Differential Märkning för cell-ytan och internalis Proteiner efter Antibody Utfodring av Live odlade nervceller
Summary
Vi beskriver en metod för att märka proteiner på ytan av levande neuroner med användning av en specifik polyklonal antikropp mot extracellulära epitoper. Protein bundet av antikroppen på cellytan och därefter intern via endocytos kan särskiljas från protein som återstår på eller trafikerade till, ytan under inkuberingen.
Abstract
För att demonstrera den cellyte-lokalisering av en förmodad transmembranreceptor i odlade neuroner, vi märkt protein på ytan av levande neuroner med en specifik primär antikropp som tagits fram mot en extracellulär del av proteinet. Med tanke på att receptorerna är trafikerade till och från ytan, om cellerna permeabiliserades efter fixering då både cellytan och den inre protein kommer att detekteras av samma märkt sekundär antikropp. Här anpassade vi en metod som används för att studera protein trafficking ("antikropp matning") för att differentiellt etikett proteinet som hade blivit internaliseras av endocytos under antikropp inkubationssteg och protein som antingen varit på cellytan eller trafikerades med ytan under denna period . Förmågan att skilja dessa två pooler av protein blev möjligt genom att införliva en övernattning blockeringssteg med hög-koncentrerad omärkt sekundär antikropp efter en initial incubation av unpermeabilized nervceller med en fluorescensmärkt sekundär antikropp. Efter blockeringssteget, permeabilisering av neuronerna som tillåts detektion av det internaliserade poolen med en fluorescerande sekundär antikropp märkt med en annan fluorofor. Med denna teknik kunde vi få viktig information om subcellulära placeringen av denna förmodade receptor, och avslöjar att det var, ja, smugglas till cellytan i nervceller. Denna teknik är allmänt tillämpbar på en rad olika celltyper och cellyteproteiner, som ger en lämplig antikropp mot en extracellulär epitop är tillgänglig.
Introduction
Vid upprättande av funktionen av nyligen identifierade proteiner, kan utredning av subcellulära lokalisering och handel av proteinet i fråga ge viktiga ledtrådar om den troliga roll / s av proteinet 1,2. Bioinformatisk analys av transcriptome av utvecklings neocortex 3 försett oss med en lista av gener som uppvisar förändrat uttryck under mushjärna corticogenesis. Vi antog då en gen knockout tillvägagångssätt för att fastställa att det protein som kodas av en av dessa gener, sez6, spelar en viktig roll i neuronutveckling. Vi observerade att beslag relaterad gen 6, eller Sez6, protein ligger i utvecklings dendriter och är också närvarande i Dendritutskotten, specialiserade strukturer på dendriter som tar emot och integrera excitatoriska signaler. Dessutom, när detta protein saknas, dendriter och retande synapser misslyckas med att bilda korrekt 4. Den troliga dominerande isoformen av proteinet har funktioner i en transmembrane-receptorn även när subcellulära fördelningen av immunolabeled proteinet undersöktes genom konfokalmikroskopi eller immunelektronmikroskopi mikroskopi de flesta, om inte alla, av signalen visades i samband med små blåsor i somatodendritisk fack med liten, eller ingen, protein märkt på plasmamembranet vid cellytan.
För att slutgiltigt visa att detta förmodade receptorn med en förutsedd stor extracellulär domän trafikeras till plasmamembranet, antog vi en live-cell tillvägagångssätt med användning av antiserum som vi hade genererat till en extracellulär del av proteinet för att märka proteinet på cellytan. Genom att kombinera detta "antikropp matning" strategi med två tillämpningar av differentiellt märkt sekundär antikropp åtskilda av en omfattande blockeringssteg och en permeabilization steg, kunde vi identifiera två olika pooler av protein utmärker sig genom att binda till fluorescerande-märkta sekundära antikroppar som bär olika fluorescerent-taggar. Därmed kunde vi urskilja protein som hade internaliseras av endocytos under antikropps inkuberingssteget från protein som antingen varit på cellytan eller blivit offer för människohandel till ytan under denna period. Med användning av denna metod har vi konstaterat att det intressanta proteinet utsätts för handel till och från cellytan i neuroner. Därför denna relativt snabb och enkel teknik visat sig vara mer informativ än traditionella immunocytokemi metoder eller pre-inbäddning immunoguld elektronmikroskopi, trots det faktum att vi använde samma polyklonalt kaninantiserum för alla dessa tekniker. Denna teknik är allmänt tillämpbar på alla transmembranprotein som en bra antikropp som igenkänner den extracellulära domänen epitoper är tillgänglig. Tekniken har tidigare använts för att studera receptor trafficking av glutamatreceptorn GluR1 subenhet 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den teknik som beskrivs här är komplementär till den hos cellyte-biotinylering (översikt av Arancibia-Carcamo et al.) 12 och det är den metod som föredras för bevarande av information om den subcellulära lokaliseringen av det internaliserade proteinet, förutsatt att en lämplig primär antikropp till en extracellulär epitop är tillgänglig. Dessutom kan utföras kvantifiering av protein trafficking / interna med tiden (genom att fixera täckglas vid olika tidpunkter under hela levande cell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Teele Palumaa för hjälp med figurerna. Finansierat av projektbidrag 1008046 från det nationella hälso-och medicinska forskningsrådet, Australien.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
References
- Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
