Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

के विच्छेदन Published: March 4, 2014 doi: 10.3791/51118
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Summary

इस प्रोटोकॉल Xenopus laevis neurulas से premigratory कपाल तंत्रिका शिखा (नेकां) काटना कैसे करें. ये explants फ़ाइब्रोनेक्टिन और इन विट्रो में सुसंस्कृत पर चढ़ाया, या वापस मेजबान भ्रूण में grafted किया जा सकता है. इस तकनीक नेकां उपकला करने वाली mesenchyme संक्रमण, प्रवास, और भेदभाव के तंत्र के अध्ययन की अनुमति देता है.

Abstract

तंत्रिका शिखा (नेकां) neurulation के अंत में एक उपकला करने वाली mesenchyme संक्रमण (EMT) से होकर गुजरती है कि एक क्षणिक पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब सेल की आबादी है, जो विभिन्न अंगों की दिशा में बड़े पैमाने पर प्रवास करती है, और डेरिवेटिव के कई प्रकार के (न्यूरॉन्स, glia में differentiates उपास्थि और हड्डी, रंजित और अंत: स्रावी कोशिकाओं). इस प्रोटोकॉल में, हम vivo में इन विट्रो में नेकां विकास का अध्ययन करने के क्रम में, Xenopus laevis भ्रूण से premigratory कपाल नेकां काटना क्या करते हैं. मेंढक मॉडल जल्दी विकास का अध्ययन करने के लिए कई लाभ प्रदान करता है, प्रचुर मात्रा में बैचों भ्रूण में विवो लाभ और समारोह रणनीतियों के नुकसान से पहले दाता और / या मेजबान भ्रूण में नेकां विच्छेदन के लिए जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर की अनुमति, तेजी से विकसित, उपलब्ध हैं. नेकां explants फ़ाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया और इन विट्रो अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वे एक सीरम मुक्त परिभाषित मध्यम में कई दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता है. हम भी नेकां explants वापस भ्रष्टाचार के लिए कैसे का वर्णनविवो में नेकां प्रवास और भेदभाव के अध्ययन के लिए मेजबान भ्रूण में.

Introduction

तंत्रिका शिखा (नेकां) हड्डीवाला भ्रूण में neurulation के अंत में न्यूरल ट्यूब से उभर कि एक क्षणिक भ्रूण सेल की आबादी है. नेकां विनिर्देश है कि नियंत्रण संकेतन और आनुवंशिक घटनाओं के रूप में जल्दी gastrulation के रूप में शुरू करते हैं. नेकां आसपास के पृष्ठीय ऊतकों से संकेत द्वारा तंत्रिका और गैर तंत्रिका बाहरी झिल्ली के बीच सीमा पर निर्दिष्ट किया जाता है. Neurulation के अंत में, नेकां कोशिकाओं को एक उपकला करने वाली mesenchyme संक्रमण (EMT) से गुजरना और मार्गदर्शक cues के आसपास का जवाब देने से टकसाली मार्गों के बाद भ्रूण में बड़े पैमाने पर पलायन. वे अपने अंतिम गंतव्य तक पहुँच चुके हैं, वे डेरिवेटिव, जैसे न्यूरॉन्स, glia, हड्डी, कार्टिलेज, और pigmented कोशिकाओं 1-5 की एक विशाल सरणी में अंतर. क्योंकि कई प्रकार की कोशिकाओं और भ्रूण के ऊतकों, नेकां कोशिकाओं के विकास के किसी भी कदम पर दोष, प्रेरण से अंतिम भेदभाव करने के लिए उनके योगदान की, neurocristopathies 6 नामित जन्मजात सिंड्रोम हो सकता है. एविनिर्देश, EMT, प्रवास, और भेदभाव - - अलग चरणों में विकसित करने नेकां के xperimental हेरफेर neurocristopathies के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने और संभावित चिकित्सीय रणनीतियों की डिजाइन की अनुमति देगा.

Xenopus laevis भ्रूण नेकां विकास का अध्ययन करने के लिए पसंद का एक मॉडल है. भ्रूण की बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं, और बाह्य निषेचन विकास के बहुत पहले कदम के लिए पहुँच देता है. कई उपकरण प्रयोगात्मक एक्स हेरफेर करने के लिए उपलब्ध हैं भ्रूण विकास laevis. लाभ के समारोह और पछाड़ना जीन जल्दी blastulas के व्यक्ति की कोशिकाओं microinjecting द्वारा प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं. भ्रूण के ऊतकों में इन विट्रो reassociation 7-11 या वापस ग्राफ्टिंग assays 12,13 के लिए काटा जा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम एक्स में premigratory कपाल नेकां बाहर काटना वर्णन कैसे पिछले प्रवास को देर neurulas, laevis. ये explants फ़ाइब्रोनेक्टिन-coate पर संवर्धित किया जा सकता हैमें प्रवास और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए डी प्लेटें विट्रो प्रयोगात्मक शर्तों में नियंत्रित. नेकां explants भी vivo में उनके प्रवास और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए सामान्य या चालाकी से मेजबान भ्रूण में grafted किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रयोगों वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए और प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के लिए अंतरराष्ट्रीय स्तर पर स्थापित सिद्धांतों के साथ इस्तेमाल पशुओं के संरक्षण पर राष्ट्रीय और यूरोपीय विनियमन के साथ अनुपालन.

1. Fibronectin लेपित व्यंजन 14 की तैयारी

  1. एक मानक प्लास्टिक पेट्री डिश (O 40 x 11 मिमी) में 1x फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में पतला 10 मिलीग्राम / एमएल संस्कृति ग्रेड fibronectin की पिपेट 500 मिलीलीटर. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. नोट: बाद इमेजिंग के लिए कांच के बर्तन या कांच coverslips का उपयोग करते हैं, तो एक 100 मिलीग्राम / एमएल fibronectin समाधान का उपयोग करें.
  2. 1x पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला.
  3. 1x PBS/0.1% गोजातीय सीरम albumin (BSA) के 500 मिलीलीटर के साथ पीबीएस बदलें. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  4. 1x पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला.
  5. 1x पीबीएस के साथ भरने और (आमतौर पर 24-48 घंटे के लिए) का प्रयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना.

2. नेकां explants के विच्छेदन

<राजभाषा>
  • तैयार करें 3/4 सामान्य एम्फ़िबियाई मध्यम (एनएएम) (110 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 1 मिमी CA (सं 3) 2, 1 मिमी MgSO 4, 0.1 मिमी EDTA, 1 मिमी 3 NaHCO, 0.2x पीबीएस, 50 मिलीग्राम / मिलीलीटर ) 10,15 gentamycin. 4 डिग्री सेल्सियस पर विच्छेदन, दुकान के लिए अधिक से अधिक 1 सप्ताह न रखें वृध्द गुटनिरपेक्ष आंदोलन agarose में लिपटे विच्छेदन व्यंजन (नीचे) की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  • 3/4 वियतनाम में 2% agarose के 10 एमएल के साथ लेपित विच्छेदन के लिए 60 मिमी पेट्री डिश, तैयार करें.
  • विच्छेदन उपकरण लीजिए: प्लास्टिक पाश्चर pipettes, एक बेहतरीन कीट पिन पिन धारक (संदर्भ के लिए सामग्री तालिका देखें), (एक गिलास पाश्चर पिपेट 16 की नोक पर आयल में एम्बेडेड भौं बालों के साथ बनाया) एक "भौं चाकू", दो ठीक पर घुड़सवार विच्छेदन संदंश, P1000 विंदुक और सुझावों, 50 तक बढ़ाई 8-40X के साथ एक दूरबीन त्रिविमेक्ष, ऑप्टिक फाइबर गाइड के साथ एक उज्ज्वल प्रकाश स्रोत. सभी विदारक उपकरणों को साफ रखा जाना चाहिए, एक प्रयोग के बाद, आसुत जल के साथ दो बार एक बार वाई उन्हें कुल्ला100% इथेनॉल वें और सूखी हैं. दूर धूल से स्टोर.
  • लगभग शीर्ष पर ताजा गुटनिरपेक्ष आंदोलन के साथ विच्छेदन पकवान में भरें.
  • एक्स प्राप्त मानक प्रक्रियाओं 10 और वे (Nieuwkoop और फैबर विकासात्मक तालिका 17 के अनुसार) neurula चरण 16 तक पहुंचने तक उन्हें उम्र के अनुसार भ्रूण laevis.
  • 16 भ्रूण प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग विच्छेदन डिश में मंच रखें.
  • दूरबीन गुंजाइश के तहत बाद के सभी चरणों को पूरा. संदंश के दो जोड़े के साथ पीतक झिल्ली निकालें. भ्रूण के पृष्ठीय भाग नुकसान नहीं सावधान रहो.
  • भ्रूण विच्छेदन शुरू करने के लिए चरण 17 पर पहुंच गया है जब तक प्रतीक्षा करें. तंत्रिका शिखा स्पष्ट रूप से पहले चरण के विपरीत, न्यूरल ट्यूब से अलग सेट है के बाद से स्टेज 17 उपयुक्त है. चरण 17 के बाद, नेकां पलायन और आसपास mesenchyme साथ खुलेपन शुरू होता है.
  • बनाए रखने के क्रम में भ्रूण के लिए एक आला बनाने के लिए संदंश के साथ agarose में एक छोटा सा छेद खोदोविच्छेदन के दौरान उन्हें. एक भ्रूण पृष्ठीय पक्ष रखें. नोट: क्ले मॉडलिंग के बजाय agarose में एक छेद खुदाई भ्रूण बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  • भौं चाकू और कीट पिन के साथ पूर्वकाल तंत्रिका गुना के पार्श्व भाग में एक चीरा. गहरे भ्रूण में भी नहीं जाने के लिए सावधान रहें: 2-3 सेल परतों (! आर्कियोतेरोन जितनी गहरी तक कभी नहीं) के माध्यम से कटौती का लक्ष्य. पूरे विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान, विच्छेदित ऊतकों एक्स के बाद से हवा तरल इंटरफेस के साथ संपर्क में प्रवेश करने की अनुमति कभी नहीं laevis भ्रूण ऊतकों सतह तनाव से lysed रहे हैं.
  • तंत्रिका की अधिक पृष्ठीय भाग में एक दूसरे के समानांतर चीरा एक ही उपकरणों का उपयोग गुना.
  • यदि आवश्यक हो, 90 डिग्री के आसपास पकवान बारी. पहले दो चीरों के पीछे पक्ष में, भौं चाकू और कीट पिन के साथ एक तिहाई सीधा चीरा. नेकां पार्श्व, बाह्य त्वक स्तर का pigmented बाहरी परत के नीचे कोशिकाओं की एक मोटी जन हैन्यूरल ट्यूब के लिए.
  • तीसरे चीरा किनारे से शुरू, अंतर्निहित नेकां से pigmented बाहरी झिल्ली परत से अलग करने के भौं चाकू की नोक का प्रयोग करें.
  • तीसरे चीरा से शुरू नेकां ऊतक से अलग करने के भौं चाकू की ओर का प्रयोग करें. अंतर्निहित मस्तक mesoderm सफेद है, जबकि नेकां ऊतक, बल्कि भूरा है. ध्यान से mesoderm से नेकां अलग.
  • ऑप्टिक पुटिका से पूर्व से नेकां के ऊतकों को अलग करें, और explant मुक्त करने के लिए इस स्तर पर कटौती. स्वस्थानी संकरण में से कुछ explants में snail2 अभिव्यक्ति (एक विहित नेकां मार्कर) की जाँच के पहले प्रयोगों के लिए एक नियंत्रण के रूप में सिफारिश की है.

    • 3. Fibronectin पर चढ़ाना Explants

    1. खाली स्थान भरें fibronectin लेपित पकवान संशोधित Danilchick मध्यम (एमडीएम, NaCl 53 मिमी, Na2CO 3 से 5 मिमी, कश्मीर Gluconate 4.5 मिमी, ना Gluconate 32 मिमी, 4 MgSO 1 मिमी, 2 CaCl 1 मिमी, बीएसए 0.1% के साथ, पीएच को समायोजित 1 एम Bicine साथ 8.3
    2. एक P1000 विंदुक का उपयोग fibronectin लेपित पकवान में explants स्थानांतरण. Explants हवा तरल इंटरफेस को छूने के लिए अनुमति देते हैं. सबसे पहले, तो कुछ तरल फिर, explants तो, टिप में कुछ तरल विंदुक. Fibronectin लेपित पकवान में explants स्थानांतरित करते हुए टिप में किसी भी हवाई अनुमति न दें. टिप fibronectin लेपित पकवान का तरल के अंदर एक बार, explants धीरे धीरे गंभीरता से नीचे चलते हैं, या बहुत धीरे धक्का. भी तेजी explants बाहर खदेड़ना से बचें.
    3. भौं चाकू का उपयोग पकवान में 10-30 explants रखें. बाद इमेजिंग के लिए पर्याप्त नहीं हैं जो पकवान के पक्ष से बचें.
    4. Explants (इसके बारे में 15-30 मिनट लगते हैं) फ़ाइब्रोनेक्टिन पर संलग्न है जब तक पकवान ले जाने के लिए नहीं की कोशिश करें. यदि आवश्यक हो, बहुत ध्यान से पकवान चाल है.
    5. (तापमान चार्ट 17 देखने के लिए 15-20 डिग्री सेल्सियस के बीच,) एक प्रशीतित इनक्यूबेटर में पकवान. 15 डिग्री सेल्सियस पर रखा है, कोशिकाओं की गिरफ्तारीई आमतौर पर कुशलता से पलायन और ऊष्मायन के 6 घंटे के बाद बिखरने (इस समय के प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैं).

    4. मेजबान भ्रूण में explants कलम बांधने का काम

    1. मोटे संदंश का उपयोग बहुत छोटे टुकड़ों में ठीक एक गिलास coverslip काटें. टुकड़ों का आकार लगभग 1.5 मिमी 2 होना चाहिए. संदंश का उपयोग 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन या पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में टुकड़े विसर्जित कर दिया.
    2. मेजबान भ्रूण की तैयारी: पीतक झिल्ली को हटाने और नेकां विदारक जबकि मेजबान भ्रूण को नुकसान नहीं विशेष देखभाल के साथ) 3 में वर्णित के रूप में 3/4 वियतनाम में मेजबान नेकां काटना. दाता भ्रूण विदारक जबकि मेजबान भ्रूण आंशिक रूप से चंगा करते हैं: ऊतक तनाव पृथक का आकार बढ़ जाता है.
    3. प्रोटोकॉल 3 में वर्णित के रूप में एक और agarose लेपित पकवान में या एक ही थाली के दूसरे भाग में, दाता भ्रूण से नेकां explant काटना. में वर्णित है, देखभाल के साथ मेजबान युक्त डिश में नेकां भ्रष्टाचार स्थानांतरणप्रोटोकॉल 3.
    4. तुरंत संदंश का उपयोग मेजबान ablated क्षेत्र पर नेकां explant जगह है. explant आंशिक रूप से संलग्न करना चाहिए. जगह में भ्रष्टाचार को बनाए रखने के लिए grafted भ्रूण पर कांच coverslip का एक टुकड़ा डाल दिया. यह हानिकारक से बचने के भ्रूण से भी बड़ा कांच के टुकड़े चुनें. भ्रूण चपटा थोड़ा सा हो जाएगा.
    5. कम से कम 15-20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, फिर धीरे coverslip हटा दें. भ्रूण एक और 10 मिनट के लिए ठीक करने दें और सावधानी से प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग, 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन से भरा एक स्वच्छ पकवान में पिपेट.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    फ़ाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया करते हैं, तंत्रिका शिखा explants तेजी से (15-30 मिनट) देते हैं और explant 2 घंटा (चित्रा 1 ए) के भीतर फ्लैट फैलता है. 3-6 घंटे की कोशिकाओं को तितर बितर करने के लिए शुरू करने के बाद. 15 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे में कई कोशिकाओं दूर explant (आंकड़े 1 बी और 1 सी) से विस्थापित करने के लिए शुरू कर दिया है. जर्दी चरण विपरीत (चित्रा 1 बी) के तहत कोशिकाओं को बहुत चमकदार बनाता है. सेल protrusions (filopodes और lamellipodes) actin cytoskeleton (चित्रा 1C) के धुंधला Phalloidin के बाद स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं.

    Orthotopic ग्राफ्टिंग प्रयोग के लिए, दाता भ्रूण unlabeled मेजबान भ्रूण में grafted कोशिकाओं का पालन करने के क्रम में GFP mRNA इंजेक्शन के साथ थे. कपाल नेकां मेजबान के एक तरफ ablated गया था, 30-60 मिनट के ऑपरेशन के बाद भ्रष्टाचार ablated मेजबान कपाल केरोलिना (चित्रा -1, कलम बांधने का काम के बाद 2 घंटा) की जगह, चंगा किया है. कुछ घंटे बाद, GFP पॉजिटिव कोशिकाओं चले गएबाहर explant से और उदर craniofacial स्थानों (चित्रा 1E) की ओर नेकां कोशिकाओं के टकसाली प्रवास मार्गों का पालन किया. Tadpoles में, नेकां व्युत्पन्न craniofacial संरचनाओं (चित्रा 1G) विकसित किया है. कपाल नेकां ablated गया था, इन संरचनाओं सीमेंट ग्रंथि (चित्रा 1H, लाल तीर) से सटे आँख के साथ एक छोटा चेहरा है, जिसके परिणामस्वरूप याद कर रहे थे. कलमी tadpoles में, दाता नेकां कोशिकाओं को एक सामान्य चेहरे आकारिकी (आंकड़े 1F और 1 मैं, हरी तीर) में जिसके परिणामस्वरूप, cranio चेहरे संरचनाओं के लिए योगदान दिया.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. इन विट्रो और explanted कपाल नेकां के विवो व्यवहार में. एसी)   Premigratory नेकां विच्छेदित किया गया थाबाहर एक चरण 17 neurula भ्रूण से और एक fibronectin लेपित पकवान. ए) चढ़ाना के बाद 2 घंटा पर चढ़ाया, explant जुड़ी और फैल गया है. बी) 24 घंटा चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं कुशलतापूर्वक फ़ाइब्रोनेक्टिन पर चले गए हैं. सी) lamellipodia और filopodia . स्पष्ट रूप से डीआई) Neurula चरण phalloidin (हरा) के साथ लेबल नेकां पलायन कोशिकाओं में देखा जाता है 17 + GFP premigratory नेकां एक GFP इंजेक्शन भ्रूण से ली गई है और कपाल नेकां चरण 17 पर ablated गया था जिसमें से एक मेजबान भ्रूण में वापस grafted किया गया था लेबल - 18. डी) दो घंटे कलम बांधने का काम के बाद, explant चंगा किया है. एफई) Grafted नेकां कोशिकाओं को सक्रिय रूप से बाहर चले गए और मेढक चरण 31 और 41. जी) नियंत्रण चरण 41 मेढक में दिखाया के रूप में जबड़े धारा आबादी है. एच) नेकां गया है ablating चेहरे और आंख के विकास का एक नाटकीय असफलता के परिणामस्वरूप (एच: ध्यान दें कि सीमेंट GLANडी कारण जबड़े क्षेत्रों, लाल तीर populating नेकां कोशिकाओं की कमी के कारण, आंख से सटे विकसित करता है. .) जी में मेढक को नियंत्रित करने के लिए तुलना एफ, आई) इसके विपरीत, कलमी नेकां कोशिकाओं आँख और craniofacial संरचनाओं विकास (एफ, मैं, हरी तीर) बहाल कर दिया है एसी, स्केल सलाखों = 100 मिमी,. डि, स्केल बार = 1 मिमी . डी, पृष्ठीय देखें. ईआइ, ओर देखा. यह आंकड़ा दुकान एट अल से संशोधित किया गया है. 12 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    इस प्रोटोकॉल एक्स laevis भ्रूण में premigratory कपाल नेकां explant के लिए एक आसान तकनीक का वर्णन है. इस तरह के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल भ्रूण मजबूत हो और अच्छी तरह से ठीक करने की जरूरत है. अस्वस्थ भ्रूण के किसी भी बैच त्यागें. इसके अलावा, और न बाद में मंच पर 17 तंत्रिका शिखा आबकारी के क्रम में, (12 से 18-20 डिग्री सेल्सियस तक) विभिन्न तापमान पर भ्रूण बढ़ता है. चरण 17 के बाद, तंत्रिका शिखा मस्तक mesoderm के साथ मिलाया जा सकता है और पूरी तरह से हटाया नहीं जा सकता. Xenopus ऊतकों को जल्दी से ठीक है और फिर अन्य ऊतकों को उनके आसंजन ढीला. यह तेजी से काम करते हैं और जैसे ही यह दाता से excised है के रूप में मेजबान में तंत्रिका शिखा explants स्थान के लिए महत्वपूर्ण है.

    इन विट्रो प्रयोगों के विषय में, fibronectin संस्कृति व्यंजन कुछ दिनों के बाद बैक्टीरिया या कवक के साथ दूषित हो सकता है. अक्सर संभव के रूप में एंटीबायोटिक और स्वच्छ या बाँझ सामग्री और समाधान का प्रयोग करें.

    यह प्रक्रिया च अनुकूलित हैया कपाल तंत्रिका शिखा. दरअसल, इस सेल की आबादी अच्छी तरह से परिभाषित और चरण 17 Xenopus भ्रूण में ही सीमित नहीं है. दुर्भाग्य से, इस मॉडल ट्रंक नेकां पर इस तरह के प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए उपयुक्त नहीं है. बर्ड भ्रूण ऐसे ट्रंक नेकां सेल की आबादी को जोड़ तोड़ में दिलचस्पी रखने वाले लोगों के लिए अधिक उपयुक्त हैं.

    इस प्रोटोकॉल में वर्णित explants vivo में इन विट्रो में दोनों, नेकां व्यवहार के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नेकां आणविक विकास कार्यक्रम मोटे तौर पर रीढ़ 19 में संरक्षित है. मेंढक विकास हड्डीवाला नेकां EMT, प्रवास और भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है. एक्स laevis भ्रूण कोशिकाओं किसी भी बाहरी पोषक तत्व के अलावा बिना कई दिनों के लिए इन विट्रो में अपने अस्तित्व की अनुमति के लिए पर्याप्त जर्दी होते हैं. इस प्रकार, इन विट्रो अध्ययन में एक सरल और पूरी तरह से नियंत्रित संस्कृति के माध्यम में, विभिन्न विकास कारकों या रासायनिक यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण कर सकते हैं. इस तरह के प्रयोगों की गई हैयह दृष्टिकोण भी सुधार का निर्देश नेकां भेदभाव प्रोटोकॉल डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता संकेत दे रास्ते, आदि 14,20-24 सक्रिय करने या रोकने का, chemo-attractants या chemo-भगाने के प्रभावों का अध्ययन सहित EMT और प्रवास, विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया. , पुनर्योजी चिकित्सा के लिए प्रोटोकॉल के विकास विविध नेकां व्युत्पन्न प्रकार की कोशिकाओं में इन विट्रो समझने के लिए दवा स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता प्राप्त करने और neurocristopathies 25,26 के इलाज के संदर्भ में.

    नेकां विकास आसपास के ऊतकों से सेल स्वायत्त नियमों और संकेतों के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया द्वारा करवाया जाता है. दाता नेकां में या मेजबान भ्रूण में या तो जीन अभिव्यक्ति की प्रायोगिक जोड़तोड़, नेकां विकास की noncell स्वायत्त पहलुओं से भेदभाव सेल स्वायत्त अनुमति देते हैं. लाभ समारोह के और तोड़े नीचे के संयोजन में इन विट्रो संस्कृति के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए दृष्टिकोण और इन विवो ग्राफ्टिंग में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया हैडी 14,21,23,27-36.

    इस तकनीक को मेजबान भ्रूण में अन्य ऊतकों भ्रष्टाचार और उनके प्रवास और भेदभाव क्षमता के लिए परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. उदाहरण के लिए, हम नेकां विकास के लिए एक न्यूनतम ट्रांसक्रिप्शनल स्विच के लिए देखने के लिए pluripotent blastocoel छत बाहरी झिल्ली ("जानवर टोपी") का इस्तेमाल किया है. हम नेकां प्रतिबद्धता और बाद के विकास पर दो प्रतिलेखन कारक, pax3 और zic1, के प्रभाव का अध्ययन किया है. Pax3 और zic1 लाभ के समारोह के साथ पशु टोपियां विट्रो में फ़ाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया या मेजबान भ्रूण में backgrafted गया. हम Pax3/Zic1-induced कोशिकाओं को विस्थापित और इन विट्रो में और मेजबान भ्रूण 12 में दोनों सदाशयी नेकां कोशिकाओं की तरह में अंतर पाया.

    नेकां EMT और माइग्रेशन कि सरकार कई आणविक तंत्र भी कैंसर 37 में metastatic प्रसार में भी शामिल रहे हैं. इस प्रोटोकॉल को उपलब्ध कराना है एक सरल, सस्ता और efficiविकासात्मक जीव और इन महत्वपूर्ण सेल व्यवहार के बुनियादी तंत्र का पता लगाने के लिए अन्य शोधकर्ताओं के लिए ईएनटी उपकरण.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

    Acknowledgments

    लेखकों उपयोगी विचार विमर्श और Institut क्यूरी के जानवरों की सुविधा के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन, एरिक Theveneau पर explant के चित्रों के लिए Adeline डॉली धन्यवाद. मुख्यमंत्री क्षेत्र Ile डी फ्रांस (Domaine D'Interet Majeur ध्रुव स्टेम), Université पेरिस सूद (अताशे Temporaire डी 'Enseignement एट डे Recherche), और Agence Nationale डे ला Recherche की एक postdoctoral साथी है. इस काम Université पेरिस सूद (Attractivite 2011), केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique (लड़ाई Thematique एट Incitative सुर कार्यक्रम), एसोसिएशन डालना ला Recherche contre Le कैंसर अनुदान SFI20101201882, लीग contre Le कैंसर, और Agence Nationale डे ला द्वारा वित्त पोषित किया गया अति सूक्ष्म (एजेंस Nationale डे ला Recherche कार्यक्रम ब्लैंक).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
    2. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
    3. Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
    4. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
    5. Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
    6. Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
    7. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
    8. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
    9. Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
    10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).
    11. Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
    12. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
    13. Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
    14. Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
    15. Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
    16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
    17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. New York. (1994).
    18. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
    19. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
    20. Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
    21. Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
    22. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    23. Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
    24. Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
    25. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
    26. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
    27. Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
    28. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    29. Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
    30. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
    31. Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
    32. Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
    33. Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
    34. Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
    35. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
    36. Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
    37. Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).

    Tags

    विकास जीवविज्ञान अंक 85 तंत्रिका शिखा, भ्रूण विच्छेदन भ्रष्टाचार फ़ाइब्रोनेक्टिन
    के विच्छेदन<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; तंत्रिका शिखा के लिए<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Explant संस्कृति या<em&gt; में विवो</em&gt; ट्रांसप्लांटेशन
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H.… More

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter