Summary
Batrachochytrium dendrobatidis инфекции у земноводных могут быть устранены с помощью пониженную концентрацию (0,0025%) и короткую продолжительность (пять минут ванны для шести дней) итраконазола, чем обычно используется. Менее смертность и меньше негативных побочных эффектов наблюдались с помощью этого протокола модифицированный лечения.
Abstract
Амфибии испытывают наибольшее снижение любого класса позвоночных и основной причиной этих снижения является грибковая патоген, Batrachochytrium dendrobatidis (BD), что приводит к chytridiomycosis заболевания. Пленные колонии обеспечения важны во всем мире под угрозой видов амфибий и может быть единственным спасательным кругом для тех, кто в критической угрозой исчезновения. Поддержание болезни бесплатно колонии является одним из приоритетов в неволе менеджеров, пока безопасные и эффективные методы лечения всех видов и через стадиях жизни не были идентифицированы. Наиболее широко используется химиотерапевтическое лечение итраконазол, хотя дозировка обычно используется может быть вредным для некоторых особей и видов. Мы провели испытания клинического лечения для оценки, может ли быть найден ниже и безопаснее, но эффективная доза итраконазола вылечить Bd инфекций. Мы обнаружили, что за счет снижения концентрации лечения от 0.01-0.0025% и сокращения продолжительности лечения с 11-6 Дней 5 мин ванны, лягушки могут быть излечены от Bd инфекции с меньшим количеством побочных эффектов и менее связанной с лечением смертности.
Introduction
Амфибии в настоящее время испытывают наибольшее сокращение биоразнообразия всех позвоночных таксонов 1. Chytridiomycosis, кожное заболевание вызвано хитридиевых грибковых патогенов Batrachochytrium dendrobatidis (BD), является одним из основных причин этих резкое снижение 2 Bd является худшим патоген на запись за причинение утраты биоразнообразия:. Он заражает более 600 видов амфибий и имеет вызвало снижение более чем 300 видов, из которых целых 200 видов стали на грани исчезновения или вымершие 2,3. Амфибия хитридиевых грибок не пройдет конкретных и неясно, какие качества хозяина позволяют Bd инфекции, чтобы прогрессировать в результате чего тяжелые заболевания. Chytridiomycosis приводит к смерти, нарушая ионные каналы в коже, что приводит к потере электролита и сердечной недостаточности 4. Кроме того, Bd супернатант (не содержащий Bd зооспор) вызывает иммунный ответ у головастиков 5 leadinг исследователи верить Bd производит токсичный побочный продукт 6.
Потому что многие виды которых резко сокращается, в неволе колонии обеспечения и селекционные программы являются важными меры по сохранению и может быть единственным спасательным кругом для некоторых видов. Установление и поддержание болезни бесплатно колонии является проблемой для амфибий объектов управления. Нынешние химиотерапевтические способы лечения Bd инфекции, хотя и эффективны, могут быть вредны для животных проходят лечение, и ни один метод единственного метода лечения был успешным у разных видов и возрастных классов амфибий 7.
Несколько клинических испытаний лечения Bd инфекции были выполнены 7. Три наиболее часто используемые методы лечения термотерапия, хлорамфеникол и итраконазол. Тепловая терапия является nonchemotherapeutic вариант лечения, который, кажется, имеет мало побочных эффектов, можно использовать на нескольких этапах жизни, и, вообще говорясоюзником эффективным. В исследовании лечения, Chatfield и Ричардс-Заваки 8 обнаружили, что 96% из обработанных животных рассеялся инфекции после того, как размещены при 30 ° С в течение 10 дней. Хотя этот процесс не был на 100% успешным, он обеспечивает основу для других, чтобы оценить тепла терапию для своего вида. Тепловая терапия, хотя и эффективны в течение многих видов, непрактично для многих горных пород, что не может оставаться при высоких температурах в течение продолжительного периода времени. Хлорамфеникол, антибактериальный, успешно используется для лечения Bd у многих видов, и ингибирует рост грибков в пробирке. В качестве антибактериальных, хлорамфеникол не разрушает грибок конкретно, но, как известно, вызывают апоптоз в клетках эукариот 9. Было предположение, что хлорамфеникол терапия вызывает апоптоз в коже, убив внутриклеточный спорангии, хотя точный механизм действия неизвестен. Хотя ни клинических испытаний не проводилось, и поэтомудоза и время обработки не были оценены, текущие протоколы лечения обычно требуют погружение в течение двух-четырех недель 10,11, что делает это лечение нецелесообразно для наземных амфибий. Хлорамфеникол также ограничен в некоторых странах для ветеринарного применения, потому что воздействие на человека было связано с редкой формой апластической анемии 12.
Итраконазол, азоловый противогрибковое, является наиболее широко используется для лечения Bd инфекции у амфибий в неволе. Наиболее широко используемый протокол для купания животных в 0,01% раствора итраконазола в течение пяти минут в день в течение 11 дней подряд. Этот протокол был получен из стандартов, используемых для управления млекопитающих, и, в то время как в силу для земноводных, она не основана на клинических испытаниях в амфибий 11,13. Этот протокол может вызвать негативные побочные эффекты у некоторых видов, особенно в рода Rana и в головастиков и последние оборотнями 11.Лечение Головастик был успешным использованием значительно более низкую концентрацию (0,0005%) итраконазола, но был связан с депигментации 14. Это же концентрация была опробована на последние оборотнями и признано неудачным при лечении инфекции 15. Потому что есть риск негативных побочных эффектов с итраконазол лечения, некоторые практикующие использовали половину обычной концентрации (0,005%) в течение 11 дней подряд и этот, чтобы быть успешным в лечении BD инфекциями 16.
Настоящее исследование представляет собой резюме судебного разбирательства клинического лечения с использованием итраконазола для лечения Bd инфекции 15. Протокол описывает попытку найти наименьшее время дозы и лечения, который является одновременно безопасным и эффективным для лечения Bd зараженных животных итраконазолом. Животные, используемые в этом исследовании, были недавние Metamorphs из Gulf Coast жаб, Incilius nebulifer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Утверждение Этика: Это исследование и его методы были утверждены животных по эксплуатации и уходу комитета Tulane университета (протокол не 0407.) По.
1. Тестирование на Bd инфекции
- Свабирование для Bd
- Swab животные с стерильной ватной палочкой в пять раз по ventrum, пять раз на каждом бедре, с каждой стороны, и каждой конечности в общей сложности 45 ударов. Свабирование является неинвазивным методом отбора проб для Bd на амфибии кожи.
- Плавно поворачивайте тампон во время и между ударами, чтобы обеспечить наибольшее количество ДНК собрались на тампоном.
- Храните тампоны в 1,5 мл микропробирок при -20 ° С.
- ДНК Добыча и КПЦР анализ
- Извлечение геномной ДНК из мазков, используя имеющийся в продаже набор для выделения ДНК, в соответствии с инструкциями для ткани животного.
- Анализ извлеченной ДНК с использованием количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР) после Бойл
- Развести образцы выделения ДНК 1:10 с двойным деионизированной воды.
- Добавить 0,7 мкл бычьего сывороточного альбумина (BSA), чтобы предотвратить ингибирование ПЦР.
- Включать внутренний положительный контроль в каждом образце, чтобы обеспечить ингибирование ПЦР не влияя на результаты.
- Запуск образцы с положительным и отрицательным контролем и серии стандартов разбавления для оценки зооспора (инфекция) нагрузку.
2. Прививка
- Культура Bd
- Подготовка триптон бульон, добавив 10 г триптона до 1 л обратного осмоса или деионизированной воды, выдерживают в автоклаве (121 ° C в течение 40 мин) и давали остыть. После охлаждения до 23 ° С, добавить 1 мл пенициллин-стрептомицин.
- Расти Bd напряжение (JEL411 от Дж. Longcore, изолированных от Guabal, Панама из Phyllomedusa лемура) в триптон бульоне в течение семи дней при 23 ° С
- Перенести бРот культуры, чтобы триптон и агаром.
- Чтобы тарелки, добавить 10 г триптона и 10 г агара на 1 л обратного осмоса или деионизированной воды и автоклаве (121 ° С в течение 40 мин).
- После того, как в автоклаве смесь достаточно прохладно на ощупь, но, прежде чем он застывает, разлить в чашки Петри, 1/4-1/3 полный, в ламинаре.
- Когда агара застыла и охлаждается полностью, добавить 0,5 мл Bd бульон на каждую пластину и равномерно вокруг плиты. Дайте высохнуть.
- После того, как планшеты засевают Bd зооспор, печать пластин с парафильмом.
- Разрешить пластины для инкубации при 23 ° С в течение пяти-семи дней. Проверьте зооспора движение, чтобы обеспечить жизнеспособность перед прививкой.
- Наводнение пластины для зооспор решения прививки
- После пяти-семи дней от Bd инкубации и роста, затопить каждую тарелку с 5 мл в возрасте водопроводной водой и дайте зооспоры, чтобы войти в СМИ в течение 10 мин.
- Вылейте зооспор suspension в портативный контейнер.
- Оцените концентрации зооспор с гемоцитометре.
- Развести смесь до концентрации 1 × 10 6 в 3 мл возрасте водопроводной воды.
- Привить животных
- В отдельных 50 мл контейнеров, привить каждого животного путем заливки 3 мл посевной смеси над его ventrum. Разрешить дополнительный посевной капать в основание прививки контейнера.
- Каждое животное будет оставаться в контейнере инокуляции в течение 24 ч, чтобы обеспечить заражение.
- Через 24 часа прививки, вернуться животных к отдельным вылеченных террариумов.
- Разрешить инфекция построить в течение двух недель. Подтверждение инфекции с тампоном и результаты КПЦР, и начать лечение.
- Для Bd-отрицательных контролей, наводнения Bd без агаром с 5 мл в возрасте водопроводную воду, и макет привить животных с использованием тех же методов, что и выше.
3. Режим лечения
- Prepaповторно лечения ванной
- Добавить 2,50 мл водного итраконазол (1% Sporanox Раствор для приема внутрь) до 1 Решение L амфибия Рингера (0,0025% итраконазол - самая низкая эффективная концентрация лечение).
- Амфибия раствор Рингера рецепт: 1 L обратный осмос или деионизированная вода, хлорид натрия 6,6 г, 0,15 г хлорида калия, 0,15 г хлорида кальция и 0,2 г бикарбоната натрия. Автоклав раствор (121 ° C в течение 40 мин) и дать остыть до комнатной температуры.
- Для 0,01%-ной концентрации итраконазол лечения, добавьте 10.00 мл водного итраконазол (1% Sporanox Раствор для приема внутрь), чтобы решение 1 л амфибия Рингера
- Для итраконазол концентрации лечения 0,005%, добавить 5,00 мл водного итраконазол (1% Sporanox Раствор для приема внутрь), чтобы решение 1 л амфибия Рингера.
- Для Bd-положительных и Bd-отрицательных контролей, купать животных в растворе амфибия Рингера, не итраконазола.
- Добавить 2,50 мл водного итраконазол (1% Sporanox Раствор для приема внутрь) до 1 Решение L амфибия Рингера (0,0025% итраконазол - самая низкая эффективная концентрация лечение).
- Лечение <ол>
- Место отдельных амфибий в вылеченных 50 мл контейнеры с 35 мл обрабатывающего раствора.
- Обеспечить животные полностью покрываются в течение пяти минут, осторожно вращая контейнер.
- Вернуться животных вылеченных террариумов. Повторите в течение шести дней.
- Экспериментальные животные для Bd инфекции на день обращения начинается.
- Экспериментальные животные для Bd инфекции через неделю после отделки лечения, и один раз в неделю в течение четырех недель по обеспечению инфекции освободится.
4. Bd как Biohazard
- Лечить индивидуальный террариумов еженедельно.
- Купайтесь в террариумах и лечения контейнеров в 10% раствор отбеливателя ванной.
- Промыть каждую беленой контейнер дважды с проточной водой.
- Разрешить контейнеры высохнуть в течение 24 часов перед повторным использованием.
- Надевайте чистые нитриловые перчатки при обращении с животными, чтобы предотвратить перекрестное загрязнениеиз Bd патогена. Изменение перчатки между обработке каждого животного.
- Лечить все жидкие отходы перед захоронением, принося решение 10% гипохлоритом натрия.
- Автоклав все твердые отходы, которые может понести Bd перед удалением.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Итраконазол лечение считался успешным, если все животные были Bd-отрицательных четыре недели после лечения, закончившийся. Перед началом лечения началось, через две недели после прививки, все Bd-привитых животных были заражены, со средним зооспор нагрузки 1,121.7 (± 17,34), в то время как четыре недели после окончания лечения, BD-положительные контрольные животные имели средний зооспор нагрузку 16,765.12 ( ± 14643,08).
Лечение Incilius nebulifer (п = 15) был успешным использованием ванны в 0,0025% итраконазол концентрации в течение пяти-минут в день в течение шести дней. Это низкая концентрация дозировка итраконазол лечения достоверно не различались в смертности по сравнению с BD-положительных контролей (Кокс регрессии: χ 2,1 = 2,17, ехр (б) = 20,500, р = 0,339) (рис. 1В), многие из которых дожили до окончания судебного разбирательства с Bd инфекции.
Ванны 0.0025% Яtraconazole в течение 11 дней, и оба 0,005% и 0,0025% итраконазол в течение шести дней были все признаны эффективными и безопасными варианты лечения (рис. 1А и 1В). Рекомендуемая концентрация лечение и вдвое меньше, чем концентрация на длину лечения 11 дней значительно увеличился смертности по сравнению с BD-положительных контролей (Кокс регрессии: 0,01% итраконазола χ 2,1 = 35,68, EXP (B) = 307,54, р <0,01; 0,005% итраконазола χ 2,1 = 16,17, EXP (B) = 9,40 , р <0,01) (рис. 1А). 0,01% итраконазол лечение в течение 11 дней вызвало 100% смертность в I. nebulifer, и вдвое меньше, чем концентрация (0,005% итраконазол в течение 11 дней), вызванных 60% смертности (рис. 1А). Были проведены вскрытия и гистопатология для небольшой группы животных, которые умерли во время лечения. Ни одно животное в этом исследовании не умер от chytridiomycosis.
Рисунок 1. Различия в выживаемости через итраконазола лечения 15 (а) Incilius nebulifer:. 11 г лечение (n = 15 для каждой концентрации итраконазол 0,01, 0,005, и 0,0025%, N = 17 для BD-положительной контрольной группы и п = 9 для Bd-группа отрицательного контроля). (B) I. nebulifer: 6 д лечение (n = 15 для каждого итраконазол концентрации 0,01, 0,005 и 0,0025%, N = 17 для BD-положительной контрольной группы и п = 9 для Bd-отрицательной контрольной группы). Черные стрелки указывают в последний день лечения. Сплошные линии показывают выживание контрольных группах (черный = Bd-положительных, серый = Bd-отрицательный). Пунктирные линии указывают выживание итраконазола группах (светло-серый точки = 0,01%, Средние серые точки = 0,005%, черные точки = 0.0025% итраконазол). (Эта цифра была изменена с Brannelly др.. 15, рис 1б и 1в). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя этот протокол мы смогли безопасно и эффективно уменьшить дозу лечения и время итраконазол лечения Bd у амфибий. Самая низкая доза и время (0,0025% в течение шести дней) лечение было успешным лечение бессимптомно инфицированных I. nebulifer. Эффективность как более низкой дозе и времени обработки свидетельствуют о необходимости клинических испытаний лечения для Bd инфекции лечение, так как в настоящее время нет безопасные и эффективные методы лечения, которые будут использоваться для всех видов и возрастных классов амфибий.
Причиной смерти в результате итраконазол лечения неизвестна на данный момент 11. Вскрытие и гистопатология проводились на небольшой группе людей, которые умерли во время или вскоре после периода лечения в Brannelly др.. 15 исследования. Результаты этих анализов были неубедительными относительно причины смерти, хотя ясно, что ни одно животное не умериз chytridiomycosis. Умеренный автолиз произошло между смертью и сохранения образца, которые могли повлиять на нашу способность обнаруживать тонкие различия между группами лечения.
Хотя этот протокол поддерживает существование одной безопасной и эффективной схемы лечения, больше испытаний, подобные этому должны быть в стадии реализации. Второй азол лечение, вориконазол, было продемонстрировано, чтобы быть эффективным в по меньшей мере одного вида 18. Вориконазол является более стабильным в водном растворе, чем итраконазол и было продемонстрировано, чтобы быть безопасными для использования головастика 18. Хотя одна доза лечение итраконазолом и вориконазола похожи в ценообразовании, вориконазол гораздо дороже для покупки, чем итраконазол, ведущие ученые и пленных менеджеров выбрать итраконазол более регулярно. В это время, только один опубликованное исследование продемонстрировало эффективно вориконазола 18. Чтобы продемонстрировать эффективность, больше видов должны быть опробована.
<р = класса "jove_content"> Азол имидазола представляют один тип противогрибковой химиотерапии, что ингибировать рост грибов 13. Есть и другие методы лечения, которые направлены, чтобы убить грибкового патогена, а не просто уменьшить рост. Bd убит в пробирке при температуре выше 28 ° С и тепловой терапии направлен убить Bd в эпидермисе. Тербинафин гидрохлорид, альтернатива противогрибковое, которая была успешной в лечении Bd инфекции у некоторых видов 19, работает, вызывая лизис грибковых клеток. Имидазола, которые непосредственно атакуют возбудителя может быть более успешного лечения, и многое еще предстоит сделать, чтобы проверить перспективные варианты обработки для Bd инфекции.Итраконазол лечение было показано, чтобы быть эффективным в субклинически зараженных животных, но лечение клинических chytridiomycosis в основном безуспешными. Только в одном исследовании на сегодняшний день 20 успешно лечить смертельно я LL земноводных и лечение участие агрессивную сочетание терапии электролита и химиотерапии. Успешные методы лечения для тяжелобольных животных необходимы, особенно для находящихся под угрозой исчезновения животных в неволе колоний, где защита каждого человека имеет важное значение для сохранения вида.
Хотя уменьшая дозу и время обработки был успешным для I. nebulifer, лечение не опробована на других видов или животных с клинической инфекции. Некоторые виды и этапы жизни нетерпимы к итраконазол лечения, поэтому перед применением режима масштабное лечение, в неволе менеджеры должны пробный курс на небольшой группе людей, чтобы определить безопасность и эффективность. Тестирование животных, обработанных в течение по меньшей мере четырех недель после завершения лечения необходимо обеспечить ликвидацию инфекции низкий уровень 7, и должны быть выполнены после каждого курса лечения.
палатка "> Создание безопасных и эффективных методов лечения Bd инфекций в приоритетном порядке в плен области колонии обеспечения для амфибий природоохранной деятельности. Поддержание Bd бесплатно колонии имеет важное значение для успеха усилий по сохранению и зависимых колоний может быть единственным спасательным кругом для видов на грани исчезновения .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не объявляет конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Я хотел бы поблагодарить CL Ричардс-Zawacki за помощью концептуализации опытно-конструкторских и оказание помощи с материалами, А. Pessier за помощью, устанавливающего режим лечения и вскрытия анализирует, МВТЧ Chatfield, МДж Робак, К. Таскер и D. Ленгерский за помощью в лабораторные и поддержка и М. Макфадден и П. Харлоу в Зоопарк Таронга за использование их пространства во время съемок. Проект был частично финансируется Луизиана Департамента дикой природы и рыболовства по гранту Луизиана комиссии по экологическому образованию, присужденной LA Brannelly и Life Technologies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox | Janssen Pharmaceutica Inc. | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-100 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sterile cotton swabs | Medical and Wire Equipment | MW113 | |
| 1.5 ml Microtubes | Sarstedt | 73.703.217 | |
| Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69581 | |
| 7500 Real-time PCR | Applied Biosystems | 4351104 | |
| VIC IPC | Applied Biosystems | 4308323 | |
| BSA | Applied Biosystems | AM2618 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| Tryptone | Invitrogen | Q10029 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS430589 |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Wake, D. B., Vredenburg, V. T. Colloquium paper: are we in the midst of the sixth mass extinction? A view from the world of amphibians. PNAS. 105, 11466-11473 (2008).
- Voyles, J., et al. Electrolyte depletion and osmotic imbalance in amphibians with chytridiomycosis. Dis. Aquat. Org. 77 (2), 113-118 (2007).
- Ramsey, J. P. Amphibian immune defenses against Batrachochytrium dendrobatidis: A war between host and pathogen. , (2011).
- McMahon, T. A., et al. Chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis has nonamphibian hosts and releases chemicals that cause pathology in the absence of infection. PNAS. 110 (1), 210-215 (2013).
- Berger, L., Speare, R., Pessier, A., Voyles, J., Skerratt, L. F. Treatment of chytridiomycosis requires urgent clinical trials. Dis. Aquat. Org. 92, 165-174 (2010).
- Chatfield, M. W. H., Richards-Zawacki, C. L. Elevated temperature as a treatment for Batrachochytrium dendrobatidis infection in captive frogs. Dis. Aquat. Org. 94 (3), 235-238 (2011).
- Karbowski, M., et al. Free radical-induced megamitochondria formation and apoptosis. Free Rad. Biol. Med. 26 (98), 396-409 (1999).
- Bishop, P. J., et al. Elimination of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis by Archey's frog Leiopelma archeyi. Dis. Aquat. Org. 84 (1), 9-15 (2009).
- Pessier, A. P., Mendelson, J. A Manual For Control of Infectious Diseases in Amphibian Survival Assurance Colonies and Reintroduction Programs. , IUCN/SSC Conservation Breeding Specialist Group. Apple Valley, MN. (2009).
- Page, S. W. Chloramphenicol 1. Hazards of use and the current regulatory environment. Aus. Vet. J. 68 (1), 1-2 (1991).
- Yoon, H. -J., Seo, M. H., Kim, J. -K. Pharmaceutical formulations for itraconazole. , (2005).
- Garner, T. W. J., Garcia, G., Carroll, B., Fisher, M. C. Using itraconazole to clean Batrachochytrium dendrobatidis infection, and subsequent depigmentation of Alytes muletensis tadpoles. Dis. Aquat. Org. 83, 257-260 (2009).
- Brannelly, L. A., Richards-Zawacki, C. L., Pessier, A. P. Clinical trials with itraconazole as a treatment for chytrid fungal infections in amphibians. Dis. Aquat. Org. 101 (2), 95-104 (2012).
- Jones, M. E. B., Paddock, D., Bender, L., Allen, J. L., Schrenzel, M. S., Pessier, A. P. Treatment of chytridiomycosis with reduced-dose itraconazole. Dis. Aquat. Org. 99 (3), 243-249 (2012).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis. Aquat. Org. 60 (2), 141-148 (2004).
- Martel, A., et al. Developing a safe antifungal treatment protocol to eliminate Batrachochytrium dendrobatidis from amphibians. Med. Mycol. 49 (2), 143-149 (2011).
- Bowerman, J., Rombough, C., Weinstock, S. R., Padgett-Flohr, G. E. Terbinafine hydrochloride in ethanol effectively clears Batrachochytrium dendrobatidis in amphibians. J. Herpetol. Med. Surg. 20 (1), 24-29 (2010).
- Young, S., Speare, R., Berger, L., Skerratt, L. F. Chloramphenicol with fluid and electrolyte therapy cures terminally ill green tree frogs (Litoria caerulea) with chytridiomycosis. J. Zoo Wildlife Med. 43 (2), 330-337 (2012).
