Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ריכוז Itraconazole מופחת ומשכים מצליחים בטיפול Published: March 14, 2014 doi: 10.3791/51166
Automatic Translation
1
1School of Public Health, Tropical Medicine and Rehabilitation Sciences, James Cook University

Summary

זיהום dendrobatidis Batrachochytrium בדו חיים ניתן למנוע באמצעות ריכוז מופחת (0.0025%) ומשך זמן קצר יותר (אמבטיות של חמש דקות לשישה ימים) של itraconazole מ משמשים בדרך כלל. תמותה ותופעות לוואי שלילי פחות פחות נצפו באמצעות פרוטוקול טיפול שונה זה.

Abstract

דו חיים חווים את הירידה הגדולה ביותר מכל סוג חוליות וגורם מוביל לירידות אלה הוא הפתוגן פטרייתי, dendrobatidis Batrachochytrium (BD), מה שגורם chytridiomycosis המחלה. מושבות הבטחה השבויה חשובות בעולם עבור מיני דוחי מאוימים ועשויות להיות חבל ההצלה רק לאלה באיום קריטי של הכחדה. שמירה על מושבות ללא מחלה היא בראש סדר עדיפויות של מנהלים בשבי, עדיין טיפולים יעילים ובטוחים לכל מינים ובכל שלבי חיים לא זוהו. הטיפול הכימותרפי בשימוש נרחב ביותר הוא itraconazole, אם כי המינון נפוץ יכול להזיק לאנשים מסוימים ומינים. ביצענו ניסוי טיפול קליני להעריך האם מינון נמוך יותר ובטוח יותר, אך אפקטיבי של itraconazole אפשר היה לציין לרפא זיהומי Bd. מצאנו כי על ידי הפחתת ריכוז הטיפול .01-.0025% וצמצום משך הטיפול מ11ימים -6 5 אמבטיות דקות, צפרדעים יכולים להירפא של זיהום Bd עם תופעות לוואי ותמותה הקשורים לטיפול פחות פחות.

Introduction

דו חיים כיום חווים את הירידה הגדולה ביותר במגוון הביולוגי של כל מיני חוליות 1. Chytridiomycosis, מחלת עור הנגרמת על ידי פטריית dendrobatidis chytrid Batrachochytrium הפתוגן (BD), היא אחד מהגורמים העיקריים לירידות הדרמטיות הללו 2 BD הוא פתוגן הגרוע ביותר על שיא בגרימת אובדן מגוון ביולוגי:. זה מדביק מעל 600 מינים של דו חיים ויש לו גרם לירידות בלמעלה -300 מינים, מתוכם רבים ככל 200 מינים הפכו בסכנת הכחדה או שנכחד 2,3. פטריית chytrid דוחי לא לארח ספציפית ולא ברור מה איכויות של המארח לאפשר לזיהום Bd להתקדם ולגרום למחלות קשות. Chytridiomycosis גורם למוות ע"י שיבוש תעלות יונים בעור, וכתוצאה מכך אובדן אלקטרוליטים ואי ספיקת לב 4. כמו כן, supernatant Bd (לא מכיל zoospores BD) גורם לתגובה חיסונית בראשנים 5 leadinחוקרים גרם להאמין Bd מייצר רעיל תוצר 6.

מכיוון שמינים רבים הם במהירות בירידה, מושבות אבטחה בשבי ותוכניות רבייה הן אמצעי שימור חשוב, ועשויות להיות חבל ההצלה רק לכמה מינים. הקמת ותחזוקה של מושבות ללא מחלה היא אתגר עבור מתקני דוחי ניהול. השיטות כימותרפיות הנוכחיות לטיפול בדלקות BD, למרות יעיל, יכולות להזיק לבעלי החיים שטופלו, ואין שיטת טיפול אחת הייתה מוצלחת בין זנים וסוגים של דו חיים גיל 7.

מספר מחקרים קליניים של טיפולים לזיהום Bd בוצעו 7. שלוש שיטות הנפוצות ביותר של טיפול הן טיפול בחום, כלורמפניקול וitraconazole. טיפול בחום הוא אפשרות טיפול nonchemotherapeutic שנראה שיש מעט תופעות לוואי, ניתן להשתמש בם בשלבי חייו מרובים, והוא generברית יעילה. בניסוי טיפול, Chatfield וריצ'רדס-זאוואצקי 8 מצאו כי 96% מבעלי החיים שטופלו פינו זיהומים לאחר ששוכן ב30 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים. למרות שהמשפט הזה לא היה 100% מוצלח, זה מספק בסיס לאחרים כדי להעריך טיפול בחום למיניהם. טיפול בחום, אם כי יעיל למינים רבים, אינו מעשי עבור מינים רבים אלפיני שלא יכול להישאר בטמפרטורות גבוהות לזמן ממושך. כלורמפניקול, אנטיבקטריאלי, שמש בהצלחה לטיפול בBd במינים רבים, ומעכב את צמיחת פטרייה במבחנה. כאנטיבקטריאלי, כלורמפניקול לא לתקוף את הפטרייה באופן ספציפי, אבל כבר ידוע לגרום לאפופטוזיס בתאי אוקריוטים 9. זה כבר העריך כי טיפול כלורמפניקול גורם אפופטוזיס בעור, הרג המנבגים תאיים, למרות שמנגנון פעולה המדויק אינו ידוע. למרות שאף ניסוי קליני כבר נערך, ולכןמינון וזמן טיפול לא הוערכו, פרוטוקולי טיפול הנוכחיים בדרך כלל דורשים טבילה לשבועות עד ארבעה שבועות 10,11, מה שהופך את הטיפול הזה מעשי עבור דו חיים יבשתיים. כלורמפניקול גם היה מוגבל במדינות מסוימות לשימוש וטרינרים כי חשיפה של בני אדם נמצאת קשורה לצורה נדירה של אנמיה אפלסטית 12.

Itraconazole, פטריות azole, היא בשימוש נרחב ביותר לטיפול בזיהום בBd דו חיים בשבי. הפרוטוקול הנפוץ ביותר הוא חיות רחצה בפתרון itraconazole 0.01% במשך חמש דקות ביום במשך 11 ימים רצופים. פרוטוקול זה נגזר מסטנדרטים המשמשים לניהול של יונקים, ו, בעוד יעיל לדו חיים, הוא אינו מבוסס על ניסויים קליניים בדו חיים 11,13. פרוטוקול זה יכול לגרום לתופעות לוואי שליליות במינים מסוימים, במיוחד בסוג רנא ובראשנים וmetamorphs האחרון 11.טיפול ראשן היה מוצלח באמצעות ריכוז נמוך בהרבה (0.0005%) של itraconazole, אבל היה קשור עם depigmentation 14. ריכוז זהה זה trialed על metamorphs האחרון ונמצא כי הוא נכשל בטיפול בזיהום 15. מכיוון שקיימת סיכון לתופעות לוואי שלילי עם טיפול itraconazole, כמה מתרגלים השתמשו מחצית הריכוז הרגיל (0.005%) ל11 ימים רצופים ומצאו את זה כדי להיות מוצלח בריפוי דלקות Bd 16.

המחקר הנוכחי הוא סיכום של ניסוי קליני לטיפול באמצעות itraconazole לטיפול בזיהום Bd 15. הפרוטוקול מתאר ניסיון למצוא את הזמן וטיפול במינון הנמוך ביותר שהוא גם בטוח ויעיל לטיפול בבעלי חיים נגועים Bd עם itraconazole. בעלי חיים המשמשים במחקר זה היו metamorphs האחרון של קרפדות חוף מפרץ, Incilius nebulifer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישור אתיקה: מחקר זה והשיטות שלה אושרו על ידי הוועדה של אוניברסיטת טוליין שימוש בבעלי חיים ובטיפול (פרוטוקול לא 0407.).

1. בדיקות לזיהום Bd

  1. בניקוי עבור BD
    1. בעלי חיים ספוגית עם מקלון צמר גפן סטרילי חמש פעמים בventrum, חמש פעמים בכל ירך, מכל צד, וכל איבר בסכום כולל של 45 שבץ. בניקוי הוא שיטה לא פולשנית של דגימה עבור BD על עור של דוחי.
    2. בעדינות לסובב את ספוגית בזמן ובין שבץ על מנת להבטיח את הכמות הגדולה ביותר של ה-DNA שנאספה בספוגית.
    3. מטליות חנות ב1.5 מיליליטר microtubes ב -20 ° C.
  2. הפקת DNA וassay qPCR
    1. תמצית ה-DNA הגנומי מהמטליות באמצעות ערכת בידוד DNA זמינה מסחרי, בהתאם להוראות לרקמות בעלי חיים.
    2. נתח את ה-DNA שחולץ באמצעות זמן אמת PCR (qPCR) הבאה בויל 17, בשינויים הבאים.:
    3. לדלל דגימות מיצוי DNA 1:10 עם מים כפולים deionized.
    4. הוספת 0.7 μl של אלבומין בסרום שור (BSA) על מנת למנוע עיכוב ה-PCR.
    5. כולל שליטה פנימית חיובית בכל דגימה כדי להבטיח עיכוב PCR לא משפיע על תוצאות.
    6. דגימות לרוץ עם ביקורת חיובית ושלילית ושורה של סטנדרטים דילול להעריך עומס zoospore (זיהום).

2. חיסון

  1. תרבות Bd
    1. הכן מרק tryptone ידי הוספת tryptone 10 גרם לאוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized, autoclaved (121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות) ונותנת לו להתקרר. ברגע שהתקרר ל23 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מיליליטר פניצילין, סטרפטומיצין.
    2. לגדול זן BD (JEL411 מג' Longcore, מבודד מGuabal, פנמה ממור Phyllomedusa) במרק tryptone במשך שבעה ימים ב23 ° C.
  2. העבר את bרוט התרבות לtryptone וצלחות אגר.
    1. כדי להפוך את הצלחות, להוסיף 10 tryptone גרם ו10 אגר גרם לאוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized וחיטוי (121 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות).
    2. ברגע שתערובת autoclaved הוא מגניב מספיק כדי לגעת, אבל, לפני שהוא נקרש לשפוך לתוך צלחות פטרי, 1/4-1/3 מלאים, בזרימה למינרית.
    3. כאשר אגר נקרש והתקררתי לחלוטין, להוסיף 0.5 מיליליטר מרק Bd לכל צלחת ולהתפשט באופן שווה סביב הצלחת. לאפשר לו להתייבש.
    4. לאחר הצלחות מחוסנת עם zoospores BD, צלחות חותם עם Parafilm.
    5. לאפשר צלחות לדגירה על 23 מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים. בדוק zoospore תנועה כדי להבטיח את הכדאיות לפני החיסון.
  3. צלחות מבול לפתרון חיסון zoospore
    1. לאחר חמישה עד שבעה הימים של הדגירה Bd וצמיחה, להציף כל צלחת עם 5 מיליליטר של מים ברז בגילים ולאפשר zoospores להיכנס לתקשורת ל10 דקות.
    2. יוצקים את suspe zoosporension לתוך מיכל נייד.
    3. מעריך ריכוז zoospore עם hemocytometer.
    4. לדלל תערובת לריכוז של 1 x 10 6 ל3 מיליליטר עם מי ברז בגילים.
  4. לחסן חיות
    1. ב50 מיליליטר מכלים נפרדים, לחסן כל חיה על ידי שפיכת 3 תערובת הבידוד מיליליטר מעל ventrum. אפשר לבידוד נוסף כדי לטפטף לתוך הבסיס של מיכל החיסון.
    2. כל בעל חיים יישארו במכל חיסון ל24 שעות כדי להבטיח זיהום.
    3. לאחר 24 שעות של חיסון, להחזיר חיות לTerraria חיטוי הבודד.
    4. לאפשר זיהום לבנות במשך שבועיים. לאשר זיהום עם ספוגית ותוצאות qPCR, ולהתחיל בטיפול.
    5. עבור פקדים BD-שליליים, צלחות אגר מבול BD-חופשי עם 5 מיליליטר בגילי מים ברז, ולחסן מדומה בעלי החיים משתמשים באותן השיטות כאמור לעיל.

3. טיפול משטר

  1. תכשיריםמחדש אמבטיה טיפול
    1. הוספת 2.50 מיליליטר itraconazole מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון 1 של L אמפיבי רינגר (itraconazole 0.0025% - ריכוז הטיפול היעיל הנמוך ביותר).
      1. המתכון של דוחי רינגר פתרון: אוסמוזה ההפוכה או 1 ליטר מים deionized, נתרן כלורי 6.6 גרם, 0.15 אשלגן כלורי גרם, 0.15 כלוריד הסידן גרם, ו0.2 סודיום ביקרבונט גרם. פתרון החיטוי (C ° 121 ל40 דקות) ולהתקרר לטמפרטורת חדר.
      2. ל0.01% ריכוז טיפול itraconazole, להוסיף itraconazole 10.00 מיליליטר מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון של 1 L אמפיבי רינגר
      3. ל0.005% ריכוז טיפול itraconazole, להוסיף 5.00 מיליליטר itraconazole מימיים (1% אוראלי פתרון Sporanox) לפתרון של 1 L אמפיבי רינגר.
    2. עבור פקדים BD-חיוביים ו-BD-שליליים, לרחוץ בעלי חיים בפתרון של אמפיבי רינגר ללא itraconazole.
  2. טיפול <ol>
  3. הנח דו חיים בודדים ב50 מיליליטר מכולות לחטא עם 35 מיליליטר של פתרון הטיפול.
  4. בעלי החיים להבטיח מכוסים במלואן במשך חמש דקות על ידי בעדינות מתערבל מיכל.
  5. להחזיר חיות לTerraria חיטוי. חזור על פעולה במשך שישה ימים.
  • להבטיח את הצלחה של טיפול
    1. בעלי החיים מבחן לזיהום Bd על טיפול היום מתחילים.
    2. בעלי חיים מבחן לזיהום Bd שבוע לאחר סיום טיפול, ופעם בשבוע במשך ארבעה שבועות כדי להבטיח זיהום יש פינה.

    • 4. BD כBiohazard

    1. לחטא שבועי Terraria בודד.
      1. להתרחץ מכולות Terraria וטיפול ב10% אמבטיה פתרון אקונומיקה.
      2. יש לשטוף את כל מיכל מולבן פעמיים עם מים זורמים.
      3. לאפשר מכולות להתייבש במשך 24 שעות לפני שימוש חוזר.
    2. ללבוש כפפות nitrile נקיות בעת טיפול בבעלי חיים על מנת למנוע זיהום צולבשל הפתוגן Bd. שינוי כפפות בין טיפול בכל בעלי חיים.
    3. לחטא את כל הפסולת נוזלית לפני סילוק על ידי הבאת הפתרון לאקונומיקת 10%.
    4. החיטוי כל הפסולת מוצקה כי הוא עלול להיות חשוף לBd לפני הסילוק.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    טיפול Itraconazole נחשב מוצלח אם כל בעלי החיים היו BD-שליליים ארבעה שבועות לאחר הטיפול הסתיים. לפני הטיפול החל, כשבועיים לאחר החיסון, כל בעלי החיים מחוסן-BD היו נגועים, עם מטען ממוצע zoospore של 1,121.7 (± 17.34), בעוד ארבעה שבועות לאחר הטיפול הסתיים, חיות בקרת BD-החיוביות היו עומס zoospore ממוצע של 16,765.12 ( ± 14643.08).

    הטיפול בIncilius nebulifer (n = 15) היה מוצלח באמצעות אמבטיות ב0.0025% ריכוז itraconazole לחמש דקות ביום במשך שישה ימים. מינון ריכוז נמוך זה של טיפול itraconazole לא היה שונה באופן משמעותי בתמותה בהשוואה לקבוצת ביקורת BD-החיובית (רגרסיה קוקס: χ 2,1 = 2.17, exp (ב) = 20,500, p = 0.339) (איור 1), רבות של שלהם שרד עד תום הניסוי עם זיהום Bd.

    אמבטיות של i 0.0025% traconazole 11 ימים, ושניהם 0.005% וitraconazole 0.0025% במשך שישה ימים היו כל נמצאו כיעיל ואפשרויות טיפול בטוחות (איורים 1 א ו 1 ב '). ריכוז המומלץ על הטיפול ומחצית ריכוז שלאורך טיפול ב11 ימים גדל באופן משמעותי תמותה בהשוואה לקבוצת ביקורת BD-החיובית (רגרסיה קוקס: itraconazole 0.01% χ 2,1 = 35.68, exp (ב) = 307.54, p <0.01; itraconazole 0.005% χ 2,1 = 16.17, exp (ב) = 9.40 , P <0.01) (איור 1 א). 0.01% טיפול itraconazole 11 ימים גרם לתמותת 100% בט nebulifer, ומחצית הריכוז ש( itraconazole 0.005% ל11 ימים) גרם לתמותת 60% (איור 1 א). נתיחה לאחר המוות וhistopathology לקבוצה קטנה של בעלי חיים שמתו במהלך הטיפול נערכו. אין חיה במחקר זה מתה מchytridiomycosis.

    n-page = "תמיד"> איור 1
    איור 1. הבדלים בהישרדות על פני טיפולי itraconazole 15 () Incilius nebulifer:. טיפול 11 ד (n = 15 עבור כל ריכוז itraconazole של 0.01, 0.005, ו0.0025%, n = 17 לקבוצת ביקורת BD-החיובית וn = 9 עבור קבוצת ביקורת BD-שלילית). א (ב) nebulifer: טיפול 6 ד (n = 15 עבור כל ריכוז itraconazole של 0.01, 0.005 ו0.0025%, n = 17 לקבוצת ביקורת BD-החיובית וn = 9 בקבוצת ביקורת BD-השלילית). חיצים שחורים מציינים את היום האחרון של טיפול. קווים מלאים מצביעים על קיומן של קבוצות שליטה (שחור = BD-חיובי, אפור = BD-שלילי). קווים שבורים מצביעים הישרדות של קבוצות טיפול itraconazole (נקודות אפורות בהירות = 0.01%, נקודות אפורות בינוניות = 0.005%, נקודות שחורות = itraconazole 0.0025%). (נתון זה שונה מBrannelly et al. 15, איור 1B ו 1C). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    שימוש בפרוטוקול זה היינו יכול בצורה בטוחה ויעיל להפחית את מינון טיפול ובזמן טיפול itraconazole עבור BD ב דו חיים. המינון הנמוך ביותר לטיפול והזמן (0.0025% במשך שישה ימים) היה טיפול מוצלח לט הנגוע subclinically nebulifer. היעילות של שני מינונים נמוכים יותר וזמן טיפול להדגים את הצורך בניסויים קליניים לטיפול לטיפולי זיהום BD, כפי שיש כיום אין טיפולים יעילים ובטוחים לשימוש לכל המינים ומעמדות גיל של דו חיים.

    סיבת המוות כתוצאה מטיפול itraconazole אינה ידועה ב11 נקודה זו. נתיחה לאחר המוות וhistopathology נערכו בקבוצה קטנה של אנשים שמתו במהלך או מייד לאחר תקופת הטיפול במחקר Brannelly et al. 15. תוצאות של ניתוחים אלו היו חד משמעיות באשר לסיבת מוות, למרות שברור ששום חיה מתשל chytridiomycosis. autolysis המתון התרחש בין המוות ושימור דגימה, שאולי השפיע על היכולת שלנו לזהות הבדלים דקים בין קבוצות טיפול.

    למרות שפרוטוקול זה תומך בקיומו של משטר טיפול אחד בטוח ויעיל, יותר ניסויים כמו זה צריכים להיות דרך. טיפול שני azole, voriconazole, הוכח כיעיל בלפחות מין אחד 18. Voriconazole הוא יציב יותר בפתרון מים מאשר itraconazole והוכח כבטוחים לשימוש בראשן 18. למרות מינון טיפול יחיד של itraconazole וvoriconazole דומה בתמחור, voriconazole הוא הרבה יותר יקר לרכישה מ itraconazole, מה שמוביל חוקרים והמנהלים בשבי לבחור itraconazole יותר באופן קבוע. בשלב זה, רק מחקר אחד שפורסם הוכיח את היעילות של voriconazole 18. כדי להדגים את היעילות, יותר מינים צריכים להיות trialed.

    <antifungals כיתת p = "jove_content"> azole מייצגת סוג של כימותרפיה נגד פטריות אחד המעכבים את צמיחת פטריית 13. ישנן שיטות טיפול אחרות שמטרתם להרוג את הפתוגן פטרייתי ולא רק להפחית את הצמיחה. Bd הוא נהרג במבחנה בטמפרטורות מעל 28 ° C וטיפול בחום שואף להרוג Bd באפידרמיס. hydrochloride טרבינאפין, פטריות חלופיות, שהיו מוצלח בטיפול בזיהום Bd בכמה מינים 19, עובד על ידי גרימת תמוגה של התאים פטרייתי. Antifungals כי ישירות לתקוף את הפתוגן יכולה להיות טיפולים מוצלחים יותר, ועוד עבודה שצריכה להיעשות על מנת לבדוק אפשרויות טיפול מבטיחות לזיהום Bd.

    טיפול Itraconazole הוכח כיעיל בבעלי חיים נגועים subclinically, אבל הטיפול בchytridiomycosis הקליני כבר במידה רבה ללא הצלחה. רק מחקר אחד לתאריך 20 טיפל בהצלחה סופני i דו חיים ll, והטיפול כרוך שילוב אגרסיבי של טיפול באלקטרוליט וכימותרפיה. אפשרויות טיפול מוצלחות לבעלי חיים חולים במחלה סופנית יש צורך, במיוחד לבעלי חיים בסכנה הכחדה במושבות בשבי שבו הגנה של כל אדם היא חיונית לשימור המינים.

    למרות הפחתת המינון וזמן הטיפול הייתה מוצלחת עבור I. nebulifer, הטיפול לא trialed על מינים או בעלי חיים אחרים עם זיהומים קליניים. מינים אחדים ושלבי חיים הם סובלניים של טיפול itraconazole, אז לפני שהחלת משטר טיפול בקנה מידה גדולה, מנהלים בשבי צריכים טיפול ניסוי בקבוצה קטנה של אנשים כדי לקבוע את בטיחות ויעילות. בדיקת בעלי החיים שטופלו במשך לפחות ארבעה שבועות לאחר השלמת הטיפול יש צורך להבטיח מיגור הזיהום ברמה הנמוכה 7, וצריכה להיות מיושמת אחרי כל משטר טיפול.

    אוהל "> הקמת אפשרויות טיפול בטוחות ויעילה לטיפול בדלקות Bd בעדיפות אזור מושבות הבטחה השבוי למאמצי שימור דו חיים. שמירה על מושבות בחינם Bd היא חיונית להצלחה של מאמצי שימור ומושבות בשבי עשוי להיות חבל ההצלה היחידה למינים על סף הכחדה .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחבר מצהיר שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

    Acknowledgments

    אני רוצה להודות לCL ריצ'רדס-זאוואצקי לעזרת המשגה תכנון הניסוי וסיוע עם חומרים, א Pessier לעזרת הקמת משטר טיפול ונתיחה לאחר מות ניתוחים, MWh Chatfield, MJ Robak, ק טסקר וד 'לנגר לעזרה ב מעבדה ותמיכה ומ 'מקפאדן ופ הארלו בגן החיות Taronga לשימוש במרחב שלהם במהלך צילומים. הפרויקט מומן בחלקו על ידי מחלקת לואיזיאנה של חיות הבר ודיג באמצעות מענק ועדת החינוך הסביבתי לואיזיאנה העניק ללוס אנג'לס Brannelly ועל ידי חיים טכנולוגיים.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox Janssen Pharmaceutica Inc.
    NaCl Fisher Scientific S640-500
    KCl Fisher Scientific BP366-1
    CaCl2 Fisher Scientific BP510-100
    NaHCO3 Fisher Scientific BP328-500
    Sterile cotton swabs Medical and Wire Equipment MW113
    1.5 ml Microtubes Sarstedt 73.703.217
    Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69581
    7500 Real-time PCR Applied Biosystems 4351104
    VIC IPC Applied Biosystems 4308323
    BSA Applied Biosystems AM2618
    Agar Invitrogen 30391023
    Tryptone Invitrogen Q10029
    Penicillin-streptomycin Invitrogen 15070-063
    Petri Dish Sigma Aldrich CLS430589

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
    2. Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
    3. Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
    4. Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
    5. Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
    6. McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
    7. Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
    8. Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
    9. Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
    10. Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
    11. Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
    12. Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
    13. Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
    14. Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
    15. Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
    16. Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
    17. Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
    18. Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
    19. Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
    20. Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).

    Tags

    אימונולוגיה גיליון 85, Itraconazole chytridiomycosis מושבות ביטחון שבויים שימור דו חיים
    ריכוז Itraconazole מופחת ומשכים מצליחים בטיפול<em&gt; Dendrobatidis Batrachochytrium</em&gt; זיהום בדו
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Brannelly, L. A. Reduced… More

    Brannelly, L. A. Reduced Itraconazole Concentration and Durations Are Successful in Treating Batrachochytrium dendrobatidis Infection in Amphibians. J. Vis. Exp. (85), e51166, doi:10.3791/51166 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter