Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dissektion af Published: March 4, 2014 doi: 10.3791/51118
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Summary

Denne protokol beskriver, hvordan man dissekere premigratory kraniel neuralkam (NC) fra Xenopus laevis neurulas. Disse eksplantater kan udpladet på fibronectin og dyrket in vitro, eller podes tilbage i værten embryoner. Denne teknik gør det muligt at studere de mekanismer NC epitel-til-mesenchyme overgang, migration og differentiering.

Abstract

De neurale våbenskjold (NC) er en forbigående dorsal neuralrøret cellepopulation, som gennemgår et epithel-til-mesenchyme overgang (EMT) i slutningen af ​​neurulation, vandrer udstrakt i retning af forskellige organer, og skelner i mange typer af derivater (neuroner, glia, brusk og knogler, pigmenterede og endokrine celler). I denne protokol, beskriver vi, hvordan at dissekere premigratory kranie NC fra Xenopus laevis embryoner, for at studere NC udvikling in vivo og in vitro. Frøen model giver mange fordele til at studere tidlige udvikling, rigelige portioner er tilgængelige, embryoner udvikler sig hurtigt, in vivo gevinst og tab af funktion strategier giver manipulation af genekspression før NC dissektion i donor-og / eller værten embryoner. NC eksplantaterne kan være belagt på fibronektin og anvendes til in vitro-undersøgelser. De kan dyrkes i adskillige dage i et serum-frit defineret medium. Vi beskriver også hvordan man pode NC eksplanteret tilbagei host embryoner til at studere NC migration og differentiering in vivo.

Introduction

De neurale våbenskjold (NC) er en forbigående embryonale celle befolkning, der kommer fra neuralrøret i slutningen af ​​neurulation i hvirveldyr embryoner. Signal-og genetiske begivenheder, der styrer NC specifikation starte så tidligt som gastrulation. NC er angivet på grænsen mellem det neurale og ikke-neurale ectoderm af signaler fra de omkringliggende dorsale væv. Ved udgangen af ​​neurulation NC celler gennemgår en epitel-til-mesenchyme overgang (EMT), og i vidt omfang migrere i embryoet efter stereotype ruter ved at svare på omgivende vejledende signaler. Når de har nået deres endelige bestemmelsessted, de differentierer til en bred vifte af derivater fx neuroner, glia, knogler, brusk og pigmenterede celler 1-5. På grund af deres bidrag til mange celletyper og væv fra fostre, fejl på ethvert trin af NC-celler udvikling, fra induktion til den endelige differentiering, kan forårsage medfødte syndromer navngivne neurocristopathies 6. Experimental manipulation af udviklingen NC på forskellige stadier - Specifikation, EMT, migration og differentiering - vil forbedre vores forståelse af neurocristopathies og tillade design af potentielle terapeutiske strategier.

Xenopus laevis embryo er en model af valg for at studere NC udvikling. Et stort antal embryoner er nemme at få, og ekstern befrugtning giver adgang til de allerførste skridt i udviklingen. Mange værktøjer er tilgængelige for eksperimentelt manipulere X. laevis fosterudviklingen. Gene gain-of-funktion og knockdown er nemme at udføre ved mikroinjektion individuelle celler af tidlig blastulas. Embryonale væv kan skæres til in vitro reassociation 7-11 eller back-podning assays 12,13.

I denne protokol, beskriver vi, hvordan at dissekere ud premigratory kranie NC i X. laevis sene neurulas forud for migration. Disse eksplantater kan dyrkes på fibronectin-Coated plader at studere migration og differentiering i kontrolleret in vitro eksperimentelle betingelser. NC explanter kan også blive podet ind i normale eller manipulerede værten embryoner til at studere deres migrering og differentiering in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter overholder nationale og europæiske bestemmelser om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål, og med internationalt vedtagne principper om erstatning, begrænsning og forfinelse.

1.. Fremstilling af fibronectincoatede Dishes 14

  1. Afpipetteres 500 ml 10 mg / ml kultur klasse fibronectin fortyndet i 1x phosphatpufret saltvand (PBS) i et standard plast petriskålen (Ø 40 x 11 mm). Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Bemærk: Hvis du bruger glas retter eller dækglas til efterfølgende billedbehandling, skal du bruge en 100 mg / ml fibronektin løsning.
  2. Skyl tre gange med 1x PBS.
  3. Udskift PBS med 500 ml 1x PBS/0.1% bovint serumalbumin (BSA). Inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
  4. Skyl tre gange med 1x PBS.
  5. Fyld op med 1x PBS og holde ved 4 ° C indtil anvendelse (normalt for 24-48 timer).

2. Dissektion af NC Eksplantater

<ol>
  • Forbered 3/4 Normal Amphibian Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamycin 10,15). Må ikke holde mere end 1 uge for dissektion, opbevares ved 4 ° C. Ældre NAM kan anvendes til fremstilling af agarose-coatede dissektion retter (nedenfor).
  • Forbered 60 mm petriskåle til dissektion, belagt med 10 ml 2% agarose i 3/4 NAM.
  • Saml Dissektionsværktøj: plast Pasteur-pipetter, en fineste insekt pin monteret på stiftholder (se materialer tabel for reference) et "øjenbryn kniv" (lavet med øjenbryn hår indlejret i paraffin på spidsen af en glas Pasteur-pipette 16), to fine dissektion pincet, P1000 pipette og tips, en kikkert stereoskop med forstørrelse 8-40X til 50, en kraftig lyskilde med optiske fibre guider. Alle dissekere værktøjer skal holdes rene, og efter hvert forsøg, skyl dem to gange med destilleret vand, når with 100% ethanol og lad tørre. Opbevar væk fra støv.
  • Udfyld dissektion fad med frisk NAM næsten til toppen.
  • Opnå X. laevis embryoner i henhold til standardprocedurer 10 og ældre dem, indtil de når neurula stadie 16 (ifølge Nieuwkoop og Faber udviklingsmæssige tabel 17).
  • Placer trin 16 embryoner i dissektion skålen ved hjælp af plast Pasteur-pipette.
  • Foretag alle efterfølgende trin under kikkerten rækkevidde. Fjern vitellinmembranen med to par tænger. Vær forsigtig med ikke at beskadige rygstykker af embryoner.
  • Vent embryonerne har nået 17. etape for at starte dissektion. Stage 17 er hensigtsmæssigt, da neuralkam klart er indstillet bortset fra neuralrøret, i modsætning til tidligere stadier. Efter 17. etape, NC begynder at migrere og sammenblandingen med det omgivende mesenchyme.
  • Grave et lille hul i agarose med en pincet for at gøre en niche for embryoner for at opretholdedem under dissektion. Placer en embryo dorsalsiden op. Bemærk: modellervoks kan anvendes til at opretholde de embryoner stedet grave et hul i agarose.
  • Lave et snit i den laterale del af den anteriore neural fold med øjenbryn kniv og insekt pin. Vær forsigtig med ikke at gå for dybt ind i embryo: sigter mod at skære igennem 2-3 cellelag (aldrig nå så dybt som archenteron!). Under hele dissektion proces aldrig tillade dissekerede væv at komme i kontakt med luft-væske-grænsefladen, idet X. laevis embryonale væv lyseres ved overfladespænding.
  • Foretag en anden parallel snit i mere dorsale del af neurale fold ved hjælp af de samme instrumenter.
  • Hvis det er nødvendigt, drej fadet omkring 90 °. Lav en tredje vinkelret snit med øjenbrynet kniv og insekt pin, ved den bageste side af de to første indsnit. NC er en tyk masse af celler under pigmenterede ydre lag af ektoderm, lateraletil neuralrøret.
  • Brug spidsen af ​​øjenbrynet kniv til at løsne det pigmenterede ectoderm lag fra den underliggende NC, startende fra den tredje snit kant.
  • Brug den side af øjenbryn kniv til at frigøre NC væv startende fra den tredje snit. NC væv er temmelig grålige, mens den underliggende cefale mesoderm er hvid. Adskil forsigtigt NC fra mesoderm.
  • Frigør NC væv anteriort fra optikken vesikel, og skæres på dette niveau for at befri eksplantatet. Som en kontrol for første eksperimenter, kontrol snail2 ekspression (en kanonisk NC markør) i nogle eksplantater ved in situ hybridisering anbefales.

    • 3. Plating Eksplantater på Fibronektin

    1. Fill-in på fibronectincoatede fad med Modified Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mM, K Glykonat 4,5 mM, Na Glykonat 32 mM, MgSO4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, justere pH til 8,3 med 1 M Bicin
    2. Overfør eksplantater i fibronectin-belagt skål ved hjælp af en P1000-pipette. Lad aldrig eksplantaterne at røre ved luft-væske grænsefladen. Først pipetteres lidt væske ind i spidsen, så eksplantater derefter nogle flydende igen. Lad ikke nogen luft ind i spidsen, mens overførsel eksplantaterne i fibronectincoatede fad. Når spidsen er inde i væsken i fibronectincoatede fad, lad eksplantaterne langsomt gå ned ved hjælp af tyngdekraften, eller skubbe meget forsigtigt. Undgå at skubbe eksplantaterne for hurtigt.
    3. Placer 10-30 explanter i skålen ved hjælp af øjenbryn kniv. Undgå siderne af skålen, som ikke er tilstrækkelig til efterfølgende billedbehandling.
    4. Prøv ikke at flytte fadet indtil eksplantaterne har vedhæftet på fibronektin (det tager ca 15-30 min.) Hvis det er nødvendigt, skal du flytte fadet meget nøje.
    5. Sæt fadet i en nedkølet inkubator (mellem 15-20 ° C, temperatur diagram se 17). Når den er placeret ved 15 ° C, ar cellere sædvanligvis migrere effektivt og spredning efter 6 timer inkubation (denne timing kan variere mellem forsøgene).

    4.. Podning Eksplantater i Host Embryoner

    1. Skær en fin dækglas i meget små stykker ved hjælp af grove pincet. Størrelsen af stykkerne bør være ca 1,5 mm 2. Fordyb stykkerne i en petriskål indeholdende 3/4 NAM eller PBS ved hjælp af pincet.
    2. Forberedelse af værtsembryo: dissekere ud værten NC i 3/4 NAM, som beskrevet i 3) med særlig omhu for ikke at beskadige værtsembryo samtidig fjerne vitellinmembranen og dissekere NC. Vævet spænding tendens til at forøge størrelsen af ​​ablation: lad værtsembryo helbrede delvis mens dissekere donor foster.
    3. I en anden agarose-coatede skål eller i en anden del af samme skålen, dissekere ud NC eksplantation fra donor embryo som beskrevet i protokol 3. Overfør NC graft i skålen, der indeholder værten med omhu, som beskrevet iProtokol 3.
    4. Anbring straks NC eksplantatet på værten ablated område ved hjælp af pincet. Eksplantatet bør vedhæfte delvist. Sætte et stykke dækglas på podede embryo at fastholde transplantatet på plads. Vælg et stykke glas større end embryonet at undgå at beskadige den. Fosteret vil være en lille smule fladtrykt.
    5. Vent i mindst 15-20 min, og derefter forsigtigt fjerne dækglasset. Lad embryo restituere i yderligere 10 minutter og forsigtigt pipettere det i en ren skål fyldt med 3/4 NAM, ved hjælp af plast Pasteur-pipette.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Når belagt på fibronektin, de neurale crest eksplantaterne vedhæfte hurtigt (15-30 min) og eksplantatet spreder flad inden 2 timer (Figur 1A). Efter 3-6 timers celler begynder at sprede. Ved 24 timer ved 15 ° C, har mange celler er begyndt at vandre væk fra eksplantatet (Fig. 1B og 1C). Æggeblomme gør cellerne meget lyse under fasekontrast (figur 1B). Cell fremspring (filopodes og lamellipodes) er tydeligt synlige efter phalloidin farvning af aktincytoskelet (figur 1C).

    Til orthotopisk podning forsøget blev donorembryoner injiceret med GFP-mRNA med henblik på at følge de podede celler i den umærkede værtsembryo. Kranie NC blev ablation på den ene side af vært 30-60 min efter kirurgi transplantatet er helet, der erstatter den ablateret vært kranie NC (figur 1D, 2 timer efter podning). Et par timer senere har de GFP-positive celler migreretud fra eksplantatet og fulgte de stereotype migrationsvejene for NC-celler mod ventrale kraniofaciale steder (Figur 1E). I haletudser, har NC-afledte kraniofaciale strukturer udviklet (figur 1G). Når kraniel NC blev ablation, blev disse strukturer mangler, hvilket resulterer i en kortere ansigt med øjet støder op til cement kirtel (figur 1H, røde pile). I podede haletudser har donor NC celler bidrog til kranio-facial strukturer, hvilket resulterer i en normal ansigt morfologi (figur 1F og 1I, grønne pile).

    Figur 1
    Fig. 1. In vitro og in vivo-opførsel eksplanteret kraniel NC. AC)   Premigratory NC blev dissekeretud fra et trin 17 neurula embryo og udpladet på en fibronectin-belagt skål. A) 2 timer efter udpladning, har eksplantatet fastgjort og spredning. B) 24 timer efter udpladning, har celler effektivt migreret på fibronectin. C) lamellipodia og filopodia ses tydeligt i migrere NC celler mærket med phalloidin (grøn) DI) Neurula 17. etape GFP + mærket premigratory NC blev taget fra en GFP-indsprøjtning embryo og back-podet ind en værtsembryo, hvorfra kranie NC blev ablated på 17. etape. - 18.. D) To timer efter podning, har eksplantatet helet. EF) podede NC celler har aktivt migreret ud og befolkede mandibular strøm som vist på haletudse stadium 31 og 41.. G) Styring stadie 41 haletudse. H) ablatere NC har resulteret i en dramatisk fiasko af ansigt og øjne udvikling (H: Bemærk, at cement Gland udvikler støder op til øjet, på grund af manglen på NC celler befolker kæben områder, røde pile. . Sammenlign kontrollere haletudse i G) F, I) I modsætning hertil har de podede NC celler, der restitueres øje og craniofacial strukturer udvikling (F, I, grønne pile) AC, skalapanelerne = 100 mm. DI, Skala bar = 1 mm . D, bryst udsigt. EI, side visninger. Dette tal er blevet ændret fra Milet et al. 12. Klik her for at se en større version af dette tal.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Denne protokol beskriver en nem teknik eksplanteres premigratory kraniel NC i X. laevis embryoner. De embryoner, der anvendes til sådanne forsøg skal være robust og helbrede godt. Kassér parti af usunde embryoner. Desuden vokser embryoner ved forskellige temperaturer (fra 12 til 18-20 ° C), med henblik på at udskære neuralkam på 17. etape og ikke senere. Efter trin 17 kan neuralkam blandes med cephalic mesoderm og kan ikke fjernes helt. Xenopus væv heler hurtigt og miste deres adhæsion til andre væv. Det er vigtigt at arbejde hurtigt og placere de neurale crest eksplantater i værten, så snart det er udskåret fra donoren.

    Vedrørende in vitro-eksperimenter, kan fibronectin dyrkningsskåle få forurenet med bakterier eller svampe efter et par dage. Brug af antibiotika og ren eller steril materiale og løsninger så ofte som muligt.

    Denne procedure er optimeret feller kraniel neurale våbenskjold. Faktisk er denne celle population veldefineret og lokaliseret i trin 17 Xenopus embryoner. Desværre er denne model ikke er hensigtsmæssigt at udføre sådanne eksperimenter på stammen NC. Fugleembryoner er mere velegnet til dem, der er interesseret i at manipulere sådan bagagerum NC celle population.

    De er beskrevet i denne protokol eksplantater kan anvendes til at undersøge forskellige aspekter af NC adfærd, både in vivo og in vitro. NC molekylære udviklingsmæssige program er i høj grad bevaret i hvirveldyr 19. Frog udvikling er en kraftfuld model til at studere hvirveldyr NC EMT, migration og differentiering. X. laevis embryonale celler indeholder nok æggeblomme til at tillade deres overlevelse in vitro i flere dage uden tilsætning af nogen ekstern næringsstof. Således kan in vitro-undersøgelser afprøve virkningerne af forskellige vækstfaktorer eller kemiske forbindelser, på en enkel og fuldt kontrolleret dyrkningsmedium. Sådanne forsøg har væretdesignet til at analysere EMT og migration, herunder undersøgelse af virkningerne af kemo-tiltrækningsmidler eller kemo-insektmidler, aktivere eller blokere signalveje osv. 14,20-24 Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at designe forbedrede rettet NC differentiering protokoller. I forbindelse med udviklingen af protokoller for regenerativ medicin, opnå forskellige NC-afledte celletyper in vitro kunne anvendes i drug screening for forståelse og behandling neurocristopathies 25,26.

    NC udvikling orkestreret af et komplekst samspil mellem celle autonome regler og signaler fra de omgivende væv. Eksperimentelle manipulationer af genekspression, enten i donor NC eller i værten embryo, tillade diskriminerende celleautonom fra noncell autonome aspekter af NC udvikling. Ved at kombinere gain-of-funktion og knock-down tilgange til denne protokol for in vitro-dyrkning og in vivo podning har været brug med succesd 14,21,23,27-36.

    Denne teknik kan tilpasses til at pode andre væv i værten embryoner og teste for deres migration og differentiering potentialer. For eksempel har vi brugt pluripotente blastocoel tag ectoderm (den "dyr cap") for at kigge efter en minimal transskriptionskontakt NC udvikling. Vi har undersøgt effekten af to transkriptionsfaktorer, PAX3 og zic1, om NC engagement og efterfølgende udvikling. Animal hætter med PAX3 og zic1 gain-of-funktion blev belagt på fibronektin in vitro eller backgrafted i værten embryoner. Vi fandt, at Pax3/Zic1-induced celler migrerer og differentierer som bona fide NC celler både in vitro og in værten embryoner 12.

    Talrige molekylære mekanismer, der styrer NC EMT og migration er også involveret i metastatisk udbredelse i kræft 37.. Denne protokol sigter på at give en enkel, billig og effekent værktøj for udviklingsmæssige biologer og andre forskere til at udforske de grundlæggende mekanismer i disse centrale celle adfærd.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne har ikke noget at afsløre.

    Acknowledgments

    Forfatterne takker Adeline Dolly for billeder af explant på fibronektin, Eric Theveneau for nyttige diskussioner og Animal Facility fra Institut Curie. CM er en post.doc i Region Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Université Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche), og Agence Nationale de la Recherche. Dette arbejde blev finansieret af Université Paris Sud (Attractivite 2011), Centre National de la Recherche Scientifique (aktion thématique et Incitative sur-programmet), Association pour la Recherche contre le Cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, og Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
    2. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
    3. Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
    4. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
    5. Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
    6. Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
    7. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
    8. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
    9. Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
    10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).
    11. Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
    12. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
    13. Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
    14. Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
    15. Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
    16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
    17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. New York. (1994).
    18. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
    19. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
    20. Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
    21. Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
    22. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    23. Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
    24. Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
    25. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
    26. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
    27. Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
    28. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    29. Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
    30. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
    31. Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
    32. Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
    33. Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
    34. Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
    35. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
    36. Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
    37. Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).

    Tags

    Developmental Biology neuralkam graft fibronectin
    Dissektion af<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest<em&gt; In vitro</em&gt; Eksplantat kultur eller<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H.… More

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter