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Biology

Bottom-up et de fusil de chasse protéomique pour identifier une complète Cochlear protéome

Published: March 7, 2014 doi: 10.3791/51186
Automatic Translation
1, 1
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

Summary

l'analyse de protéome de l'épithélium sensoriel cochléaire peut être difficile en raison de sa petite taille et parce que les protéines membranaires sont difficiles à isoler et à identifier. Les deux protéines membranaires et solubles peuvent être identifiés par la combinaison de plusieurs méthodes de préparation et les techniques de séparation avec haute résolution spectrométrie de masse.

Abstract

La protéomique est une approche couramment utilisé qui peut fournir des informations dans les systèmes biologiques complexes. L'épithélium sensoriel cochléaire qui contient des récepteurs transduisent l'énergie mécanique de l'énergie sonore dans un électro-chimique traitées par les systèmes nerveux périphérique et central. Plusieurs techniques de protéomique ont été développés pour étudier l'oreille interne cochléaire, tels que l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel de différence (2D-DIGE), des puces à anticorps, et la spectrométrie de masse (MS). MS est l'outil le plus complet et polyvalent en protéomique et en conjonction avec les méthodes de séparation peut fournir un protéome en profondeur des échantillons biologiques. méthodes de séparation combinés avec MS a la capacité d'enrichir les échantillons de protéines, de détecter de bas poids moléculaire et de protéines hydrophobes, et identifier des protéines de faible abondance par la réduction de la plage dynamique du protéome. Différentes stratégies de digestion peuvent être appliqués à tout ou lysat à fractionnée lysat protéique pour améliorer le peptide et la protéineune couverture de séquence. L'utilisation de différentes techniques de séparation, y compris l'échange de cations fort (SCX), en phase inverse (RP), et le liquide électrophorèse fraction de piégeage de gel-élué (GELFrEE) peut être appliquée pour réduire la complexité de l'échantillon avant l'analyse MS pour l'identification des protéines.

Introduction

La protéomique est l'étude des systèmes biologiques complexes par l'analyse de l'expression des protéines, la fonction, les modifications, et les interactions 1. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour l'analyse du protéome de l'oreille interne, y compris l'anticorps microarray 2, électrophorèse bidimensionnelle sur gel 3-5, et DIGE 6. Toutefois, seul un nombre limité de protéines ont été identifiées et caractérisées 2,7-10, par rapport aux plus de 10.000 gènes et des marqueurs de séquences exprimées (EST) identifiés dans l'oreille interne 11,12, MS est la technique la plus couramment utilisée complet et en protéomique pour la caractérisation des protéines. L'analyse des échantillons protéomiques complexes, comme la cochlée, peut être difficile. Cependant, la combinaison de plusieurs techniques de séparation avec MS permet l'identification d'un grand nombre de peptides et de protéines, en raison d'une gamme de concentration dynamique accrue et la capacité de pointe 13. Chroma multidimensionnellephie réduit mélanges de protéines très complexes en permettant l'utilisation de mécanismes d'adsorption différentes. Il existe deux approches de SEP d'analyse du protéome couramment utilisés, fusil de chasse et de la protéomique bottom-up. Dans la protéomique de fusil de chasse, un mélange de protéines intactes est digéré par voie enzymatique et on le sépare par chromatographie multidimensionnelle avec une Chromatographie d'échange de cations forte (SCX), puis par Chromatographie liquide en phase inverse (RPLC) 14,15. Les peptides séparés sont soumis à SM en tandem et base de données de recherche 15. Un avantage majeur de cette technique est que des milliers de protéines peuvent être identifiées dans une seule analyse et la technique convient mieux pour des protéines membranaires.

Dans l'approche du bas vers le haut, le mélange de protéines est séparé, généralement par une ou-électrophorèse bidimensionnelle, et les bandes de protéines individuelles ou des taches coupé et digéré avec une enzyme telle que la trypsine, ce qui entraîne habituellement en plusieurs peptides. Cependant, une autre plus récentement développé approche électrophorétique, utilisé en protéomique bottom-up, est GELFrEE. Cette technique fractionne les échantillons de protéines en phase liquide et les rend moins complexe avant l'analyse. Cette technique est reproductible, offre une récupération élevée en protéines, et de réduire la distribution des protéines abondantes élevés dans les échantillons de protéines complexes 16. Peptides, issus de protéines séparées, sont analysés par MS, en utilisant peptide empreinte de masse tandem ou MS (MS / MS), pour créer des étiquettes de séquence pour la base de données de recherche 17-19. Certains des principaux avantages de l'utilisation de l'approche bottom-up sont la capacité d'obtenir des séparations à haute résolution et une couverture complète de la protéine. protéomique bottom-up est la technique la plus largement utilisée en protéomique 20, donc, plusieurs outils bioinformatiques sont disponibles. En outre, les protéines peuvent être séparées dans un mélange complexe avant la digestion, il n'y a donc plus de chances d'identification.

L'un des principaux défisen utilisant l'oreille interne pour l'analyse protéomique est sa petite taille, l'accessibilité restreinte, et le type de cellule diversité 21. En outre, les protéines clés qui permettent de distinguer un fonctionnement, tels que les canaux ioniques, les transporteurs et les récepteurs, sont des protéines membranaires, qui peuvent être difficiles à isoler 22. Ainsi, la préparation de l'échantillon filtre assistée (FASP) est avantageux pour les analyses protéomiques de tissus qui sont limités pour l'extraction de protéines et qui nécessitent des détergents pour solubiliser les membranes 23. Ce filtrage permet l'analyse de membrane et des protéines solubles MS et pour la capacité à isoler des peptides à partir de contaminants de faible poids moléculaire 23,24.

Le présent protocole décrit des approches de protéomique couramment utilisés qui sont combinés et modifiés pour analyser les protéines solubles et membranaires et pour maximiser le nombre d'ID de protéine à partir de l'épithélium sensoriel cochléaire. Nous allons décrire en utilisant la protéomique de fusil de chasse avec FASP multi-digérerions, la chromatographie d'échange d'ions, SM à haute résolution, et l'analyse des données. En outre, nous allons décrire la protéomique bottom-up avec GELFrEE, FASP multi-digestion, SM à haute résolution, et l'analyse des données.

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Protocol

Déclaration d'éthique

Des expériences sur des souris tissu ont été approuvés par l'Université de Floride du Sud institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Commission (protocoles 3931R, 3482R) comme figurant sous les lignes directrices des National Institutes of Health.

Une. Extraction des protéines

  1. Isoler épithélium sensoriel cochléaire de 16 à 30 jours-vieux (P30) des souris CBA / J et conserver à -80 ° C.
  2. Le jour de l'expérience, le tissu de lavage avec 500 ul de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Centrifuger 3 min à 1000 xg, et retirer le surnageant. Répéter pour un total de trois lavages.
  3. Tissu ultrasons pendant 30 s sur de la glace dans 100 ul de tampon de lyse contenant 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM de NaCl, mM de NaF 50 mM, EDTA 5, 500 ug / AEBSF ml, 10 pg / ml de leupeptine, 100 ug / ml de pepstatine, 2 pg / ml d'aprotinine, et 0,5 pg / ml microcystines utilisant un désintégrateur sonore (Modèle 100, Thermo Fisher). Lysat refroidir sur glacependant 1 minute entre chaque sonication. Soniquer un total de 3x.
  4. Centrifuger à 750 xg à 4 ° C pendant 2 min et retirez le surnageant dans un nouveau microtube. Extraire le culot dans 50 ul de tampon de lyse par sonication pendant 30 secondes sur de la glace. Centrifuger à 750 xg à 4 ° C pendant 2 min. Combiner les deux lysats et centrifuger à 28 600 g à 4 ° C pendant 60 min. Retirer le surnageant dans un nouveau microtube et ajouter un tampon de lyse de 20 ul contenant 0,1% d'ASB-14 de la pastille. Vortex pendant 1 minute et laisser incuber pendant 60 min à 4 ° C.
  5. Chauffer l'échantillon à 95 ° C pendant 5 min, puis refroidir à 4 ° C pendant 60 min. Suivez avec centrifugation à 16 000 g à 25 ° C pendant 10 min. Recueillir le surnageant et transférer dans un nouveau tube.
  6. Centrifuger la suspension à 16 000 xg à 4 ° C pendant 5 minutes et conserver le surnageant pour la digestion.

2. Double tryptique digestion des protéines de lysat entier utilisant FASP

  1. Ajouter à 30 μl aliquote (≤ 400 ug) d'extrait de protéine cochléaire, contenant 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 100 mM de Tris-HCl, pH 7,6 et 0,1 M de dithiothréitol (DTT) directement à un filtre à rotation 30K et mélanger avec 200 ul de huit M d'urée dans un tampon Tris-HCl. Centrifuger à 14 000 g pendant 15 min.
  2. On dilue le concentré avec 200 ul d'une solution d'urée 8 M et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min.
  3. Ajouter 10 pl de 10x iodoacétamide (IAA) dans une solution d'urée 8 M au concentré dans le filtre et le vortex pendant 1 min. Incuber le filtre rotatif pendant 20 min à température ambiante (RT) dans l'obscurité, suivie d'une centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min.
  4. Ajouter 100 ul de solution d'urée 8 M au concentré sur l'unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. Répétez cette étape 2x. Ajouter 100 ul de 50 mM de bicarbonate d'ammonium (ABC) solution de l'unité de filtration et de centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 2x.
  5. Ajouter 0,4 ug / ul de trypsine à 1:100 (p / p) à une enzyme-Protéine rapport et incuber pendant une nuit (O / N) à 37 ° C.
  6. Après l'incubation, ajouter 40 ul de solution 50 mM ABC unité de filtrage et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x.
  7. Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl dans le filtre et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides tryptiques à un nouveau microtube et acidifier avec de l'acide formique (FA) à 1,0% pour arrêter la digestion.
  8. Laver le filtre avec 40 pi de 8 M d'urée, puis laver 2 fois avec 40 pl 18 MQ eau.
  9. Laver l'unité filtre 3x avec 100 ul de solution 50 mM ABC. Après le lavage final, ajouter 0,4 ug / ul de trypsine à 1:100 (p / p) rapport enzyme à protéine et incuber O / N à 37 ° C.
  10. Éluer les peptides trypsiques de la seconde digérer en ajoutant 40 ul de solution 50 mM ABC à l'unité de filtration et de centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x.
  11. Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl à l'Unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides tryptiques à un nouveau microtube et acidifier avec FA à 1,0%.
  12. Les échantillons peuvent être quantifiés en utilisant le dosage colorimétrique de microplaques en utilisant la BSA comme standard.

3. Endoprotéinase LysC et tryptique digestion des protéines de lysat entier utilisant FASP

  1. Ajouter une fraction aliquote de 30 ul (≤ 400 ug) d'extrait de protéine cochléaire contenant 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 et 0,1 M DTT directement à un filtre à rotation 30K et mélanger avec 200 ul d'urée 8 M dans du Tris-HCl . Centrifuger à 14 000 g pendant 15 min.
  2. On dilue le concentré avec 200 ul d'une solution d'urée 8 M et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min.
  3. Ajouter 10 pl de 10x AAI en solution d'urée 8 M au concentré dans le filtre et le vortex pendant 1 min. Incuber le filtre centrifuge pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité puis centrifuger à 14 000 g pendant 10 min.
  4. Ajouter 100 pi de 8 M d'urée solution au concentré sur l'unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. Répétez cette étape 2x. Ajouter 100 ul d'une solution 100 mM ABC à l'unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 2x.
  5. Ajouter 0,1 pg / pl d'endoprotéinase LysC dans un 01:50 (p / p) rapport enzyme à protéine et incuber O / N à 30 ° C.
  6. Après l'incubation, ajouter 40 ul de solution 100 mM ABC à l'unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x.
  7. Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl dans le filtre et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides LysC à un nouveau microtube et acidifier avec FA à 1,0% pour arrêter la digestion.
  8. Laver le filtre avec 40 pi de 8 M d'urée, puis laver 2 fois avec 40 pl 18 MQ eau.
  9. Laver l'unité filtre 3x avec 100 ul de solution 50 mM ABC. Après le lavage final, ajouter 0,4 ug / ul de trypsine à 1:100 enzyme-à-prorapport protéine et incuber O / N à 37 ° C.
  10. Éluer les peptides tryptiques en ajoutant 40 ul de solution 50 mM ABC à l'unité de filtration et de centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x.
  11. Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl à l'unité de filtration et de centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides tryptiques à un nouveau microtube et acidifier avec 1,0% FA.
  12. L'échantillon peut être quantifiée en utilisant le test colorimétrique microplaque avec de la BSA comme standard.

4. Les peptides de dessalage l'utilisation des colonnes Spin

  1. Activer une colonne C 18 en macrospin en ajoutant 500 pl d'acétonitrile (ACN) et centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Jeter l'effluent après centrifugation.
  2. Équilibrer la colonne avec 500 ul de 0,1% de FA et centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Jeter l'effluent à travers et répétez cette étape 1x.
  3. Ajouter jusqu'à 500 pi du peptide digérer à la une de la colonned centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Si le volume de l'échantillon est supérieure à 500 pi puis répétez cette étape.
  4. Laver la colonne avec 500 ul de 0,1% de FA et centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Jeter l'effluent à travers. Répétez cette étape 1x.
  5. Ajouter 250 ul d'un rapport de 90:10 d'ACN-eau à la colonne et centrifuger à 1100 g pendant 1 min. Recueillir l'éluant contenant les peptides dessalée et transférer à un nouveau microtube. Répétez cette étape 1x.
  6. Sécher l'échantillon de peptide dessalé dans une centrifugeuse sous vide et éviter de laisser l'échantillon sécher complètement.

5. Échange chromatographie ionique

  1. Injecter 50-100 mg de l'échantillon de protéines digérées sur un 200 x 2,1 mm, 5 um colonne SCX (Polysulfoethyl A) pour séparer les peptides.
  2. Utiliser un gradient de 2-40% de B sur 50 min avec un débit de 250 ul / min. Le solvant A est le formiate d'ammonium 5 mM, pH 3,0 dans 25% d'acétonitrile et de 75% le trou DDH 2 O. Le solvant B est le formiate d'ammonium 500 mM, pH6,0 à 25% d'ACN et 75% le trou DDH 2 O.
  3. Surveiller les fractions peptidiques à 280 nm et de recueillir les fractions dans des intervalles de 2 min à l'aide d'un collecteur de fractions.
  4. Fractions séchées dans un concentrateur sous vide et remettre en suspension dans 500 ul d'acétonitrile à 50% dans le trou DDH 2 O contenant 5% de FA pour aider à l'élimination des sels.
  5. Fractions Redry et conserver à -80 ° C jusqu'au moment de servir pour l'analyse nano LC-MS/MS.

6. Précipitation à l'acétone

Avant la séparation de GELFrEE le surnageant de protéine cochléaire doit être dessalée. Précipitation à l'acétone peut être utilisé pour dessaler et concentrer les protéines.

  1. Ajouter trois volumes d'acétone glacée au surnageant cochléaire. Vortex doucement et incuber à -20 ° CO / N.
  2. Centrifuger le mélange de l'échantillon à 15 000 g pendant 15 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
  3. Laver le culot protéique 3x avec de l'acétone refroidie et centrifuger à 14 000 g pendant 5 min à 4° C.
  4. Air-sécher le culot et le dissoudre dans 112 ul de 18 MQ eau.
  5. Déterminer la concentration en protéine en utilisant le dosage colorimétrique de microplaques.

7. GELFrEE fractionnement de Cochlear sensorielle épithélium

  1. Ajouter 30 ul de tampon d'échantillon de 5 x (0,25 M de Tris-HCl pH 6,8, 10% (p / v) de SDS, 50% de glycerol, 0,5% (p / v) de bleu de bromophénol) à la protéine dessalée en suspension dans 112 ul de 18 MQ eau.
  2. Ajouter 8 pi de 1M TNT et de la chaleur à 95 ° C pendant 5 min pour réduire les liaisons disulfures de protéines. Après chauffage de permettre le refroidissement jusqu'à la température ambiante.
  3. Ajouter 8 ml de tampon courante de réservoir d'anode, 150 ul de tampon de migration pour échantillonner chambre de collecte, et 6 ml de tampon courante pour réservoir de cathode.
  4. Retirez tout tampon qui pourrait avoir coulé dans la chambre échantillon-chargement à l'aide d'une pipette.
  5. Charge 150 pi (≤ 1 mg) du mélange de protéines cochléaire, dans la chambre d'échantillonnage chargement à l'aide de 8% Trest-acétate de cartouche avec une gamme de masse de 3,5 à 150 kDa.
  6. Électrodes inférieures et fermer le couvercle de l'appareil pour commencer la course.
  7. Au premier temps de pause de l'instrument ajouter 2 ml de tampon courante dans le réservoir de cathode et de reprendre l'exécution.
  8. A chaque intervalle de pause sur l'instrument, prélever l'échantillon à partir de la chambre de collecte d'échantillon à l'aide d'une pipette et l'ajouter à un microtube fraîchement marqué. Laver les 2x chambre de collection avec 150 pi de tampon de migration et le jeter.
  9. Ajouter 150 pi de tampon frais de fonctionnement de la chambre de collecte d'échantillon et de reprendre l'exécution. On récupère les fractions de protéines sur une période de temps de 2,6 heures dans un volume total de 150 pl / fraction.

8. 1D électrophorèse sur gel GELFrEE fractions

Électrophorèse sur gel 1D peut être utilisé pour visualiser les résultats de GELFrEE fractionnement préalable à la digestion enzymatique et l'analyse MS. GELFrEE fractions protéiques peuvent être séparés sur un gel de Tris-HCl 4-15%.

  • Mélanger une partie aliquote de 5 ul de chaque fraction de GELFrEE avec 5 pl de tampon de dilution échantillon (350 mM de DTT dans un tampon d'échantillon).
  • Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 3 min.
  • Échantillons refroidir à température ambiante.
  • Charger 10 ul de chaque fraction de GELFrEE dans les voies individuelles de gel et de la charge 5 pi de standard de poids moléculaire dans la dernière voie inutilisé.
  • Exécuter le gel à 125 V pendant 1,5 heure ou jusqu'à ce que le front de colorant atteint le bas du gel.
  • Retirer soigneusement le gel et la coloration à l'argent Stain Plus pour visualiser la séparation des protéines.

    • 9. La digestion des protéines de fractions GELFrEE Utilisation FASP

    Une procédure de FASP modifiée est utilisée pour l'élimination du détergent et la digestion des fractions de GELFrEE.

    1. Ajouter chaque fraction individuelle directement à une unité de filtre 30K; mélanger avec 200 ul d'urée 8 M dans du Tris-HCl et centrifuger à 14 000 xg pendant 25 min.
    2. On dilue le concentré avec 200 ul de solution d'uréeet centrifuger à 14 000 g pendant 12 min. Répétez cette étape 1x.
    3. Ajouter 10 pl de 10x IAA dans une solution d'urée au concentré dans chaque unité de filtre, vortex pendant 1 min, et incuber pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
    4. Ajouter 100 ul de solution d'urée au concentré sur les unités de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 15 min. Répétez cette étape 2x. Ajouter 100 ul d'une solution 100 mM ABC vers les unités de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 2x.
    5. Ajouter 0,1 pg / pl de LysC de 1:50 (p / p) rapport enzyme à protéine pour les unités de filtrage et incuber O / N à 30 ° C.
    6. Après l'incubation, ajouter 40 ul de solution 100 mM ABC aux filtres de spin et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x.
    7. Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl à des filtres de spin et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides LysC de chaque filtre rotatif à un nouveau microtube et acidifier avec trifluoroacacide étique (TFA).
    8. Laver les filtres de spin avec 40 pi de 8 M d'urée, puis laver 2 fois avec 40 pl 18 MQ eau.
    9. Laver les filtres de spin 3x avec 100 pi d'une solution 50 mM ABC. Après le lavage final, ajouter 0,4 pg / pl de la trypsine dans un 1:100 (p / p) rapport enzyme à protéine et incuber O / N à 37 ° C.
    10. Éluer les peptides trypsiques de chaque unité de filtration en ajoutant 40 ul de solution 50 mM ABC et centrifuger à 14 000 xg pendant 10 min. Répétez cette étape 1x.
    11. Ajouter 50 ul de solution à 0,5 M de NaCl à des unités de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min. Transférer le filtrat contenant les peptides trypsiques de chaque unité de filtre à un nouveau microtube et on acidifie avec du TFA.
    12. Séchez tous les résumés dans un concentrateur sous vide.

    10. Préparation de l'échantillon pour LC-MS/MS

    1. Reconstituer LysC et séché peptide trypsique des fractions de digestion dans 20 ul de 0,1% de FA et de vortex.
    2. Centrifuger les échantillons à 20 000 g pendant 10min et retirez la partie supérieure de 95% de l'échantillon à un nouveau flacon de l'échantillon.
    3. Injecter 5 ul de chaque fraction de peptide sur une 100 um x 25 mm échantillon piège pour éliminer les sels et les contaminants et effectuer une séparation chromatographique sur un 75 x 10 cm um C 18 colonne.
    4. Utiliser un gradient de 2-40% de B sur 100 min avec un débit de 200 nl / min. Le solvant A est de 95% ddH2O et 5% d'acétonitrile contenant 0,1% de FA. Solvant B est de 80% et 20% ACN ddH2O contenant 0,1% de FA.
    5. Recueillir dix tandem spectres de masse pour chaque scan MS sur un spectromètre de masse à haute résolution. Un spectromètre de masse LTQ Orbitrap a été utilisé dans cette expérience.

    11. Identification des protéines

    1. Identifier les protéines en utilisant la base de données de la souris UniProt contenant à la fois avant et arrière séquences de protéines et contaminants communs. Logiciel MaxQuant moteur de recherche MASCOT avec est utilisé pour rechercher la base de données de protéines.
    2. Les paramètres de recherche qui peuvent être utilisés comprennent, MODIFIC fixeation de carbamidomethyl de la cystéine, modifications variables de l'oxydation de la méthionine, la protéine N-terminale acétylation, maximum de 2 manqué clivage. La longueur du peptide minimum à considérer pour l'identification est de 6 acides aminés. Entrer un peptide de masse erreur de concentration de ± 8 ppm et une tolérance de masse de fragment de 1,2 Da (erreur de masse dépend du spectromètre de masse utilisé).
    3. Dans le logiciel de MaxQuant, utiliser un taux de faux positifs de 1% (FDR) pour le peptide et l'identification des protéines. L'identification des protéines est listé avec le nombre de peptides appariées, la couverture de séquence de la protéine pour cent, et les séquences peptidiques.

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    Representative Results

    Pour obtenir le protéome la plus complète de l'épithélium sensoriel cochléaire, la dissection des tissus rapide est nécessaire avant l'extraction de la protéine et la préparation des échantillons. Deux techniques protéomiques peuvent être utilisés, fusil de chasse et de bas en haut de la protéomique. Pour préparer des échantillons pour la protéomique de fusil de chasse, FASP procédure de digestion a été utilisé comme l'illustre la figure 1. La méthode de FASP permet de concentration des protéines, l'élimination des détergents, et la digestion des protéines à l'aide de plusieurs enzymes. Il y avait deux procédures de digestion doubles utilisées, la première était une digestion tryptique suivie d'une seconde digestion avec la trypsine, qui ont été mis en commun, fractionné sur une colonne SCX en 18 fractions et analysé par nano LC-MS/MS. Un total de 1 485 protéines ont été identifiés avec un FDR de 1% lors de l'exécution d'un seul terme LC-MS/MS utilisant cette approche expérimentale. Parmi les protéines identifiées, 329 et 258 protéines ont été classés dans la mitochondrie et la membrane plasmique, respectivement (figure2A). La deuxième procédure de double digestion composée de digestion LysC suivie par digestion à la trypsine. Chaque résumé a été chargé individuellement et séparés sur la colonne SCX en 18 fractions et analysé par nano LC-MS/MS. Les résultats de l'LysC et digestions trypsiques ont produit un total de 3503 protéines avec un 1% FDR. Figure 2B montre que les 605 et 617 protéines ont été classées dans la mitochondrie et la membrane plasmatique, respectivement. Cette approche a fourni le plus grand nombre d'ID de protéines associées à la membrane. Double analyse de la LysC et fractions de la trypsine a montré plus de 65% des protéines identifiées ont été partagés entre les expériences. Cependant, il y avait aussi des protéines nouvellement identifiées dans l'analyse de données répliquée. Les peptides et protéines supplémentaires ont été identifiés en raison de petits changements dans la Chromatographie, par conséquent, conduit à des peptides différents de fragmentation 25.

    Protéomique bottom-up a été appliquée en utilisant GELFrEE fractionnementavant la LC-MS/MS, comme illustré sur la figure 3. Il y avait 12 fractions de GELFrEE recueillies. Avant la digestion et l'analyse LC-MS/MS, d'un gel coloré à l'argent a été préparé pour visualiser les résultats de GELFrEE fractionnement comme illustré sur la figure 4. Le gel a montré la séparation des protéines en augmentant le poids moléculaire pour chaque fraction consécutive. Par conséquent, les 12 fractions de liquides GELFrEE ont été digérés en utilisant deux approches de digestion multi-FASP différents et analysés par LC-MS/MS. La première approche de digestion a été effectuée en utilisant une digestion à double trypsine, ce qui a conduit à l'identification de 2165 protéines avec un 1% FDR lors d'une LC-MS/MS seul terme. Figure 5A montre qu'il y avait 516 et 399 protéines classés dans la mitochondrie et la membrane de plasma, respectivement. La deuxième approche de digestion a été effectuée à l'aide endoprotéinase LysC suivie par digestion à la trypsine. Analyse LC-MS/MS unique terme identifié 2211 protéines avec une FDR à 1%. Ceapproche a montré un nombre similaire de protéines associées à la membrane que l'utilisation de l'approche de la trypsine / trypsine (figure 5B). Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposés à la ProteomeXchange Consortium 26 avec l'ensemble de données identifiant PXD000231 25. Combiner les résultats des différentes techniques ont donné lieu à un grand nombre de membrane et des protéines solubles de la cochlée de la souris épithélium sensoriel (Figure 6).

    Figure 1
    Figure 1. Schéma d'une expérience protéomique de fusil de chasse à l'aide FASP, la Chromatographie d'échange d'ions, et MS à haute résolution. Protéines sont extraites, solubilisé, et digéré à l'aide FASP avec LysC et endoprotéinases de la trypsine. Le LysC (tube vert) et des peptides tryptiques (violet tubes) sont séparées en fractions moins complexes en utilisant la chromatographie SCX et analysé à l'aide de nano LC-MS/MS. Le moteur de recherche MASCOT a été utilisé pour traiter les données MS pour l'identification des protéines. Cliquez ici pour agrandir l'image.

    Figure 2
    Figure 2. GO composants cellulaires profil d'ID de protéine lors de l'exécution d'une (A) des première et seconde digestion avec de la trypsine, suivie par SCX séparation et (B) d'abord digestion avec LysC suivie par une seconde digestion avec de la trypsine, suivie par SCX séparation. Toutes les catégories sont comptés de façon non exclusive, quand une protéine a plus d'une catégorie pour les composants cellulaires.ES.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

    Figure 3
    Protéines Figure 3. Schéma d'une expérience protéomique bas-up en utilisant GELFrEE, FASP, et à haute résolution MS. Extraits sont solubilisés et protéines sont précipitées avec de l'acétone (tube bleu) pour éliminer les sels et les contaminants indésirables du lysat. Le culot de protéine est solubilisée et protéines fractionné en utilisant GELFrEE. Chaque fraction a été digéré à l'aide FASP avec LysC et endoprotéinases de la trypsine. Le LysC (Tubes verts) et des peptides tryptiques (tubes violets) de chaque fraction sont analysés à l'aide de nano LC-MS/MS et protéines identifiées par la recherche de données MS en utilisant MASCOT. Cliquez ici pour afficher une grande image r.

    Figure 4
    Figure 4. gel coloré à l'argent de la cochlée sensoriels fractions épithélium de GELFrEE, pour visualiser la séparation des protéines dans chaque fraction avant l'analyse MS. (M) marqueur de la protéine, (1) la fraction 1, (3) la fraction 2, (5) Fraction 5, (7) Fraction 7, (8) Fraction 8, (9) Fraction 9, (10) La fraction 10, (11) La fraction 11, (12) la fraction 12. Reproduit (adapté) avec la permission de Darville et Sokolowski 24. Droits d'auteur 2013 par l'American Chemical Society. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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    Figure 5. GO composants cellulaires profil d'ID de protéine lors de l'exécution d'une (A) des première et seconde digestion par la trypsine après séparation de GELFrEE et (B) d'abord digestion avec LysC suivie par une seconde digestion par la trypsine après séparation de GELFrEE. Toutes les catégories sont comptées de façon non exclusive, quand une protéine a plus d'une catégorie pour les composants cellulaires. Cliquez ici pour agrandir l'image.

    Figure 6
    Figure 6. GO composants cellulaires profil pour toutes les protéines identifiées à l'aide SCX, WAX, ou la séparation de GELFrEE. Quand une protéine avait plus d'une catégorie pour les composants cellulaires, la totalité de sa catégories ont été comptabilisés à titre non exclusif. Cliquez ici pour agrandir l'image.

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    Discussion

    Les étapes clés pour maximiser l'identification des protéines à partir de l'épithélium sensoriel cochléaire sont: 1) l'utilisation de multiples endoprotéinases pour la digestion, 2) l'utilisation de techniques de séparation multiples, et 3) l'utilisation d'un spectromètre de masse à haute résolution. L'application de plusieurs enzymes augmente le nombre de peptides et améliore la couverture de la séquence de protéine, d'où l'amélioration du nombre de protéines identifiées à partir du tissu cochléaire. Trypsine, la protéase le plus couramment utilisé fournit un clivage efficace et spécifique de protéines, peptides génération qui sont bonnes pour MS ionisation et de fragmentation. Cependant, en utilisant une autre enzyme avant la trypsine, comme LysC, qui clive également au niveau du résidu de lysine, fournit peptide plus efficace clivage. Il a été observé que la couverture de la séquence des protéines produites à partir de la digestion avec LysC / de la trypsine a montré une augmentation de la protéine couverture de séquence par rapport à la couverture de la séquence de la protéine à partir de la trypsine / trypsine de digestion.

    ove_content "> Mise en oeuvre de la séparation multidimensionnel avant MS réduit la complexité de l'échantillon cochléaire élevé dans l'approche protéomique de fusil de chasse. Ceci a permis l'identification de plusieurs protéines, y compris les protéines membranaires, qui sont généralement difficiles à identifier. Un plus grand nombre de protéines membranaires ont été identifiés à l'aide l'approche de fusil de chasse, par opposition à l'approche bottom-up. Cependant, l'approche bottom-up en utilisant GELFrEE permis pour l'identification des protéines abondantes plus bas. Cela est dû à l'isolement de protéines plus abondantes, comme Cochlin de la cochlée, en particulier fractions.

    Les données de haute qualité obtenus dans le présent protocole par un spectromètre de masse à haute résolution, comme un LTQ-Orbitrap, améliore et augmente le nombre de protéines qui peuvent être identifiés dans la cochlée. Le LTQ-Orbitrap offre une résolution élevée, une grande précision de masse, et une grande sensibilité pour l'analyse des peptides. Par conséquent, l'application de cette enab instrumentles protéines de l'identification à partir d'échantillons biologiques complexes, tels que l'épithélium sensoriel cochléaire et améliore l'identification des peptides de faible abondance. L'utilisation de ces approches expérimentales combinées avec le puissant outil de MS permet d'augmenter de manière significative l'ensemble de données de protéines cochléaire, améliorant ainsi la possibilité d'identifier de nouveaux biomarqueurs de protéines impliquées dans l'audition et la surdité.

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    Disclosures

    Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêts.

    Acknowledgments

    Les auteurs remercient le Dr Kent Seeley, directeur du Centre pour la découverte de médicaments et l'innovation (CDDI) Facility protéomique de base à l'Université de Floride du Sud pour l'utilisation de cette installation. Ce travail a été soutenu par le NIH / NIDCD subvention R01 DC004295 à BHAS

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    8% Tris-acetate cartridge  Protein Discovery 42103
    Acetone Sigma-Aldrich 179124
    Acetonitrile Honeywell 015-1L
    AEBSF Calbiochem 101500
    Ammonium formate Fisher Scientific AC16861
    Aprotinin Calbiochem 616370
    ASB-14  Calbiochem 182750-5GM
    Bovine serum albumin BioRad 500-0112
    C18 column  New Objective A25112 75 μm x 10 cm 
    DC Protein Assay BioRad 500-0116 Microplate Assay Protocol
    EDTA Sigma-Aldrich E9884
    Endoproteinase Lys-C Sigma-Aldrich P3428
    FASP Protein Digestion Kit Protein Discovery 44250
    Formic acid  Fluka 94318
    GELFrEE Fractionation System Protein Discovery 42001 GELFrEE 8100
    Leupeptin Calbiochem 108975
    MacroSpin Column The Nest Group SMM SS18V Silica C18
    Microcystin Calbiochem 475815
    Pepstatin Sigma-Aldrich P5318
    Polysulfoethyl A Column The Nest Group 202SE0503
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
    Sonic Dismembrator  Thermo Fisher 15-338-53 Model 100
    Trypsin Sigma-Aldrich T6567 Proteomics Grade

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    References

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    Biochimie Cochlear chromatographie LC-MS/MS spectrométrie de masse protéomique épithélium sensoriel
    Bottom-up et de fusil de chasse protéomique pour identifier une complète Cochlear protéome
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    Darville, L. N. F., Sokolowski, B.… More

    Darville, L. N. F., Sokolowski, B. H. A. Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome. J. Vis. Exp. (85), e51186, doi:10.3791/51186 (2014).

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