Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dissekering av Published: March 4, 2014 doi: 10.3791/51118
Automatic Translation
1,2,3,4, 1,2,3,4
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Summary

Detta protokoll beskriver hur man dissekera premigratory cranial neural crest (NC) från Xenopus laevis neurulas. Dessa explants kan pläterade på fibronektin-och odlas in vitro, eller ympas tillbaka in embryon värd. Denna teknik gör det möjligt att studera mekanismerna för NC epitel-till-mesenkym övergång, migration och differentiering.

Abstract

Neurallisten (NC) är en övergående rygg neuralrörsdefekter cellpopulation som genomgår en epitel-till-mesenkym övergång (EMT) i slutet av neurulation, vandrar i stor utsträckning mot olika organ, och skiljer i många typer av derivat (nervceller, glia, brosk och ben, pigmenterade och endokrina celler). I detta protokoll, beskriver vi hur man dissekera premigratory cranial NC från Xenopus laevis embryon, för att studera NC utveckling in vivo och in vitro. Grodan modellen erbjuder många fördelar för att studera tidiga utveckling, rikliga satser finns tillgängliga, embryon utvecklas snabbt, in vivo-vinst och förlust av funktionsstrategier tillåter manipulering av genuttryck före NC dissektion i donator och / eller embryon värd. NC explants kan pläterade på fibronektin och som används för in vitro-studier. De kan odlas i flera dagar i ett serumfritt definierat medium. Vi beskriver också hur man ympa NC explants tillbakai värd embryon för att studera NC migration och differentiering in vivo.

Introduction

Neurallisten (NC) är en övergående embryonal cellpopulation som framträder i neuralröret i slutet av neurulation i ryggradsdjur embryon. Signalering och genetiska händelser som styr NC specifikation börja så tidigt som gastrulation. NC specificeras vid gränsen mellan neurala och icke-neural ektoderm av signaler från omgivande rygg vävnader. Vid slutet av neurulation, NC celler genomgår ett epitel till mesenkym övergång (EMT) och migrera i stor utsträckning i embryot följande stereotypa rutter genom att svara på omgivande vägledande cues. När de har nått sin slutdestination, de differentieras till ett brett spektrum av derivat, t.ex. nervceller, glia, ben, brosk och pigmenterade celler 1-5. På grund av deras bidrag till många celltyper och embryonala vävnader, defekter vid varje steg av NC-celler utveckling, från induktion till slutlig differentiering, kan orsaka medfödda syndrom heter neurocristopathies 6. Experimental manipulation av utvecklings NC i olika skeden - specifikationer, EMT, migration och differentiering - kommer att öka vår förståelse av neurocristopathies och möjliggöra utformning av potentiella terapeutiska strategier.

Xenopus laevis embryot är en modell av val att studera NC-utveckling. Ett stort antal embryon är lätt att få, och yttre befruktning ger tillgång till de allra första stegen i utvecklingen. Många verktyg finns tillgängliga för att experimentellt manipulera X. laevis embryonala utvecklingen. Gene vinst-av-funktion och knockdown är lätta att utföra genom microinjecting enskilda celler i tidiga blastulas. Embryonala vävnader kan klippas för in vitro-återförening 7-11 eller back-ympning analyser 12,13.

I detta protokoll, beskriver vi hur man dissekera ut premigratory cranial NC i X. laevis sena neurulas, före migreringen. Dessa explantat kan odlas på fibronektin-coated plattor för att studera migration och differentiering i kontrollerad in vitro experimentella förhållanden. NC explants kan även ympas in i normala eller manipulerade värd embryon för att studera deras migration och differentiering in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experiment uppfyller nationella och EU-förordning om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och med internationella principer för ersättning, begränsning och förfining.

1. Beredning av fibronektinbelagda Rätter 14

  1. Pipettera 500 ml av 10 mg / ml kulturgrad fibronektin utspätt i 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett vanligt plastpetriskål (diameter 40 x 11 mm). Inkubera vid 37 ° C under 1 timme. OBS: Om du använder glas rätter eller täckglas för efterföljande bildbehandling, använd en 100 mg / ml fibronektin lösning.
  2. Skölj tre gånger med 1x PBS.
  3. Ersätt PBS med 500 ml 1x PBS/0.1% bovint serumalbumin (BSA). Inkubera vid 37 ° C under 30 min.
  4. Skölj tre gånger med 1x PBS.
  5. Fyll på med 1x PBS och förvara vid 4 ° C fram till användning (vanligtvis 24-48 timmar).

2. Dissektion av NC Explantat

<ol>
  • Bered 3/4 Normal Amphibian Medium (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCOs 3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml Gentamycin 10,15). Förvara inte mer än 1 vecka för dissektion, förvara vid 4 ° C. Äldre NAM kan användas för framställning av agaros belagda dissektion rätter (nedan).
  • Förbered 60 mm petriskålar för dissektion, belagda med 10 ml 2% agaros i 3/4 NAM.
  • Samla dissektion verktyg: plast Pasteur-pipetter, monterad en finaste insekt stift på stifthållaren (se material tabellen för referens), ett "ögonbryns kniv" (gjord med ögonbryn hår inbäddades i paraffin på spetsen av ett glas pasteurpipett 16), två fina dissektion pincett, P1000 pipett och tips, en kikare stereoskop med förstoring 8-40X till 50, en stark ljuskälla med optiska fibrer guider. Alla dissekera verktyg bör hållas rena, efter varje experiment, skölj dem två gånger med destillerat vatten, när with 100% etanol och låt torka. Förvaras åtskilt från damm.
  • Fyll i dissektion skålen med färsk NAM nästan till toppen.
  • Erhåll X. laevis embryon enligt standardförfaranden 10 och åldras dem tills de når neurula stadium 16 (enligt Nieuwkoop och Faber utvecklings tabell 17).
  • Placera etapp 16 embryon i dissektion skålen med hjälp av plast pasteurpipett.
  • Utför alla efterföljande steg under kikare omfattning. Avlägsna vitellinmembranet med två par av pincett. Var försiktig så att du inte skadar ryggdelen av embryona.
  • Vänta tills embryona har nått stadium 17 för att starta dissekering. Steg 17 är lämpligt, eftersom neurallisten tydligt avskilda från neuralrörsdefekter, till skillnad från tidigare skeden. Efter etapp 17, startar NC migrera och sammanblandning med det omgivande mesenkym.
  • Gräva ett litet hål i agaros med pincett för att göra en nisch för embryona i syfte att upprätthålladem under dissekering. Placera ett embryo ryggsidan uppåt. Anm: modellera kan användas för att bibehålla embryon i stället att gräva ett hål i agarosen.
  • Gör ett snitt i den laterala delen av den främre neurala faldigt med ögonbrynet kniven och insekt pin. Var noga med att inte gå alltför djupt in i embryot: syftar till att skära genom 2-3 cellager (aldrig nå så djupt som archenteron!). Under hela dissekering processen, aldrig låta de dissekerade vävnaderna att komma in i kontakt med luft-vätska gränssnitt sedan X. laevis embryonala vävnader lyseras genom ytspänning.
  • Gör en andra parallell snitt i mer ryggdelen av den neurala faldigt med användning av samma instrument.
  • Om det behövs, vrid skålen runt 90 °. Gör en tredje vinkelrätt snitt med ögonbrynet kniven och insekt stift, vid den bakre sidan av de två första snitten. NC är en tjock massa av celler under det pigmente yttre lagret av ektoderm, lateraltill det neurala röret.
  • Använd spetsen av ögonbrynet kniven för att lossa pigmente ektoderm lagret från underliggande NC, med start från den tredje snittet kanten.
  • Använd den sida av ögonbrynet kniven att lösgöra NC vävnaden med utgångspunkt från det tredje snittet. NC vävnad är ganska gråaktigt, medan den underliggande cephalic mesoderm är vit. Separera försiktigt NC från mesoderm.
  • Lossa NC vävnaden anteriort från den optiska vesikler, och klipp på denna nivå för att frigöra Explantation. Som en kontroll för första experiment, kontroll snail2 uttryck (en kanonisk NC-markör) i vissa explants med in situ hybridisering rekommenderas.

    • 3. Plating Explantat på Fibronektin

    1. Fyll i fibronektin belagda skålen med Modified Danilchick Medium (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mM, K glukonat 4,5 mM, Na glukonat 32 mM, MgSO 4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, justera pH till 8,3 med 1 M Bicine
    2. Överför explantaten till fibronektin-belagda maträtt med hjälp av en P1000 pipett. Låt aldrig explantaten röra luft-vätska gränssnitt. Först pipettera några vätska i spetsen, då explantaten, sedan lite vätska igen. Låt inte någon luft i spetsen under överföring explantaten till fibronektin-belagda maträtt. När spetsen är inuti vätskan i fibronektin-belagda skålen, låt explantaten gå långsamt ned genom tyngdkraften eller tryck mycket försiktigt. Undvik utsprutning explantaten för fort.
    3. Placera 10-30 explantat i skålen med hjälp av ögonbryn kniv. Undvik sidorna av skålen, som inte är tillräcklig för efterföljande avbildning.
    4. Försök inte att flytta skålen tills explantaten har fäst på fibronektin (det tar ca 15-30 min). Vid behov, flytta skålen mycket noggrant.
    5. Placera skålen i en kyld inkubator (mellan 15-20 ° C, för temperaturdiagram se 17). När den placeras vid 15 ° C, cellerna are oftast migrera effektivt och spridning efter 6 timmar av inkubation (denna tidpunkt kan variera mellan experiment).

    4. Ympning Explantat i värd Embryon

    1. Skär ett fint glas täckglas i mycket små bitar med hjälp av grova pincett. Storleken på bitarna bör vara ungefär 1,5 mm 2. Doppa bitarna i en petriskål med 3/4 NAM eller PBS med hjälp av pincett.
    2. Beredning av den mottagande embryot: dissekera ut värd NC i 3/4 NAM som beskrivs i 3) med särskild omsorg att inte skada den mottagande embryot när du tar bort vitellinmembranet och dissekera NC. Vävnads spänning tenderar att öka storleken på ablation: låt värd embryot läka delvis medan dissekera givaren embryot.
    3. I en annan agaros belagd skål eller i en annan del av samma maträtt, dissekera ut NC Explantation från donatorn embryot som beskrivs i protokoll 3. Överför NC transplantat i skålen som innehåller värden med omsorg, så som beskrivs iProtokoll 3.
    4. Placera omedelbart NC Explantation på värdborttagen området med hjälp av pincett. Explantation bör fästa delvis. Sätt en bit glas täckglas på den ympade embryot att bibehålla transplantatet på plats. Välj en glasbit större än embryot för att undvika att skada den. Embryot blir lite tillplattad.
    5. Vänta minst 15-20 minuter, sedan försiktigt bort täckglas. Låt embryot återhämta sig under ytterligare 10 min och försiktigt pipettera den i en ren skål fylld med 3/4 NAM, med hjälp av plast pasteurpipett.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    När pläterade på fibronektin, neurallisten explantat fäster snabbt (15-30 min) och explantatet sprider platt inom 2 tim (Figur 1A). Efter 3-6 tim celler börjar att sprida. Vid 24 h vid 15 ° C, har många celler började att migrera bort från explantatet (figurerna 1B och 1C). Äggula gör cellerna mycket ljus i fas kontrast (Figur 1B). Cellutskott (filopodes och lamellipodes) syns tydligt efter phalloidin färgning av aktin cytoskelettet (Figur 1C).

    För orthotopic ympning experiment donator embryon som injicerats med GFP-mRNA för att kunna följa de ympade cellerna i den omärkta värdembryo. Den kraniala NC var borttagen på en sida av den mottagande; 30-60 min efter kirurgi transplantatet läkt, som ersätter den ablationsbehandlade värd cranial NC (figur 1D, 2 h efter ympning). Några timmar senare, har de GFP-positiva celler migreradeut från explantatet och följde de stereotypa flyttningsvägar för NC-celler mot ventrala kraniofaciala platser (figur 1E). I grodyngel, har NC-härledda kraniofaciala strukturer utvecklas (figur 1G). När kraniell NC var borttagen, var dessa strukturer saknas, vilket leder till kortare ansikte med ögat intill cementkörteln (figur 1H, röda pilar). I ympade grodyngel har donator NC-celler bidrog till kranio-facial strukturer, vilket resulterar i en normal ansikte morfologi (fig. 1F och 1I, gröna pilar).

    Figur 1
    Figur 1. In vitro och in vivo-beteende explanterade cranial NC. AC)   Premigratory NC dissekeradesut från en scen 17 neurula embryo och klädd på ett fibronektin-belagda maträtt. A) 2 timmar efter plätering, har Explantation fäst och spridning. B) 24 timmar efter plätering, har celler effektivt migrerat på fibronektin. C) lamellipodia och filopodia är tydligt i migra NC-celler märkta med phalloidin (grön) DI) Neurula etapp 17 GFP + märkt premigratory NC togs från en GFP-injicerade embryo och back-ympade in i en värd embryo, som kraniell NC var borttagen vid stadium 17. - 18. D) Två timmar efter transplantation har explantatet läkt. EF) ympad NC-celler har aktivt vandrat ut och befolkade den mandibular strömmen som visas i grodyngel skede 31 och 41. G) Kontroll etapp 41 grodyngel. H) ablating NC har resulterade i en dramatisk misslyckande för ansikte och ögon utveckling (H: observera att cement Gland utvecklar intill ögat, på grund av bristen på NC-celler befolka käken områden, röda pilar. . Jämför styra grodyngel i G) F, I) Däremot har de ympade NC cellerna återställda ögon och kraniofaciala strukturer utveckling (F, I, gröna pilar) AC, Skala barer = 100 mm;. DI, Skala bar = 1 mm . D, rygg-vy. EI, sidovyer. Denna siffra har modifierats Milet et al. 12 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Detta protokoll beskriver en enkel teknik för att explantera premigratory cranial NC i X. laevis embryon. De embryon som används för sådana experiment måste vara robust och läker bra. Kassera parti ohälsosamma embryon. Dessutom växer embryon vid olika temperaturer (från 12 till 18 till 20 ° C), i syfte att skära ut neurallisten vid steget 17 och inte senare. Efter etapp 17, kan neurallist blandas med KRANIE mesoderm och kan inte tas bort helt och hållet. Xenopus vävnader läker snabbt och sedan förlorar sin vidhäftning till andra vävnader. Det är viktigt att arbeta snabbt och placera neurallist explantat i värden så snart som den skärs ut från donatorn.

    Beträffande in vitro-experiment, kan fibronektin kultur rätter få förorenat med bakterier eller svampar efter ett par dagar. Använd antibiotika och rena eller sterila material och lösningar så ofta som möjligt.

    Detta förfarande är optimerad feller kranial neurallisten. I själva verket är denna cell population väl definierade och lokaliserad i steget 17 Xenopus embryon. Tyvärr är denna modell inte är lämpligt att utföra sådana experiment på bålen NC. Fågel embryon är mer lämpade för dem som är intresserade av att manipulera en sådan trunk NC cellpopulation.

    De explantat som beskrivs i detta protokoll kan användas för att studera olika aspekter av NC beteende, både in vivo och in vitro. NC molekylära utvecklings program är till stor del bevarad i ryggradsdjur 19. Frog utveckling är en kraftfull modell för att studera ryggradsdjur NC EMT, migration och differentiering. X. laevis embryonala celler innehåller tillräckligt med äggula för att låta deras överlevnad in vitro i flera dagar utan tillsats av någon extern näringsämne. Sålunda kan in vitro studier testa effekterna av olika tillväxtfaktorer eller kemiska föreningar, på ett enkelt och helt kontrollerat odlingsmedium. Sådana försök har varitutformad för att analysera EMT och migration, även studera effekter av kemo-attraherande eller kemo-medel, för att aktivera eller blockera signalvägar etc. 14,20-24 kan också användas för detta tillvägagångssätt för att utforma bättre riktade NC differentieringsprotokoll. I samband med utveckling av protokoll för regenerativ medicin, få olika NC-härledda celltyper in vitro skulle kunna användas i drogscreening för att förstå och behandla neurocristopathies 25,26.

    NC utveckling är iscensatt av ett komplext samspel mellan cell autonoma regler och signaler från omgivande vävnader. Experimentella manipulationer av genuttryck, antingen i givaren NC eller i den mottagande embryot, tillåter diskriminerande cell autonoma från noncell autonoma delar av NC-utveckling. Kombinera gain-of-function och knock-down metoder för detta protokoll för odling in vitro och in vivo ympning har framgångsrikt användad 14,21,23,27-36.

    Denna teknik kan anpassas för att ympa andra vävnader i embryon värd och testa med avseende på deras migrations och differentieringspotentialer. Till exempel har vi använt den pluripotenta blastocoel taket ektoderm (den "djur cap") för att leta efter en minimal transkriptions brytare för NC-utveckling. Vi har studerat effekten av två transkriptionsfaktorer, PAX3 och zic1, på NC engagemang och senare utveckling. Djur mössor med PAX3 och zic1 gain-of-function ströks på fibronektin in vitro eller backgrafted in embryon värd. Vi fann att Pax3/Zic1-induced celler migrera och differentiera som bona fide NC-celler både in vitro och in värd embryon 12.

    Många molekylära mekanismer som styr NC EMT och migration är också involverade i metastaser spridning i cancer 37. Detta protokoll syftar till att tillhandahålla en enkel, billig och efent verktyg för utvecklings-biologer och andra forskare att utforska de grundläggande mekanismerna i dessa viktiga cellbeteenden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna har ingenting att lämna ut.

    Acknowledgments

    Författarna tackar Adeline Dolly för bilderna av Explantation på fibronektin, Eric Theveneau för hjälp diskussioner och Animal Facility av Institut Curie. CM är en forskarassistent i regionen Ile de France (Domaine d'Interet Majeur Stem Pole), Université Paris Sud (Attache Temporaire d'Enseignement et de Recherche), och Agence Nationale de la Recherche. Detta arbete har finansierats av Université Paris Sud (Attractivite 2011), Centre National de la Recherche Scientifique (Action Thematique et Incitative sur Programme), Association pour la Recherche contre le Cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le Cancer, och Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (7), 557-568 (2008).
    2. Theveneau, E., Mayor, R. Neural crest delamination and migration: from epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration. Dev. Biol. 366 (1), 34-54 (2012).
    3. Stuhlmiller, T. J., García-Castro, M. I. Current perspectives of the signaling pathways directing neural crest induction. Cell. Mol. Life Sci. 69 (22), 3715-3737 (2012).
    4. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Neural crest induction at the neural plate border in vertebrates. Dev. Biol. 366 (1), 22-33 (2012).
    5. Pegoraro, C., Monsoro-Burq, A. H. Signaling and transcriptional regulation in neural crest specification and migration: lessons from Xenopus embryos. Dev. Biol. 2 (2), 247-259 (2013).
    6. Etchevers, H. C., Amiel, J., Lyonnet, S. Molecular Bases of Human Neurocristopathies. Neural Crest Induct. Different. 589, 213-234 (2005).
    7. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians. Part II. Differentiation and organization. J. Exp. Zool. 120 (1), 33-81 (1952).
    8. Nieuwkoop, P. D., et al. Activation and organization of the central nervous system in amphibians Part I. Induction and activation. J. Exp. Zool. 120 (1), 1-31 (1952).
    9. Sharpe, C. R., Fritz, A., De Robertis, E. M., Gurdon, J. B. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiation shows the importance of predetermination in neural induction. Cell. 50 (5), 749-758 (1987).
    10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2000).
    11. Monsoro-Burq, A. -H., Fletcher, R. B., Harland, R. M. Neural crest induction by paraxial mesoderm in Xenopus embryos requires FGF signals. Development. 130 (14), 3111-3124 (2003).
    12. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (14), 5528-5533 (2013).
    13. Sadaghiani, B., Thiébaud, C. H. Neural crest development in the Xenopus laevis embryo, studied by interspecific transplantation and scanning electron microscopy. Dev. Biol. 124 (1), 91-110 (1987).
    14. Theveneau, E., et al. Collective chemotaxis requires contact-dependent cell polarity. Dev. Cell. 19 (1), 39-53 (2010).
    15. Slack, J. M., Forman, D. An interaction between dorsal and ventral regions of the marginal zone in early amphibian embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 56, 283-299 (1980).
    16. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
    17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. New York. (1994).
    18. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol. Biol. 769, 449-460 (2011).
    19. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
    20. Alfandari, D., Cousin, H., Gaultier, A., Hoffstrom, B. G., DeSimone, D. W. Integrin α5β1 supports the migration of Xenopus cranial neural crest on fibronectin. Dev. Biol. 260 (2), 449-464 (2003).
    21. Fort, P., et al. Activity of the RhoU/Wrch1 GTPase is critical for cranial neural crest cell migration. Dev. Biol. 350 (2), 451-463 (2011).
    22. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    23. Kashef, J., Köhler, A., Kuriyama, S., Alfandari, D., Mayor, R., Wedlich, D. Cadherin-11 regulates protrusive activity in Xenopus cranial neural crest cells upstream of Trio and the small GTPases. Genes Dev. 23 (12), 1393-1398 (2009).
    24. Hwang, Y. -S., Luo, T., Xu, Y., Sargent, T. D. Myosin-X is required for cranial neural crest cell migration in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 238 (10), 2522-2529 (2009).
    25. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
    26. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling Neural Crest Induction, Melanocyte Specification, and Disease-Related Pigmentation Defects in hESCs and Patient-Specific iPSCs. Cell Reports. 3 (4), 1140-1152 (2013).
    27. Shnitsar, I., Borchers, A. PTK7 recruits dsh to regulate neural crest migration. Development. 135 (24), 4015-4024 (2008).
    28. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135 (10), 1771-1780 (2008).
    29. Matthews, H. K., Broders-Bondon, F., Thiery, J. P., Mayor, R. Wnt11r is required for cranial neural crest migration. Dev. Dyn. 237 (11), 3404-3409 (2008).
    30. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456 (7224), 957-961 (2008).
    31. Guiral, E. C., Faas, L., Pownall, M. E. Neural crest migration requires the activity of the extracellular sulphatases XtSulf1 and XtSulf2. Dev. Biol. 341 (2), 375-388 (2010).
    32. Cousin, H., Abbruzzese, G., Kerdavid, E., Gaultier, A., Alfandari, D. Translocation of the Cytoplasmic Domain of ADAM13 to the Nucleus Is Essential for Calpain8-a Expression and Cranial Neural Crest Cell Migration. Dev. Cell. 20 (2), 256-263 (2011).
    33. Borchers, A., David, R., Wedlich, D. Xenopus cadherin-11 restrains cranial neural crest migration and influences neural crest specification. Development. 128 (16), 3049-3060 (2001).
    34. Borchers, A., Epperlein, H. -H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210 (4), 217-222 (2000).
    35. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Runx2 is essential for larval hyobranchial cartilage formation in Xenopus laevis. Dev. Dyn. 236 (6), 1650-1662 (2007).
    36. Yan, C. Y. I., Skourides, P., Chang, C., Samba Brivanlou, A. a Xenopus hnRNP expressed in neural and neural crest tissues. Dev. Dyn. 238 (1), 204-209 (2009).
    37. Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. J. Clin. Invest. 119 (6), 1438-1449 (2009).

    Tags

    Utvecklingsbiologi Neural crest, Embryo dissektion transplantat fibronektin
    Dissekering av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neural Crest för<em&gt; In vitro</em&gt; Explantation kultur eller<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantation
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H.… More

    Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter