende inademing van Isoflurane geplaatst inlucht (0,25-0,75%).
- Solliciteer oogzalf om uitdrogen van de ogen te vermijden.
- Leg het dier op een stereotactische frame en blokkeren de schedel met de earbars.
- Om de bloedvaten te visualiseren, kan een fluorescerende kleurstof intraveneus worden geïnjecteerd.
- Als het venster vuil kan worden gereinigd door voorzichtig verwijderen van vuil met een dun blad en de hoek van een weefsel. Gebruik alcohol om de ruit te reinigen omdat het niet altijd compatibel met tandcement en kan de hersenen afkoelen onder het venster.
3. Post-operatieve Zorg en voorbereiding voor Imaging
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer de chirurgische protocol uitgevoerd (figuur 1) kunnen dieren worden genomen door middel van fluorescentiemicroscopie dan weken tot opoffering. Een ontstekingsreactie kan worden waargenomen na de operatie die verdwijnt binnen een of twee weken. De tumorgroei kan worden waargenomen door verschillende microscopische technieken, waaronder fluorescerende macroscopie en twee-foton microscopie (figuur 2). Voorbeeld afbeeldingen hier afgeschilderd werden gerealiseerd op een fluorescentie macroscoop en een twee-foton microscoop gekoppeld aan een femtoseconde gepulste infrarode afstembare laser en home-gemodificeerde dierlijke positionering onder de 20X water immersie objectief (1.0NA) mogelijk te maken.
De tumor ontwikkeling werd geschat in de tijd met behulp van een fluorescentie macroscoop combineren schuine verlichting voor helderveld reflectie beeldvorming en epifluorescentie emissie (Figuren 2A-2C). Drempelwaarde voor de fluorescentie toegang tot de tumor gebied geeft gemakkelijk terwijl superficial vaatstelsel los als donkere structuren uit de witte achtergrond van het zichtbare beeld licht. Anderzijds intravitaal twee-foton microscopie kan z-snijden en orthogonale reconstructies van groot gezichtsveld met subcellulaire resolutie (dendrieten zie figuur 2D). Met fluorescerende eiwitten tot expressie in cellen van belang (bijvoorbeeld Thy1-CFP muizen die de cyaan fluorescent eiwit in neuronen tot expressie, groene pseudo-kleur in figuur 2D) is het mogelijk om de tumor progressie waarnemen in de neuronale micromilieu transgene dieren. Er moet echter worden opgemerkt dat de tumor celdichtheid het foton indringdiepte en de uitgezonden foton detectie kan tengevolge van de toegenomen diffusie. Dit is duidelijk zichtbaar in figuur 2D als de ruimtelijke resolutie begint te dalen 200 urn onder de duur materiaal in de tumor maar niet in de gezonde hersenparenchym. Bovendien is de tweede harmonische generatie signaal voortvloeiende weerm georganiseerde patronen van niet-centrosymetric moleculen zoals type I en III collageen zorgt voor een handtekening van de dura mater (cyaan pseudo-kleur in figuur 2D en pijlen). Opgemerkt moet worden dat met onze operatieprotocol, de tumor groeit onder de dura mater in het hersenparenchym waarin de ontwikkeling wordt geregeld door de fysieke beperkingen van de hersenen. De afdichting van de dura mater met een verknoopte dextran-gel hemi bead verhindert het ontsnappen van glioma cellen in de extradurale ruimte.
Wanneer gevolgd door intravitale twee-foton microscopie de progressie van de tumor tussen verschillende tijdstippen kunnen worden vergeleken op cellulair resolutie. Beeldvorming van hetzelfde gebied op D16 en D27 na de ingreep (figuur 3A) vonden we een aantal bloedvaten als een gemarkeerd met pijlen die stabiel waren over een periode van 11 dagen; aan de andere kant de tumor voorzijde duidelijk geïnfiltreerd in de gezonde parenchym over dezelfde periode. Tumorprogressie, haar ma evaluerenrgin waargenomen bij D27 werd geschetst met een gele stippellijn en overlay op de foto genomen op D16. Een 520 micrometer verschuiving van de voorkant werd consistent waargenomen met de gerapporteerde proliferatieve profiel van de GL261 glioma model 15. De patronen van het vasculaire netwerk in de tumor waren zeer verschillend op D16 en D27 aangeeft dat significante vasculaire hermodellering voorkomt in pathologische gebieden (figuur 3A). Op tumormarges We vonden ook gevallen van glioma cellen los van de tumor kern zoals verwacht van een invasieve tumor. De microscopische resolutie van onze beelden bleek niet alleen dat deze cellen uitstoten cytoplasmatische uitsteeksels aan het milieu te voelen, maar ook dat ze de bloedvaten kunnen gebruiken als een matrix voor hun progressie (pijlpunten en z-reconstructie in figuur 3B). Twee-foton microscopie kan aldus cellulaire interacties in een echte fysiologische context bestuderen. Met behulp waar elke cel bevolking van belang is transgene dierengeïdentificeerd door een eigen fluorescerende reporter het mogelijk om te zoeken naar de aanwezigheid van fysische interacties tussen tumorcellen en hun omgeving als belangrijke regulatoren van ziekteprogressie (Figuur 3B, rechts).
Figuur 1. Overzicht van de operatie. Het craniotomie wordt uitgevoerd op de linker pariëtale botten (A). De grenzen van de linker pariëtale bot worden geschetst met een stippellijn en het verwijderde deel wordt ingevuld geel (B). Zodra de craniotomie uitgevoerd, wordt de pariëtale cortex blootgesteld (C), is het gebied voor de injectie van de bolvormige geselecteerde zorg ervoor dat de belangrijkste bloedvaten (pijl in D) en een 26 gauge naald wordt gebruikt om de dura-mater openen (vermijd arrow E). De sferoïde isgeïnjecteerd en het gat in de dura mater wordt verstopt door een verknoopte dextran-gel hemi-kraal afgesloten met cyanoacrylaatlijm (pijl in F). Een glazen dekglaasje wordt vastgelijmd aan het bot terwijl het contact met de hersenen. Het dekglaasje wordt verder gecementeerd om de blootgestelde schedel tot lange termijn solide bevestiging van de craniale venster voor chronische waarnemingen (GI) te waarborgen. Het gehele protocol wordt kort schematisch in J. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Tumorgroei beperkt tot het hersenparenchym en kan in de tijd gevolgd. AC. Tumorgroei (GL261 cellijn DsRed2) wordt waargenomen door macroscopy op de dag van de operatie (DO, A) en op dag 21 (B) en 27 (C). De pijlpunt in C wijst op een daling van tandheelkundige cement dat niet tijdens stap 2.3.5. D werd verwijderd. Orthogonale reconstructies verkregen uit een 3 x 3 veld verworven 0-300 urn onder de dura-mater in een Thy1-GVB muis voorzien van een GL261 tumor door twee-foton microscopie op D20 na de operatie. Tumor (rood), dura-mater waargenomen door tweede harmonische generatie (pijlen, cyaan) en neuronen (groen). Merk op dat de tumor groeit onder de dura mater in de hersenen parenchym. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Vascular verbouwen en tumorcellen invasie kan worden gevolgd in de tijd met een mobiele ruimtelijke resolutie door intravitale twee-foton microscopie. Een. GL261 tumor (rood) waargenomen bij D16 en D27 na de operatie na een intraveneuze injectie van Cascade-blue dextran 70 kDa om bloedvaten te markeren. Stippellijn: tumor marge bij D27; pijlen: voorbeeld van bloedvaten die kunnen worden gebruikt als oriëntatiepunten naar hetzelfde gebied te lokaliseren bij D16 en D27 B.. Individuele tumorcellen (rood) binnenvallen de gezonde hersenen parenchym (neuronen; groen) met behulp van de bloedvaten als matrix voor invasie (pijlpunten). Beelden werden genomen op diepte tussen 100 en 150 urn onder de dura materie. Gestippelde lijn:. Regio waar de orthogonale reconstructie afgebeeld in het midden onderaan paneel werd gerealiseerd Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze aanpak maakt het gebruik van optische imaging methoden om toezicht te houden over dagen en weken de groei van een orthotopically geïmplanteerd glioom. Dezelfde dier kan vervolgens vrijwel elke brain imaging modaliteit worden onderworpen tijdens de pathologie; maar de twee-foton microscopie specifieke voorbereiding biedt de unieke mogelijkheid om subcellulaire resolutie in de hersenen van de levende dieren te bereiken. Het protocol heeft als voordeel om de tumorgroei te handhaven in het cerebrale parenchym plaats buiten durally het gebeurt wanneer gliomacellen het centrale zenuwstelsel kan verlaten via de beschadigde dura. Indien de fysieke beperkingen uitgeoefend door de hersenen omgeving kan tumorcel inderdaad sneller prolifereren ze niet nodig om het parenchym 16 infiltreren. Eerder verschenen methoden niet proberen om de dura mater te dichten na de transplantatie die was des te problematischer dan ze geïnjecteerd suspensie van cellen in plaats van bolletjes9,13,14. Suspensies van cellen zijn inderdaad onmogelijk om focaal gelden als individuele cellen systematisch worden gezaaid langs de injectie-darmkanaal bij de intrekking van de pipet uit de diepte naar de dura-mater.
Het huidige protocol kan worden toegepast op diverse muizenstammen inclusief transgene en immunosuppressie dieren. Verschillende glioma cellijnen kunnen worden geënt en gevisualiseerd, waaronder cellen rechtstreeks uit humaan weefsel, zolang zij stabiel getransfecteerd drukken een fluorescerende reporter voor transplantatie. Chirurgische protocol kan meestal worden uitgevoerd in 1 uur en cohorten van de dieren snel kunnen worden opgehaald. Deze benadering kan dus worden gebruikt om vasculaire remodellering, de effecten van farmacologische behandelingen angiogenese en tumorgroei, en de rekrutering van immune cellen te bestuderen in de tumor. Wanneer nodig glioom cel migratie en dynamische interacties tussen glioma cellen en het micromilieu in real time kan worden waargenomen voor meerdere hours.
Zoals beeldvorming kan worden gedaan over een diepte van 500 urn is het mogelijk om het grootste deel van het tumorvolume oorspronkelijk geïmplanteerde 200 urn onder de dura mater. Om ervoor te zorgen maximale beeldvorming diepte speciale zorg moet worden genomen tijdens de operatie om fysiek contact tussen de dura mater en de glazen dekglaasje creëren. Dit vermindert weliswaar de vorming van littekenweefsel dat anders zou compromitteren optische helderheid. Absolute steriliteit van de chirurgische milieu moet ook worden vastgesteld dat zij het na de operatie een ontsteking die kortstondig vervaagt het raam te beperken. Wij in ieder geval adviseren om 15 dagen wachten tussen de operatie en de eerste waarneming sessie optimale beeldvorming voorwaarden te verkrijgen. Daarna werd venster gevonden na de operatie aan schijngeopereerde dieren die het hele protocol ondergaan behalve de injectie van de tumor bolvormige duidelijk blijven tot een jaar.
Concluderend, de hier beschreven protocol een verbetering van de bestaande Orthotopic glioma muismodel gewijd aan chronische intravitale twee-foton microscopie. De oppervlakkige injectie van een tumor sferoïde, de verstopping van de injectie volgen met een verknoopte dextran-gel hemi parel en het afdichten van de dura mater handhaven tumorontwikkeling in de hersenen omgeving die werkelijk recapituleert de fysieke beperkingen gewoonlijk voor ziekteprogressie. Niet alleen deze methode zal dienen fundamentele studies op glioma pathofysiologie, maar het zal ook de relevantie van farmacologische resultaten in preklinische studies te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs hartelijk danken dr. KK Fenrich, dr. MC. Amoureux, P. Weber en A. Jaouen voor nuttige discussies; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, het personeel van het dier faciliteit op IBDML en het personeel van de PicSIL imaging platform op IBDML voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) naar GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Federation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) naar FD, door beurzen van de Federation de la Recherche Medicale en Canceropôle PACA naar CR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock - Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
References
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
