Summary
Batrachochytrium dendrobatidis infektion hos amfibier kan elimineras med användning av en reducerad koncentration (0,0025%) och kortare varaktighet (fem minuters bad för sex dagar) av itrakonazol än vad som i allmänhet används. Mindre dödlighet och färre negativa biverkningar observerades med hjälp av denna modifierade behandlingsprotokoll.
Abstract
Groddjur upplever den största nedgången av alla ryggradsdjur klass och en ledande orsak till dessa nedgångar är en svamp patogen, Batrachochytrium dendrobatidis (BD), som orsakar sjukdomen chytridiomycosis. Captive försäkrings kolonier är viktiga över hela världen för hotade groddjursarter och kan vara det enda livlina för dem i kritiska hot om utrotning. Att upprätthålla sjukdomsfri kolonier är en prioritet för fångenskap chefer, har ännu säkra och effektiva behandlingar för alla arter och över livsstadier inte identifierats. Den mest använda kemoterapeutiska behandlingen är itrakonazol, fastän doseringen vanligen används kan vara skadlig för vissa individer och arter. Vi utförde en klinisk prövning behandling för att bedöma om en lägre och säkrare men effektiva dosen av itrakonazol kunde hittas för att bota Bd infektioner. Vi fann att genom att minska behandlingskoncentrationen 0,01 till 0,0025% och minska behandlingstiden från 11-6 Dagar 5 min bad, kunde grodor botas av Bd infektion med färre biverkningar och mindre behandlingsrelaterade dödligheten.
Introduction
Groddjur nu upplever den största förlusten av biologisk mångfald på alla ryggradsdjur taxa 1. Chytridiomycosis, en hudsjukdom som orsakas av de chytrid svamp patogen Batrachochytrium dendrobatidis (BD), är en av de viktigaste orsakerna till dessa dramatiska nedgångar 2 Bd är det sämsta patogenen på rekord för att orsaka förlust av biologisk mångfald:. Den smittar över 600 arter av groddjur och har orsakade nedgångar i över 300 arter, varav så många som 200 arter blivit hotade eller utrotade 2,3. Den amfibie chytrid svampen är inte värd specifik och det är oklart vilka kvaliteter hos värden tillåter Bd infektionen att utvecklas orsaka svår sjukdom. Chytridiomycosis orsakar död genom att störa jonkanaler i huden, vilket resulterar i elektrolytförlust och hjärtsvikt 4. Också, Bd supernatanten (innehållande inga Bd zoosporer) orsakar ett immunsvar i grodyngel 5 leading forskare att tro Bd producerar en toxisk biprodukt 6.
Eftersom många arter minskar snabbt, i fångenskap försäkrings kolonier och avelsprogram är viktiga åtgärder för bevarande, och kan vara det enda livlina för vissa arter. Etablera och upprätthålla sjukdomsfri kolonier är en utmaning för amfibie hanteringsanläggningar. De nuvarande kemoterapeutiska metoder för behandling av Bd-infektioner, även om effektiva, kan vara skadliga för djuren behandlas, och ingen enskild behandlingsmetod har varit framgångsrik inom arter och åldersklasser av amfibier 7.
Några kliniska prövningar av behandlingar för Bd infektion har utförts 7. De tre vanligaste behandlingsmetoderna är värmeterapi, kloramfenikol och itrakonazol. Värmeterapi är en nonchemotherapeutic behandlingsalternativ som verkar ha få biverkningar, kan användas på flera olika livsstadier, och är geneally effektiva. I en behandlings rättegång, Chatfield och Richards-Zawacki 8 visade att 96% av de behandlade djuren hade rensat infektioner efter att ha inrymt vid 30 ° C i 10 dagar. Även om denna studie var inte 100% lyckat, det ger en baslinje för andra att bedöma värmeterapi för sin egen art. Värmeterapi, även effektiv för många arter, är opraktiskt för många alpina arter som inte kan förbli vid höga temperaturer under en längre tidsperiod. Kloramfenikol, ett antibakteriellt, har med framgång använts för att behandla BD i många arter, och inhiberar svamptillväxt in vitro. Som ett antibakteriellt, betyder kloramfenikol inte attackera svampen specifikt men har varit kända för att orsaka apoptos i eukaryota celler 9. Det har spekulerats i att kloramfenikol terapi orsakar apoptos i huden, dödar intracellulär sporangia, även om den exakta verkningsmekanismen är okänd. Även om ingen klinisk prövning har gjorts, och därförDosen och behandlingstiden har inte utvärderats, nuvarande behandlingsprotokoll kräver normalt nedsänkning i två till fyra veckor 10,11, vilket gör denna behandling opraktisk för landlevande groddjur. Kloramfenikol har också begränsad i vissa länder för veterinärt bruk, eftersom människors exponering har förknippats med en sällsynt form av aplastisk anemi 12.
Itrakonazol, en azol svampdödande, är den mest allmänt används för behandling av Bd infektion hos amfibier i fångenskap. Den mest använda protokollet är till bad djur i en 0,01% itrakonazol lösning för fem minuter per dag under 11 dagar i följd. Detta protokoll härrörde från standarder som används för däggdjur administration, och samtidigt effektivt för groddjur, är den inte baserad på kliniska prövningar på groddjur 11,13. Detta protokoll kan orsaka negativa bieffekter i vissa arter, speciellt i släktet Rana och i grodyngel och senare metamorphs 11.Tadpole behandling har varit framgångsrik med hjälp av en mycket lägre koncentration (0,0005%) av itrakonazol, men förknippades med pigmentborttagning 14. Samma koncentration provat på senaste metamorphs och befanns vara misslyckat vid behandling av infektion 15. Eftersom det finns risk för negativa biverkningar med itrakonazol behandling, har en del utövare använt halva den vanliga koncentrationen (0,005%) under 11 dagar i följd och funnit att det är botat Bd infektioner 16.
Den aktuella studien är en sammanfattning av en klinisk behandling studie med itrakonazol till fest Bd infektion 15. Protokollet beskriver ett försök att hitta den lägsta dos och behandlingstid som är både säkra och effektiva för behandling av Bd smittade djur med itrakonazol. Djur som används i denna studie var senaste metamorphs av Gulf Coast paddor, Incilius nebulifer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Godkännande: Denna studie och dess metoder godkändes av Tulane University Animal Användning och skötsel kommittén (protokoll nr 0407.).
1. Test för Bd Infektion
- Svabbar för Bd
- Pinn djur med en steril bomullstopp fem gånger på ventrum, fem gånger på varje lår, varvid varje sida, och varje skänkel för totalt 45 slag. Svabbar är en icke-invasiv metod för provtagning för Bd på amfibie huden.
- Rotera pinnen försiktigt under och mellan slag för att säkerställa den största mängden DNA samlas på pinnen.
- Förvara pinnar i 1,5 ml mikrorör vid -20 ° C.
- DNA-extraktion och qPCR analys
- Utdrag iskt DNA från kompresser med hjälp av en kommersiellt tillgänglig DNA-isolering kit, i enlighet med anvisningarna för djurvävnad.
- Analysera det extraherade DNA med kvantitativ realtids-PCR (qPCR) efter Boyle
- Späd DNA extraktion prover 1:10 med dubbel avjoniserat vatten.
- Lägg 0,7 pl av bovint serumalbumin (BSA) för att förhindra PCR-inhibering.
- Inkludera en intern positiv kontroll i varje prov för att se till PCR inhibition inte påverkar resultatet.
- Kör prover med en positiv och negativ kontroll och en rad utspädnings standarder för att uppskatta zoospore (infektion) belastning.
2. Inokulering
- Kultur Bd
- Förbered trypton-buljong genom att tillsätta 10 g trypton till en L omvänd osmos eller avjoniserat vatten, autoklaverades (121 ° C under 40 min) och fick svalna. När svalnat till 23 ° C, tillsätt 1 ml penicillin-streptomycin.
- Väx Bd stam (JEL411 från J. Longcore, isolerad från Guabal, Panama från en Phyllomedusa lemur) i ett trypton-buljong i sju dagar vid 23 ° C.
- Överför bRoth kultur till trypton och agarplattor.
- För att göra plattor, tillsätt 10 g trypton och 10 g agar till 1 L med omvänd osmos eller avjoniserat vatten och autoklav (121 ° C under 40 min.)
- När autoklave blandningen är kall nog att röra, men innan det stelnar, häll i petriskålar, 1/4-1/3 fullt, i ett laminärt flöde huva.
- När agar har stelnat och svalnat helt, tillsätt 0,5 ml Bd buljong till varje platta och jämnt runt plattan. Låt torka.
- När plattorna inokuleras med Bd zoosporer, tätningsplattor med Parafilm.
- Låt plattorna inkuberas vid 23 ° C under 5-7 dagar. Kontrollera zoospore rörelse för att säkerställa lönsamheten före ympning.
- Flood plattor för zoospore ympning lösning
- Efter 5-7 dagar av Bd inkubation och tillväxt, översvämma varje platta med 5 ml åldern kranvatten och låta zoosporer att komma in i media i 10 min.
- Häll zoospore Drivlina & hjulupphnsion till en bärbar behållare.
- Uppskatta zoospore koncentration med en hemocytometer.
- Späd blandningen till en koncentration av 1 x 10 6 per 3 ml med åldern kranvatten.
- Inokulera djur
- I enskilda 50 ml behållare, ympa varje djur genom att hälla 3 ml ymp blandningen över sin ventrum. Tillåt extra inokulat droppa in i botten av ympning behållaren.
- Varje djur kommer att finnas kvar i ympning behållare för 24 timmar för att säkerställa infektion.
- Efter 24 timmar av ympning, tillbaka djur till enskilda desinficerade terrarier.
- Tillåt infektionen att bygga i två veckor. Bekräfta infektion med svabb och qPCR resultat, och påbörja behandling.
- För Bd-negativa kontroller, översvämning Bd Fria agarplattor med 5 ml åldrarna kranvatten, och håna inokulat djuren med samma metoder som ovan.
3. Behandlingsregim
- Prepare behandlingsbadet
- Lägg 2.50 ml vatten itrakonazol (1% Sporanox oral lösning) till 1 L Amfibie Ringer-lösning (0,0025% itrakonazol - den lägsta effektiva behandlingskoncentration).
- Amphibian Ringer-lösning recept: 1 L omvänd osmos eller avjoniserat vatten, 6,6 g natriumklorid, 0,15 g kaliumklorid, 0,15 g kalciumklorid och 0,2 g natriumbikarbonat. Autoklav lösning (121 ° C i 40 min) och låt svalna till rumstemperatur.
- För 0,01% itrakonazol behandlingskoncentrationen, till 10.00 ml vatten itrakonazol (1% Sporanox oral lösning) till 1 L Amfibie Ringers lösning
- För 0,005% itrakonazol behandlingskoncentrationen, tillsätt 5,00 ml vatten itrakonazol (1% Sporanox oral lösning) till 1 L Amfibie Ringers lösning.
- För BD-positiva och Bd-negativa kontroller, bada djur i Amphibian Ringer-lösning med ingen itrakonazol.
- Lägg 2.50 ml vatten itrakonazol (1% Sporanox oral lösning) till 1 L Amfibie Ringer-lösning (0,0025% itrakonazol - den lägsta effektiva behandlingskoncentration).
- Behandling <ol>
- Placera enskilda groddjur i desinficerade 50 ml behållare med 35 ml av behandlingslösningen.
- Se till djuren är helt täckta i fem minuter genom att försiktigt snurra behållaren.
- Återgå djur till desinficerade terrarier. Upprepa i sex dagar.
- Försöksdjur för Bd infektion på dagen behandlingen påbörjas.
- Försöksdjur för Bd infektion en vecka efter behandling är klar, och en gång i veckan i fyra veckor för att se till infektionen har läkt.
4. Bd som biologiskt riskavfall
- Desinficera individuell terrarier veckovis.
- Nedsänk de Terraria och behandlings behållare i en 10% blekmedelslösning bad.
- Skölj varje blekt container två gånger med rinnande vatten.
- Tillåt behållare för att torka under 24 timmar innan de används igen.
- Bär rena nitrilhandskar vid hantering av djur för att förhindra korskontamineringav Bd patogen. Byt handskar mellan hantering av varje djur.
- Desinficera allt flytande avfall före bortskaffande genom att lösningen på 10% blekmedel.
- Autoklav allt fast avfall som potentiellt exponeras för Bd före avyttring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Itrakonazol behandling ansågs framgångsrikt om alla djur var Bd-negativa fyra veckor efter avslutad behandling. Innan behandlingen påbörjas, två veckor efter ympning var alla Bd-inokulerade djur som var infekterade med en genomsnittlig zoospore belastning på 1,121.7 (± 17,34), medan fyra veckor efter avslutad behandling, BD-positiva kontrolldjur hade ett medelvärde zoospore belastning av 16,765.12 ( ± 14643,08).
Behandling av Incilius nebulifer (n = 15) var framgångsrik med användning av bad i 0,0025% itrakonazol koncentrationen för fem minuter per dag under sex dagar. Detta låg koncentration dos av itrakonazol behandling skilde sig inte signifikant i dödlighet jämfört med Bd-positiva kontroller (Cox regression: χ 2,1 = 2,17, exp (b) = 20,500, p = 0,339) (Figur 1B), många av som överlevde fram till slutet av försöket med Bd infektion.
Baden i 0,0025% itraconazole i 11 dagar, och båda 0,005% och 0,0025% itrakonazol i sex dagar var alla visat sig vara effektiva och säkra behandlingsalternativ (fig. 1A och 1B). Rekommenderad behandlingskoncentrationen och halva koncentrationen för en behandlingslängd på 11 dagar signifikant ökad dödlighet jämfört med Bd-positiva kontroller (Cox regression: 0.01% itrakonazol χ 2,1 = 35,68, exp (b) = 307,54, p <0,01, 0,005% itrakonazol χ 2,1 = 16.17, exp (b) = 9,40 , p <0,01) (Figur 1A). Den 0,01% itrakonazol behandling i 11 dagar orsakade 100% dödlighet i I. nebulifer, och hälften koncentration (0,005% itrakonazol i 11 dagar) orsakade 60% mortalitet (Figur 1A). Obduktion och histopatologi för en liten delmängd av djur som dött under behandlingen utfördes. Inget djur i denna studie dog av chytridiomycosis.
Figur 1. Skillnader i överlevnad över itrakonazol behandlingar 15 (A) Incilius nebulifer:. 11 d. behandling (n = 15 för varje itrakonazol koncentration av 0,01, 0,005, och 0,0025%, n = 17 för Bd-positiva kontrollgruppen och n = 9 för Bd-negativ kontrollgrupp). (B) I. nebulifer: 6 d-behandling (n = 15 för varje itrakonazol koncentration av 0,01, 0,005 och 0,0025%, n = 17 för Bd-positiva kontrollgruppen och n = 9 för Bd-negativa kontrollgruppen). Svarta pilar indikerar den sista behandlingsdagen. Heldragna linjer indikerar överlevnad kontrollgrupper (svart = Bd-positiv, grå = Bd-negativt). Streckade linjer anger överlevnad av itrakonazol behandlingsgrupper (ljusgrå punkter = 0,01%, Medel grå prickar = 0,005%, svarta prickar = 0,0025% itrakonazol). (Denna siffra har modifierats Brannelly et al. 15, Figur 1B och 1C). Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med hjälp av detta protokoll kunde vi på ett säkert och effektivt minska behandlingsdosen och tid för itrakonazol behandling för Bd i amfibier. Den lägsta behandlingsdosen och tid (0,0025% i sex dagar) var en framgångsrik behandling för subkliniskt infekterade I. nebulifer. Effektiviteten i både en lägre dos och behandlingstid visar behovet av kliniska behandlingsstudier för Bd infektion behandlingar, eftersom det finns inga säkra och effektiva behandlingar som kan användas för alla arter och åldersklasser av amfibier.
Dödsorsaken till följd av itrakonazol behandling är okänd vid denna punkt 11. Obduktion och histopatologi utfördes på en liten undergrupp av personer som dog under eller strax efter behandlingsperioden i Brannelly et al. 15 studie. Resultaten av dessa analyser var resultatlösa om dödsorsaken, även om det står klart att inget djur döttav chytridiomycosis. Måttlig autolys inträffade mellan död och exemplar konservering, vilket kan ha påverkat vår förmåga att upptäcka små skillnader mellan behandlingsgrupperna.
Även om detta protokoll stöder existensen av en säker och effektiv behandlingsregim, fler studier som denna måste vara på gång. En andra azol behandling, vorikonazol, har visat sig vara effektiva i att åtminstone en art 18. Voriconazol är mer stabil i en vattenlösning än itrakonazol och har visat sig vara säkra för grodyngel bruk 18. Även om en enda behandling dos itrakonazol och vorikonazol är liknande i prissättningen, är vorikonazol mycket dyrare att köpa än itrakonazol, ledande forskare och fångenskap chefer att välja itrakonazol mer regelbundet. Vid denna tid, har endast en publicerad studie visat på ett effektivt sätt av voriconazol 18. För att påvisa effekt, behöver fler arter som skall trialed.
<p class = "jove_content"> azolantimykotika representerar en typ av svampdödande cytostatika som hämmar svamptillväxt 13. Det finns andra behandlingsmetoder som syftar till att döda den svamppatogen inte bara reducera tillväxten. Bd dödas in vitro vid temperaturer över 28 ° C och värmeterapi syftar till att döda Bd i epidermis. Terbinafinhydroklorid, en alternativ antimykotisk som har varit framgångsrika i att behandla Bd infektion i någon art 19, verkar genom att lys av svampceller. Antimykotika som direkt attackerar patogenen kan vara mer framgångsrika behandlingar, och mer arbete behöver göras för att testa lovande behandlingsalternativ för Bd infektion.Itrakonazol behandling har visat sig vara effektiv i subkliniskt infekterade djur, men behandling av klinisk chytridiomycosis har till stor del misslyckats. Endast en studie hittills 20 har framgångsrikt behandlats obotligt jag lla amfibier och behandlingen med en aggressiv kombination av elektrolyt terapi och kemoterapi. Det behövs framgångsrika behandlingsalternativ för obotligt sjuka djur, framför allt för kritiskt utrotningshotade djur i fångenskap kolonier där skyddet för varje individ är viktig för bevarandet av arten.
Trots att minska dosen och behandlingstiden var framgångsrikt för I. nebulifer, har behandlingen inte har provat på andra arter eller djur med kliniska infektioner. Vissa arter och livsstadier är intoleranta mot itrakonazol behandling, så innan en behandling storskalig ordning bör fångenskap chefer provbehandling på en liten undergrupp av individer för att fastställa säkerhet och effektivitet. Testa de behandlade djuren under minst fyra veckor efter det att behandlingen är nödvändig för att utrota låg infektion 7, och bör genomföras efter varje behandlingsregim.
tält "> Etablera säkra och effektiva behandlingsalternativ för Bd infektioner i fångenskap försäkrings kolonier område prioriteras för amfibie bevarande insatser. Underhålla Bd gratis kolonier är avgörande för framgången för bevarandeinsatser och fångenskap kolonier kan vara den enda livlina för arter på gränsen till utrotning .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Jag vill tacka CL Richards-Zawacki om hjälp konceptualisering av experimentell design och bistå med material, A. Pessier om hjälp om inrättande av en behandlingsregim och obduktion analyser, MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker och D. Lenger om hjälp i laboratorier och stöd och M. McFadden och P. Harlow på Taronga Zoo för användning av deras utrymme under inspelningen. Projektet har delvis finansierats av Louisiana Department of Wildlife och fiske genom Louisiana Environmental Education Commission bidraget till LA Brannelly och Life Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
- Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
- Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
- McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
- Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
- Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
- Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
- Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
- Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
- Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
- Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
- Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
- Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
- Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
- Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
- Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
- Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).
