Summary
A insuficiência respiratória é a principal causa de morte na sequência de uma lesão medular cervical. Ter um modelo animal pré-clínico reprodutível, quantificáveis e confiável de insuficiência respiratória induzida por uma lesão cervical parcial vai ajudar a entender a neuroplasticidade respiratório e não-respiratório posterior e permite testar estratégias de reparo putativos.
Abstract
A lesão da medula espinhal cervical induz a paralisia permanente, e muitas vezes leva a problemas respiratórios. Até o momento, não houve terapêutica eficientes foram desenvolvidos para melhorar / amenizar a insuficiência respiratória após alta lesão medular cervical (SCI). Aqui propomos um modelo pré-clínico murino de alta SCI na cervical 2 (C2) nível metamérica estudar diversificada neuroplasticidade respiratória pós-lesional. A técnica consiste numa lesão parcial cirúrgica ao nível C2, que irá induzir uma hemiparalisia do diafragma devido a uma deaferentação dos motoneurónios frênicas dos centros respiratórios localizados no tronco cerebral. O lado contralateral da lesão permanece intacta e permite a recuperação dos animais. Ao contrário de outros SIC que afetam a função locomotora (no tórax e nível lombar), a função respiratória não requer motivação animal e à quantificação do déficit / recuperação pode ser realizada facilmente (diafragma e gravação do nervo frênicos, ventilação de todo o corpo). Este modelo pré-clínico C2 SCI é um modelo pré-clínico poderoso, útil e confiável para estudar vários eventos neuroplasticidade respiratórios e não respiratórios em diferentes níveis (molecular) para a fisiologia e para testar diferentes estratégias terapêuticas putativos que possam melhorar a respiração em pacientes com LM.
Introduction
Trauma medular é uma lesão comum observada na população humana com incidências dramáticas, tais como paralisia permanente. No entanto, a gravidade da lesão depende do grau e da extensão do trauma inicial. A insuficiência respiratória é a principal causa de mortalidade após lesão medular cervical superior (SCI) 1. Atualmente, o único tratamento terapêutico é colocar o paciente sob assistência ventilatória. Desde alguns pacientes podem ser desmamados a assistência ventilatória 2, devido à recuperação espontânea que ocorre com atraso pós-lesional, a necessidade de desenvolver novas terapias não-invasivas inovadores é urgente 3. Tendo um bom modelo pré-clínico normalizado para investigar o efeito de um SCI cervical em insuficiência respiratória e por isso, para estudar a aplicação de estratégias terapêuticas putativos, é essencial.
Neste artigo técnico, nós descrevemos um modelo murino pré-clínico o específicocomprometimento respiratório f induzida por um SCI cervical parcial no nível C2. Este modelo é usado atualmente por vários laboratórios ao redor do mundo (para comentários: 4-13). No entanto, ligeiras diferenças de procedimento cirúrgico pode ser observada entre os diferentes pesquisadores para gerar este modelo murino lesão cervical particular. O efeito de um C2 SCI na saída respiratória foi descrita pela primeira vez em 1895 por Porter 14. Uma hemisecção cervical induz uma deaferentação dos motoneurónios frênicas da sua unidade central (localizado no rVRG no tronco cerebral, Figura 1A) no lado ipsilateral de lesão, levando a uma actividade do nervo frénico e silenciosa, o diafragma posterior paralisia. O lado contralateral permanece intacta e que permite ao animal sobreviver. Ao contrário diferente SCI localizado num segmento da coluna vertebral inferior (por exemplo, uma lesão contundente ao nível C4 15), a integridade do núcleo de motoneurónios frénico em ambos os lados é preservada. Após um CERVlesão C2 iCal, alguma atividade espontânea pode ser observado no lado ipsilateral (frênico e diafragma), devido a uma ativação de vias sinápticas silenciosas contralateral que cruzaram a linha média da coluna vertebral ao nível segmentar C3-C6 (caminhos cruzados frênico, CPP, Figura 1B) . A ativação do CPP, que é, por definição, um hemissecção C2 combinada com uma phrenicotomy contralateral que induzir uma recuperação parcial do nervo frênico ipsilateral, pode ocorrer de horas a semanas pós-lesão 16-18. O efeito benéfico real deste caminho CPP na recuperação respiratória é limitada 19 e mais investigação e tratamento devem ser desenvolvidos para melhorar a magnitude da recuperação espontânea 3.
Este protocolo fornece um tipo poderoso de modelo murino pré-clínico para estudar a plasticidade pós-lesional respiratória em vários níveis (fisiologia respiratória de motoneurônios pré e frênico, interneurônios, molecular e cellular, a locomoção do membro dianteiro, por exemplo), bem como um modelo para testar as estratégias terapêuticas invasivas e não invasivas destinados a melhorar os sistemas respiratório e recuperação locomotora seguinte C2 lesão medular cervical parcial.
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Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo comitê de ética da cadeira RBUCE-UP de Excelência (Universidade de Paris Sud, convenção de subvenção n º 246556) e da Université de Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines.
1. Preparação de instrumentos cirúrgicos esterilizados
- Limpe os instrumentos cirúrgicos com detergente de laboratório.
- Autoclave os instrumentos antes da cirurgia.
- Numa sessão cirúrgica, esterilizar as ferramentas, colocando as pontas de um esterilizador talão quente durante 10 minutos a 180 ° C entre as duas operações.
2. Preparação de Drogas
- Prepare 2 x 1 ml seringas para drogas pré-anestésica drogas cocktail e pós-operação.
- De acordo com o peso do rato, preparar uma seringa com medicamentos pré-anestésicos: carprofeno (5 mg / kg), buprenorfina (50 ug / kg), Baytril (5 mg / kg) e dexmedetomidina (0,5 mg / kg). Completar o volume para 1 ml com solução de Ringer.
- Prepare-seuma outra seringa para a reversão das drogas pré-anestésicos: atipamezol (500 ug / kg).
3. Anestesia do Rato
- Administrar por via subcutânea ao animal, a solução de drogas pré-anestésicos descritos no passo 2.2. Em seguida, coloque o animal de volta na gaiola e espere até que o efeito sedativo aparece.
- Coloque o rato em uma câmara fechada preenchida com 5% de isoflurano em 100% O 2, e esperar até que o ritmo respiratório diminui (cerca de 30 seg.) Em seguida, retire o rato da câmara e coloque-a sobre a mesa de intubação.
4. Intubação orotraqueal
- Deite o animal de costas, em seguida, segura a cabeça, colocando uma alça ligada a seus dentes da frente para a mesa.
- Com uma luz de fibra óptica, iluminar o espaço torácico. Em seguida, coloque um laringoscópio (ou uma custom made um, Jou et al. 20 para mais detalhes) na boca do animal. Visualize as cordas vocais.
- Deslizoue e colocar um guia orotraqueal na traqueia (entre as cordas vocais). Deslize o tubo orotraqueal (16 G tamanho do cateter) na guia.
- Remover o guia e verificar com um espelho de laringe colocado na extremidade do tubo orotraqueal para a presença de humidade, o que confirma a posição apropriada do tubo na traqueia e não no esófago.
- Ligar o tubo de um ventilador de roedor (683 roedor ventilador, Harvard Apparatus) e ajustar a concentração de isoflurano a 2% (em 100% de O2).
- Fixe o tubo orotraqueal com esparadrapo.
5. Cirurgia da Coluna Vertebral
- Colocar o animal em decúbito ventral em uma placa cirúrgica aquecida, com o nariz apontando para ângulo de 90 ° com o cirurgião. Manter a temperatura do corpo de cerca de 37,5 ° C durante a cirurgia.
- Raspar o cabelo com tesouras entre as escápulas e remover o cabelo com uma gaze.
- Limpar a pele com betadine e em seguida com 70% de álcool. Repita este passo 3x.
- Uma pitada do dedo do pé é realizada antes do início da cirurgia para garantir profundidade anestésica adequada. Em seguida, faça uma incisão na pele rostro-caudal lateral com tesoura entre as escápulas.
- Corte o músculo acromiotrapezius rostro-caudal, seguindo o tendão para evitar qualquer sangramento. Então dissociar o músculo rombóide para acessar os músculos spinalis (em torno da vértebra).
- Recolha o músculo spinalis de C1 a C3 vértebra. A vértebra C2 é o único com uma apófise proeminente.
- Limpe o músculo ao redor da parte dorsal da vértebra usando cotonetes estéreis.
- Comece para remover cuidadosamente a apófise do C2 com um rongeur. Em seguida, continue meticulosamente até o dorsal da medula espinhal está exposto. Certifique-se que laminectomia é uma laminectomia hemi dorsal. Preste muita atenção para a dura-máter que envolve a medula espinhal e as artérias nas imediações da área.
- Com # 55 fórceps, dissecar rostro-caudal da dura juntamente C2, ao lado continuam lateralmente de cada lado rostral e caudal.
- Esponja o líquido cefalorraquidiano.
- Faça uma secção lateral sob o número cervical da raiz dorsal 2 com a microtesoura. Verifique com um bisturi micro que a extensão da lesão é perto o suficiente para chegar à linha média da medula espinhal (ver Figura 2A para uma vista dorsal da lesão). Se não, então um outro corte pode ser feito para completar a lesão. Em caso de hemorragia, use cotonetes estéreis. Tenha cuidado para não ir para o lado contralateral, caso contrário, o animal não vai se recuperar da lesão e terá uma insuficiência respiratória.
- Suturar os músculos como uma camada protetora e sutura de volta a pele. Limpe o ferimento com gaze esterilizada Betadine saturada.
- Vire-off o vaporizador isoflurano e injetar as drogas Reversão (Atipamezole [500 mg / kg, im]), verifique a temperatura do corpo.
- Quando o animal começa a respirar contra o ventilador,desconectar o tubo traqueal do ventilador, em seguida, remover o tubo orotraqueal. Colocar o animal numa gaiola aquecida para recuperação.
6. Cuidados pós-cirúrgica
Após a cirurgia, os animais são monitorados continuamente para garantir o melhor ambiente possível para a recuperação. Antibióticos (Baytril, 5 mg / kg), anti-inflamatório (Carprofeno, 5 mg / kg) e buprenorfina (50 ug / kg) as drogas são dadas a cada 12 horas durante os primeiros dois dias pós-cirurgia para evitar infecções e reduzir a ocorrência da dor pós-operatória. Os ratos têm acesso ad libitum ao alimento macio e água (ou água rebuçados em gel para o 1 º dia de pós-operatório). Fluídos subcutâneos pode ser usado para evitar a desidratação nos primeiros dias de pós-operatório. O peso corporal e a ingestão de alimentos são monitorizados diariamente. Seu ambiente é enriquecido ao longo da experiência e do tempo pós-lesão (dual habitação, tubos em suas gaiolas).
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Representative Results
Extensão da lesão
O sucesso ea reprodutibilidade deste modelo experimental específico dependem da experiência de cada manipulador / cirurgião. A quantidade subseqüente de recuperação respiratória (atividade do nervo frênico e atividade do diafragma), após uma lesão no C2 está correlacionada com o restante ventrolateral poupado substância branca 21. Uma vez que a lesão é "handmade" e requer um pouco de prática do cirurgião, a extensão de cada lesão tem de ser verificado por meio de técnicas histológicas (fixação do tecido com paraformaldeído 4%, corte de tecido congelado, coloração violeta cresil) para determinar o tamanho exato tecido de danos (Figura 2B).
Registros eletrofisiológicos
Após uma C2 SCI, a atividade do nervo frênico ipsilateral é abolida (Figura 3A, consulte Vinit et al. 17para a metodologia). A atividade do nervo frênico contralateral não é afetado pela lesão e permite a sobrevivência do animal (Figura 3B). 7 dias após a lesão, uma ligeira actividade pode ser gravada no lado ipsilateral de alguns animais, principalmente devido ao CPP que atravessou a linha média do lado contralateral (Figura 3A e 3B). Resultados semelhantes podem ser observados na actividade do diafragma (Figura 3C e 3D), com uma ligeira actividade aos 7 dias pós-ferimento no lado ipsilateral (Figura 3C). Esta actividade é reforçada ao longo do tempo pós-lesão e pode ser observado em todos os animais após alguns meses (não mostrado).
Figura 1. Vista esquemática da anatomia respiratório de rato.A) Vista lateral da principal organização de inspiração, com os pré-motoneurons frênico localizados na rVRG (Brainstem) e os motoneurônios frênico localizados no núcleo frênico (C3 a C6), que projetam seus axônios para o diafragma. B) Esquema dorsal considerando o efeito de uma lesão parcial C2 nas vias descendentes respiratórias. Note-se a presença das vias frênico cruzados do lado contralateral que cruzam a linha média ao nível segmentar núcleo frênico. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Imagens da lesão parcial C2 no rato. A) imagem dorsal do local da cirurgia. A seta mostra o local da injUry. Note-se a ausência da vértebra C2 (parte dorsal). B) Reconstrução da extensão da lesão C2 (imagem da direita, a extensão em cinza) da seção transversal da medula espinhal (fotos à esquerda). Barra de escala:. 1.000 mM Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Efeitos fisiológicos de uma lesão C2 na saída respiratória. A) A lesão parcial C2 abole a atividade do nervo frênico no lado ipsilateral. Observe uma restauração parcial da atividade do nervo frênico ipsilateral aos 7 dias após a lesão, devido à via atravessada frênico (CPP). B) A lesão C2 não afeta a atividade do nervo frênico contralateral imediatamentee aos 7 dias pós-lesão. C) A lesão parcial C2 abole a atividade do diafragma ipsilateral. Uma leve atividade aparece aos 7 dias após a lesão, principalmente devido à atividade CPP. A deflexão rítmica do sinal observado no lado ipsilateral é devida à gravação artefacto do electrocardiograma. D) Seguindo um ferimento C2, a actividade diafragma contralateral permanece o mesmo que antes da lesão, e permite que o animal sobreviver. clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
Dificuldades técnicas de fazer o ferimento Modelo C2
O modelo murino lesão C2 é uma ferramenta interessante para estudar respiratória neuroplasticidade pós-lesional. No entanto, os passos necessários para produzir um modelo reproduzível e confiável são numerosos e cada um pode ter um impacto sobre o resultado do estudo. Por exemplo, durante o processo de intubação, o maior cuidado deve ser tomado uma vez que o tubo orotraqueal pode produzir uma inflamação da traqueia, que podem levar a diversas complicações, tais como insuficiência respiratória obstrutiva, para além da insuficiência respiratória inicial devido à própria lesão . Além disso, o acesso para a medula espinhal durante o procedimento cirúrgico, pode ser crítica para a recuperação do animal. Todos os passos (a dissecção muscular / retracção, laminectomia dorsal, durotomy, o próprio ferimento) tem de ser realizada com muito cuidado, devido à presença de diversas artérias em torno do local da cirurgia e para a medulacabo. Extensa hemorragia deve ser evitado, pois a recuperação pós-cirúrgica pode ser prejudicada pela perda de sangue, e isquemia medular pode ocorrer, além da lesão.
Outra parte importante a ter em conta é a limpeza dos instrumentos e da sala onde a cirurgia é realizada. Apesar do fato de que antibióticos são injetadas no animal e extremo cuidado sobre foram utilizadas as condições de "pseudo-estéril" durante a cirurgia, infecção bacteriana pode ocorrer e afetar todo o estudo planejado para ser realizado neste modelo. Por exemplo, a inflamação sistêmica induzida pela injeção de lipopolissacarídeo abolirá neuroplasticidade respiratória 22, e poderia ter um impacto e / ou ocultar a neuroplasticidade espontânea subseqüente ou o efeito de estratégias de restauração putativos. A monitorização da temperatura do corpo durante todo este procedimento pode também participar para o sucesso de tornando este modelo experimental. Com efeito, a hipotermia pode agir como umeuroprotectant para lesão medular aguda e pode induzir alguns efeitos benéficos (ver Ahmad et al. 23 para revisão).
