Summary
Batrachochytrium dendrobatidis infezione anfibi può essere eliminato con una concentrazione ridotta (0,0025%) e di breve durata (bagni cinque minuti per sei giorni) di itraconazolo che viene generalmente utilizzato. Meno mortalità e meno effetti collaterali negativi sono stati osservati con questo protocollo di trattamento modificata.
Abstract
Anfibi stanno vivendo il più grande declino di qualsiasi classe vertebrati e una delle principali cause di questi cali è un patogeno fungino, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), che causa la malattia chytridiomycosis. Colonie di assicurazione in cattività sono importanti a livello mondiale per minacciate specie di anfibi e possono essere l'unica ancora di salvezza per chi minaccia di critico di estinzione. Mantenere malattia colonie libere è una delle priorità di manager in cattività, non sono stati identificati ancora trattamenti sicuri ed efficaci per tutte le specie e in tutta le fasi della vita. Il trattamento chemioterapico più utilizzato è itraconazolo, sebbene il dosaggio comunemente utilizzato può essere dannoso per alcuni individui e specie. Abbiamo eseguito uno studio di trattamento clinico per valutare se una dose più bassa e più sicuro, ma efficace di itraconazolo potrebbe essere trovato per curare le infezioni Bd. Abbiamo trovato che riducendo la concentrazione trattamento ,01-,0025% e ridurre la durata del trattamento da 11Giorni -6 di 5 min bagni, rane potevano essere curate di infezione Bd con meno effetti collaterali e meno la mortalità associata al trattamento.
Introduction
Gli anfibi sono attualmente vivendo la più grande diminuzione della biodiversità di tutti i taxa vertebrati 1. Chitridiomicosi, una malattia della pelle causata dai chytrid fungine dendrobatidis patogeno Batrachochytrium (BD), è una delle principali cause di questi cali drammatici 2 Bd è l'agente patogeno peggior record per causare la perdita di biodiversità:. Che infetta oltre 600 specie di anfibi e ha causato cali oltre 300 specie, di cui ben 200 specie sono diventate in pericolo di estinzione o estinti 2,3. Il chytrid fungo anfibio non è ospite specifico e non è chiaro quali sono le qualità di accoglienza permettono di infezione Bd progredire causando gravi malattie. Chitridiomicosi provoca la morte interrompendo canali ionici nella pelle, con conseguente perdita di elettroliti e insufficienza cardiaca 4. Inoltre, Bd surnatante (contenente nessun zoospore BD) provoca una risposta immunitaria in girini 5 leading ricercatori a credere Bd produce un sottoprodotto tossico 6.
Poiché molte specie sono in rapido declino, le colonie di garanzia e programmi di allevamento in cattività sono importanti misure di conservazione, e possono essere l'unica ancora di salvezza per alcune specie. Stabilire e mantenere la malattia colonie liberi è una sfida per le strutture di gestione anfibi. Gli attuali metodi chemioterapici per il trattamento di infezioni Bd, anche se efficace, possono essere nocivi per gli animali in trattamento, e nessun metodo singolo trattamento ha avuto successo tra le specie e le classi di età di anfibi 7.
Pochi studi clinici di trattamenti per l'infezione Bd sono stati effettuati 7. I tre metodi più comunemente usati di trattamento sono la terapia del calore, cloramfenicolo e itraconazolo. Terapia del calore è un'opzione di trattamento nonchemotherapeutic che sembra avere pochi effetti collaterali, possono essere utilizzati in più fasi della vita, ed è generalleato efficace. In uno studio di trattamento, Chatfield e Richards-Zawacki 8 hanno trovato che il 96% degli animali trattati aveva eliminato le infezioni dopo essere stato ospitato a 30 ° C per 10 giorni. Anche se questo studio non era al 100% di successo, fornisce una base per gli altri a valutare la terapia del calore per loro stessa specie. Terapia del calore, anche se efficace per molte specie, è impraticabile per molte specie alpina che non possono rimanere a temperature elevate per un periodo di tempo prolungato. Cloramfenicolo, un antibatterico, è stato usato con successo per trattare Bd in molte specie, e inibisce la crescita di funghi in vitro. Come antibatterico, il cloramfenicolo non attacca il fungo specificamente ma è stato conosciuto per causare apoptosi in cellule eucariotiche 9. È stato ipotizzato che la terapia cloramfenicolo provoca apoptosi nella pelle, uccidendo sporangi intracellulare, sebbene l'esatto meccanismo di azione non è noto. Anche se nessuno studio clinico è stato condotto, e quindidose e la durata del trattamento non sono stati valutati i protocolli di trattamento correnti in genere richiedono l'immersione per due a quattro settimane 10,11, rendendo questo trattamento impraticabile per gli anfibi terrestri. Cloramfenicolo è stato limitato in alcuni paesi per uso veterinario perché l'esposizione umana è stata associata con una rara forma di anemia aplastica 12.
Itraconazolo, un antimicotico azolici, è il più utilizzato per il trattamento di infezioni Bd in anfibi in cattività. Il protocollo più usato è animali balneazione in una soluzione itraconazolo 0,01% per cinque minuti al giorno per 11 giorni consecutivi. Questo protocollo è stato derivato dagli standard utilizzati per la somministrazione dei mammiferi, e, pur efficace per gli anfibi, non si basa su studi clinici in anfibi 11,13. Questo protocollo può causare effetti collaterali negativi in alcune specie, soprattutto nel genere Rana e in girini e recenti Metamorphs 11.Trattamento Tadpole ha avuto successo con una concentrazione molto più bassa (0,0005%) di itraconazolo, ma è stato associato alla depigmentazione 14. Questa stessa concentrazione è stata trialed sui recenti Metamorphs e trovato ad essere riuscita a trattare l'infezione 15. Perché non vi è rischio di effetti collaterali negativi del trattamento con itraconazolo, alcuni praticanti hanno usato una metà la solita concentrazione (0,005%) per 11 giorni consecutivi e abbiamo trovato questo per avere successo nella cura delle infezioni Bd 16.
Il presente studio è la sintesi di una sperimentazione clinica di trattamento con itraconazolo per trattare l'infezione Bd 15. Il protocollo descrive un tentativo di trovare la dose e il tempo di trattamento più basso che sia sicuro ed efficace per il trattamento Bd animali infetti con itraconazolo. Animali utilizzati in questo studio sono stati recenti Metamorphs di rospi Gulf Coast, Incilius nebulifer.
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Protocol
Etica di omologazione: Questo studio e dei suoi metodi sono stati approvati da Usa e cura degli animali commissione di Tulane University (prot 0407.).
1. Test per Bd infezione
- Tamponamento per Bd
- Animali tampone con un tampone di cotone sterile cinque volte sul ventre, cinque volte su ogni coscia, ogni lato e ogni arto per un totale di 45 colpi. Swabbing è un metodo non invasivo di campionamento per Bd sulla pelle degli anfibi.
- Ruotare delicatamente il tampone durante e tra i tratti di assicurare la maggiore quantità di DNA viene raccolto sul tampone.
- Conservare tamponi in 1,5 ml microtubi a -20 ° C.
- Estrazione del DNA e analisi qPCR
- Estrarre DNA genomico dai tamponi utilizzando un kit di isolamento di DNA disponibile in commercio, in conformità con le istruzioni per tessuti animali.
- Analizzare il DNA estratto utilizzando quantitativa in tempo reale PCR (qPCR) a seguito di Boyle
- Diluire i campioni di estrazione del DNA 01:10 con doppio acqua deionizzata.
- Aggiungere 0,7 ml di sieroalbumina bovina (BSA) per impedire l'inibizione PCR.
- Includere un controllo interno positivo in ogni campione per garantire l'inibizione della PCR non interessano i risultati.
- Campioni familiare con un controllo positivo e negativo e una serie di norme di diluizione per stimare zoospore (infezione) di carico.
2. Inoculazione
- Cultura Bd
- Preparare triptone brodo aggiungendo 10 g di triptone a 1 L osmosi inversa o acqua deionizzata, in autoclave (121 ° C per 40 min) e lasciato raffreddare. Una volta raffreddata a 23 ° C, aggiungere 1 ml di penicillina-streptomicina.
- Grow ceppo Bd (JEL411 da J. Longcore, isolata dal Guabal, Panama da un Phyllomedusa lemure) in un brodo triptone per sette giorni a 23 ° C.
- Trasferire il broth cultura Triptone e piastre di agar.
- Per rendere piastre, si aggiungono 10 g di triptone e 10 g di agar per 1 L osmosi inversa o acqua deionizzata e autoclave (121 ° C per 40 min).
- Una volta che l'impasto autoclavato è abbastanza fresco al tatto, ma prima che si rapprende, versare in piastre di Petri, 1/4-1/3 pieno, in una cappa a flusso laminare.
- Quando agar ha congelato e raffreddato completamente, aggiungere 0,5 ml Bd brodo per ogni piastra e diffondere uniformemente attorno alla piastra. Lasciare asciugare.
- Una volta che le piastre vengono inoculate con zoospore Bd, piastre di tenuta con parafilm.
- Lasciare le piastre a incubare a 23 ° C per 5-7 giorni. Controllare zoospore movimento per garantire la vitalità prima dell'inoculazione.
- Piastre di inondazione per la soluzione di inoculazione zoospore
- Dopo i 5-7 giorni di Bd incubazione e di crescita, inondare ogni piatto con 5 ml di acqua di rubinetto invecchiata e permettono zoospore di entrare media per 10 min.
- Versare il Sosp zoosporension in un contenitore portatile.
- Stimare la concentrazione zoospore con un emocitometro.
- Diluire miscela ad una concentrazione di 1 x 10 6 per 3 ml con acqua del rubinetto invecchiata.
- Seminare animali
- In singoli 50 ml contenitori, inoculare ogni animale versando 3 miscela inoculo ml sul suo ventre. Lasciare inoculo supplementare gocciolare nella base del contenitore inoculazione.
- Ogni animale rimarrà in contenitore inoculazione per 24 ore per garantire infezione.
- Dopo 24 ore di inoculazione, ritorno animali ai singoli terrari disinfettati.
- Lasciare l'infezione di costruire per due settimane. Confermare l'infezione con tampone e risultati qPCR, e iniziare il trattamento.
- Per i controlli Bd-negativi, alluvioni Bd-libero piastre di agar con 5 ml di età compresa tra acqua di rubinetto, e inoculare finto gli animali con le stesse modalità di cui sopra.
3. Regime di trattamento
- Prepare bagno di trattamento
- Aggiungere 2,50 ml di itraconazolo acquosa (1% Sporanox soluzione orale) per 1 Soluzione L Anfibio Ringer (0,0025% itraconazolo - la concentrazione trattamento efficace più bassa).
- Anfibio di Ringer Soluzione ricetta: 1 L osmosi inversa o acqua deionizzata, cloruro 6,6 g di sodio, 0,15 g di cloruro di potassio, 0,15 g di cloruro di calcio, e 0,2 g di bicarbonato di sodio. Soluzione autoclave (121 ° C per 40 min) e lasciarla raffreddare fino a temperatura ambiente.
- Per la concentrazione trattamento itraconazolo 0,01%, aggiungere 10,00 ml di itraconazolo acquosa (1% Sporanox soluzione orale) di Soluzione 1 L Anfibio Ringer
- Per il 0,005% di concentrazione trattamento itraconazolo, aggiungere 5,00 ml di itraconazolo acquosa (1% Sporanox soluzione orale) di Soluzione 1 L Anfibio di Ringer.
- Per i controlli Bd-positivi e Bd-negativi, fare il bagno animali in soluzione di Ringer Anfibio senza itraconazolo.
- Aggiungere 2,50 ml di itraconazolo acquosa (1% Sporanox soluzione orale) per 1 Soluzione L Anfibio Ringer (0,0025% itraconazolo - la concentrazione trattamento efficace più bassa).
- Trattamento <ol>
- Mettere singoli anfibi in disinfettati 50 ml contenitori con 35 ml di soluzione di trattamento.
- Assicurarsi che gli animali sono completamente coperti per cinque minuti agitando delicatamente il contenitore.
- Animali Ritorno a terrari disinfettati. Ripetere l'operazione per sei giorni.
- Animali di laboratorio per l'infezione Bd sul trattamento giorno comincia.
- Animali di laboratorio per l'infezione Bd una settimana dopo finiture di trattamento, e una volta a settimana per quattro settimane per assicurare scomparsa dell'infezione.
4. Bd come Biohazard
- Disinfettare individuale terrari settimanale.
- Fare il bagno terrari e trattamento contenitori in un bagno di candeggina soluzione al 10%.
- Risciacquare ogni contenitore sbiancato due volte con acqua corrente.
- Lasciare contenitori asciugare per 24 ore prima di riutilizzarli.
- Indossare guanti di nitrile per maneggiare gli animali per evitare la contaminazione incrociatadi Bd patogeno. Cambiare i guanti tra gestione di ogni animale.
- Disinfettare tutti i rifiuti liquidi prima dello smaltimento portando la soluzione al 10% di candeggina.
- Autoclave tutti i rifiuti solidi che è potenzialmente esposto a Bd prima dello smaltimento.
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Representative Results
Trattamento Itraconazolo è stato considerato di successo se tutti gli animali fossero Bd-negativi quattro settimane dopo la fine del trattamento. Prima del trattamento iniziato, due settimane dopo l'inoculazione, tutti gli animali Bd-inoculati sono stati infettati, con un carico zoospore media di 1,121.7 (± 17,34), mentre quattro settimane dopo la fine del trattamento, gli animali di controllo Bd-positivi avevano carico una media zoospore di 16,765.12 ( ± 14643,08).
Trattamento di Incilius nebulifer (n = 15) ha avuto successo con bagni in 0,0025% concentrazione di itraconazolo per cinque minuti al giorno per sei giorni. Questo basso dosaggio concentrazione di itraconazolo trattamento non differiva in modo significativo la mortalità rispetto ai controlli Bd-positivi (Cox di regressione: χ 2,1 = 2.17, exp (b) = 20.500, p = 0,339) (Figura 1B), molti dei quale sopravvisse fino alla fine del processo con l'infezione Bd.
Terme di 0,0025% itraconazole per 11 giorni, ed entrambi 0,005% e 0,0025% itraconazolo per sei giorni sono risultati tutti essere efficace e opzioni di trattamento sicuro (Figure 1A e 1B). La concentrazione trattamento raccomandato e metà concentrazione per una lunghezza di trattamento di 11 giorni significativamente aumentato la mortalità rispetto ai controlli Bd-positivi (Cox di regressione: 0.01% itraconazolo χ 2,1 = 35,68, exp (b) = 307,54, p <0,01; 0,005% itraconazolo χ 2,1 = 16,17, exp (b) = 9.40 , p <0,01) (Figura 1A). Il trattamento itraconazolo 0,01% per 11 giorni ha causato una mortalità del 100% in I. nebulifer, e la metà di quella concentrazione (0,005% itraconazolo per 11 giorni) ha causato il 60% di mortalità (Figura 1A). L'autopsia e l'esame istopatologico per un piccolo sottoinsieme di animali morti durante il trattamento sono stati condotti. Nessun animale in questo studio è morto di chytridiomycosis.
Figura 1. Differenze nella sopravvivenza attraverso trattamenti itraconazolo 15 (A) Incilius nebulifer: 11 d. Trattamento (n = 15 per ciascuna concentrazione di itraconazolo 0,01, 0,005 e 0,0025%, n = 17 per il gruppo di controllo positivo e Bd-n = 9 per l' gruppo di controllo Bd-negativo). (B) I. nebulifer: 6 d trattamento (n = 15 per ciascuna concentrazione di itraconazolo 0,01, 0,005 e 0,0025%, n = 17 per il gruppo di controllo positivo e Bd-n = 9 per il gruppo di controllo Bd-negativo). Frecce nere indicano l'ultimo giorno di trattamento. Le linee continue indicano la sopravvivenza di gruppi di controllo (nero = Bd-positivo, grigio = Bd-negativo). Linee tratteggiate indicano sopravvivenza dei gruppi di trattamento itraconazolo (punti grigi chiari = 0,01%, Punti grigi medi = 0,005%, punti neri = 0,0025% itraconazolo). (Questa cifra è stata modificata da Brannelly et al. 15, Figura 1B e 1C). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Usando questo protocollo siamo stati in grado di ridurre in modo sicuro ed efficace la dose di trattamento e il tempo di trattamento itraconazolo per Bd in anfibi. La dose di trattamento più basso e il tempo (0,0025% per sei giorni) è stato un trattamento efficace per I. subclinicamente infetti nebulifer. L'efficacia di entrambi una dose più bassa e il tempo di trattamento dimostrare la necessità di studi clinici di trattamento per i trattamenti di infezione Bd, in quanto attualmente non esistono trattamenti sicuri ed efficaci da utilizzare per tutte le specie e classi di età di anfibi.
La causa della morte derivante dal trattamento itraconazolo è sconosciuta a questo punto 11. Autopsia e istopatologia stati condotti su un piccolo sottoinsieme di individui morti durante o subito dopo il periodo di trattamento nello studio Brannelly et al. 15. I risultati di queste analisi sono stati inconcludenti per la causa della morte, anche se è chiaro che nessun animale è mortodi chytridiomycosis. Autolisi Moderato avvenuta tra la morte e la conservazione dei campioni, che può aver colpito la nostra capacità di rilevare le sottili differenze tra i gruppi di trattamento.
Sebbene questo protocollo supporta l'esistenza di un regime di trattamento sicuro ed efficace, più prove come questo devono essere in corso. Un secondo trattamento azolici, voriconazolo, ha dimostrato di essere efficace in almeno una specie 18. Voriconazolo è più stabile in soluzione acquosa di itraconazolo e ha dimostrato di essere sicuri per l'uso girino 18. Anche se una singola dose di trattamento di itraconazolo e voriconazolo sono simili nel prezzo, voriconazolo è molto più costoso per l'acquisto di itraconazolo, autorevoli ricercatori e manager in cattività per scegliere itraconazolo più regolarmente. In questo momento, solo uno studio pubblicato ha dimostrato l'efficacia di voriconazolo 18. Per dimostrare l'efficacia, più specie devono essere sperimentati.
<antimicotici p class = "jove_content"> azolici rappresentano un tipo di chemioterapia antifungino che inibiscono la crescita fungina 13. Ci sono altri metodi di trattamento che mirano a uccidere il patogeno fungino piuttosto che ridurre la crescita. Bd viene ucciso in vitro a temperature superiori a 28 ° C e la terapia del calore mira a uccidere Bd nell'epidermide. Terbinafina cloridrato, un antifungino alternativo che ha avuto successo nel trattamento dell'infezione Bd in alcune specie 19, funziona da causare la lisi delle cellule fungine. Antimicotici che attaccano direttamente l'agente patogeno potrebbe essere trattamenti più efficaci, e più lavoro deve essere fatto per testare le opzioni di trattamento promettente per l'infezione Bd.Trattamento itraconazolo ha dimostrato di essere efficace in animali infettati subclinica, ma il trattamento di chytridiomycosis clinica ha ampiamente avuto successo. Solo uno studio ad oggi 20 ha trattato con successo i terminali anfibi LL, e il trattamento prevede una combinazione di terapia aggressiva elettroliti e chemioterapia. Sono necessarie opzioni di trattamento di successo per gli animali malati terminali, soprattutto per gli animali in pericolo critico in colonie in cattività dove la protezione di ogni individuo è essenziale per la conservazione della specie.
Sebbene riducendo la dose e tempo di trattamento ha avuto successo per I. nebulifer, il trattamento non è stata trialed su altre specie o animali con infezioni cliniche. Alcune specie e le fasi della vita sono intolleranti del trattamento itraconazolo, quindi prima di applicare un regime di trattamento su larga scala, i manager in cattività dovrebbero trattamento di prova su un piccolo sottoinsieme di individui per determinare la sicurezza e l'efficacia. Test animali trattati per almeno quattro settimane dopo il completamento del trattamento è necessarie all'eradicazione dell'infezione basso livello 7, e dovrebbe essere attuata dopo ogni regime di trattamento.
tenda "> Stabilire opzioni di trattamento sicuro ed efficace per le infezioni BD priorità prigioniero zona colonie di garanzia per gli sforzi di conservazione degli anfibi. Mantenere Bd colonie libere è essenziale per il successo degli sforzi di conservazione e di colonie in cattività possono essere l'unica ancora di salvezza per le specie sull'orlo dell'estinzione .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L'autore dichiara interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Vorrei ringraziare CL Richards-Zawacki aiuto concettualizzare il disegno sperimentale e l'assistenza con materiali, A. Pessier aiuto che istituisce un regime di trattamento e di necroscopia analisi, MWH Chatfield, MJ Robak, K. Tasker e D. Lenger aiuto per la laboratorio e di supporto e M. McFadden e P. Harlow allo zoo di Taronga per l'utilizzo del loro spazio durante le riprese. Il progetto è stato parzialmente finanziato dalla Louisiana Department of Wildlife and Fisheries attraverso la concessione Louisiana Environmental Education Commissione assegnato a Los Angeles Brannelly e Life Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
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