A seção 2 do colo do útero em um modelo murino é um modelo drástica em termos de deficiência (locomoção). É comum observar uma perda de peso de uma semana após a lesão devido ao fato de que o animal está hemiplégico e experimenta algumas dificuldades para chegar a comida e água. Ajuda apropriada é realizada pelo operador da pós-cirurgia para assegurar que a perda de peso é de cerca de 20% do peso inicial (alimentação manual). Assim, o ponto final do modelo é uma queda de peso de 30% do peso corporal inicial de uma semana. Cerca de uma semana após a cirurgia, os animais se recuperam lentamente uma locomoção parcial permitindo-lhes a capacidade de se alimentar e recuperar o peso (ver 24 Lovett-Bar et al. Para o estudo da recuperação locomotora).
No final do estudo, uma vez que a lesão é C2 "handmade "pelo cirurgião, para o bem de reprodutibilidade e confiabilidade do modelo, a extensão de cada lesão tem que ser reconstruído por meio de técnicas histológicas. Especialmente, quando neuroplasticidade respiratória é estudado, Fuller et al. 21 mostrou que a quantidade de recuperação respiratória após uma lesão C2 foi correlacionada com a massa branca ventral poupado restante.
Benefícios do uso de um modelo de rato de lesão C2 para estudar Neuroplasticidade respiratória pós-lesional
O modelo murino C2 para estudar a fisiologia respiratória pós-lesional e / ou estratégias de putativos para melhorar / restaurar a insuficiência respiratória apresenta muitas vantagens, pois: 1) ratos estão prontamente disponíveis a partir de criadores comerciais em todo o mundo; 2) por causa de seu pequeno tamanho e vida útil curta, as condições ambientais podem ser cuidadosamente monitorizado e estritamente controlado desde o nascimento até a idade adulta; 3) ratos tornaram-se o modelo de primeira of neurobiologia respiratório, substituindo o modelo mais tradicional, gatos. Assim, os dados extensos estão disponíveis na literatura sobre neuroanatomia rato, neuroquímica, neurofisiologia e respostas ventilatórias reflexas, fornecendo contexto para realizar e interpretar os resultados experimentais; 4) a (relativamente) baixo heterogeneidade genética entre estirpes de rato disponíveis comercialmente permite a redução no número de animais necessários para atingir o poder estatístico, e facilita a comparação de resultados entre diferentes laboratórios; 5) os ratos têm uma taxa de mortalidade muito baixa após lesão medular cervical que reduz o número de animais necessários para poder estatístico; 6) os ratos têm uma taxa de recuperação do motor muito rápido após lesão medular cervical (por exemplo, contra os gatos, cães ou primatas). Consequentemente, a utilização de ratos reduz a duração de tempo que o animal requer cuidados intensivos pós-cirúrgico (por exemplo, expressão da bexiga, a administração de fluido, etc), e minimizes animais sujeitos perigo; 7) ao contrário da função locomotora, a função respiratória não requer motivação animal e é facilmente quantificável (EMG, nervo frênico ENG, volume corrente diafragma e frequência); 8) um aspecto chave é o "fenômeno frênico atravessado" (CPP). Este tópico em particular tem uma extensa literatura publicada usando ratos como modelo (ver Goshgarian et al 5,16 para ser avaliado.); 9) Os ratos e os seres humanos compartilham muitas características comuns em seu sistema de controle respiratório, o que torna o rato um bom modelo para o estudo pré-clínico de insuficiência respiratória após SCI12 cervical. Além disso, um laboratório começou a desenvolver com sucesso uma hemissecção C2 em um modelo de rato 25. Esta abordagem proporciona um grande entusiasmo sobre o futuro uso de animais transgênicos.
Um modelo animal mais clinicamente relevante é uma lesão contundente ao nível cervical 26-28. No entanto, a reprodutibilidade da lesão é inconsiStent, principalmente devido à localização das vias respiratórias descendente ea impossibilidade de fazer uma extensa contusão (que irá reduzir drasticamente a taxa de sobrevivência dos animais). Mais trabalho tem que ser feito na elaboração de modelos de contusão para determinar a forma adequada para induzir uma lesão contundente com déficits permanentes.
Usos para o ferimento Modelo murino C2
Este modelo C2 SCI é particularmente pertinente para o estudo de vários tipos de plasticidade. Por exemplo, alterações moleculares e celulares a partir dos pré-motoneurónios lesionados identificados localizados no tronco cerebral (rVRG núcleo) 29, bem como os neurónios motores frênicas desaferentada nível 30-32 foram estudados. Os processos inflamatórios subseqüentes 33 e as mudanças citoarquitetural (líquido perineuronal muda 10) foram investigados após uma C2 SCI. As mudanças estruturais da coluna vertebral (implicação de pa substitutivathways 34 eo envolvimento de interneurônios espinhais 8) ou as alterações ultra-estruturais na placa motora diafragma 4 também participam ativamente na recuperação espontânea da atividade respiratória após uma C2 SCI. O tópico mais estudado no modelo C2 SCI são as conseqüências fisiológicas da lesão inicial em todo o sistema respiratório (volume corrente, a freqüência em animais não anestesiados 24) e sua posterior recuperação espontânea (em preparações anestesiados, ou seja, a atividade do nervo frênico 17, diafragma actividade de 16,17 e, mais recentemente, a actividade intercostal 35). Este modelo murino C2 SCI também tem sido utilizada para estudar a insuficiência dos membros posteriores e a recuperação espontânea subsequente recuperação e induzida a seguir uma estratégia não-invasiva (hypoxias intermitente 24).
Conclusão
O modelo murino C2 SCI é um poderoso umª útil pré-clínica modelo para estudar respiratória e neuroplasticidade não respiratória e testar diversas estratégias terapêuticas putativos que podem melhorar a respiração em pacientes com LM.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo financiamento do programa-quadro da União Europeia Sétimo (FP7/2007-2013), sob contrato de subvenção n ° 246556 (projeto RBUCE-UP Europeia), HandiMedEx atribuído pelo Conselho de Investimento Público francês. Marcel Bonay foi apoiado pelo Chancellerie des Universidades de Paris (Pernas Poix), o Fonds de Recherche en Santé Dotation respiratoire, eo Centre d'Assistência respiratoire domicílio d'Île de France (CARDIF)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| Male Sprague Dawley Rat | Janvier | 225-250 g | |
| Surgical Instruments | |||
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tool | 91150-20 | |
| Student Standard Pattern Forceps | Fine Science Tool | 91100-12 | |
| Mayo-Stille Scissors | Fine Science Tool | 14013-15 | Curved |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tool | 91500-09 | Straight |
| Spring Scissors - 8 mm Blades | Fine Science Tool | 15025-10 | Straight Blunt/Blunt |
| Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tool | 16121-14 | Curved |
| Dissecting Knife - Fine Tip | Fine Science Tool | 10055-12 | Straight |
| Olsen-Hegar Needle Holder | Fine Science Tool | 12002-14 | Serrated |
| Weitlaner-Locktite Retractor | Fine Science Tool | 17012-11 | 2x3 Blunt |
| Absorbable surgical sutures | Centravet | BYO001 | Suture size 4-0 |
| Equipment | |||
| Hot Bead Steriliser | Fine Science Tool | 18000-45 | |
| Catheter | Centravet | CAT188 | 16 G |
| Laryngoscope | |||
| Guide wire | |||
| Laryngeal mirror | Centravet | MIR011 | |
| Lactated Ringers | Centravet | RIN020 | |
| Syringe | Centravet | ||
| Needle | Centravet | ||
| O2 | Air Liquid | I1001M20R2A001 | |
| 683 RodentT Ventilator 115/230V | Harvard Apparatus | 55-0000 | |
| Stand-Alone Vaporizer | WPI | EZ-155 | |
| Thin line heated bed | WPI | EZ-211 | |
| Air canister | WPI | EZ-258 | |
| Drugs | |||
| Carprofen | Centravet | ||
| Rimadyl | Centravet | RIM011 | |
| Buprenorphine | Centravet | BUP001 | |
| Baytril | Centravet | BAY001 | |
| Dexmedetomidine | Centravet | DEX010 | |
| Atipamezole | Centravet | ANT201 | |
| Betadine solution | Centravet | VET002 | |
| Isoflurane | Centravet | VET066 | |
References
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