Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Brain Slice Biotinylering: An doi: 10.3791/51240 Published: April 3, 2014

Summary

Neuronal membran människohandel kontrollerar dynamiskt plasmamembranprotein tillgänglighet och kraftigt påverkan neurotransmission. Hittills har det varit en utmaning att mäta neuronal endocytic handel med vuxna nervceller. Här beskriver vi en mycket effektiv, kvantitativ metod för att mäta snabba förändringar i ytprotein uttryck ex vivo i akuta hjärnsnitt.

Abstract

Reglerad endocytic människohandel är den centrala mekanismen underlätta en mängd olika neuromodulatory händelser, genom att dynamiskt styra receptor, jonkanal och transportör cellytan presentation på en minuters tidsskala. Det finns en bred mångfald av mekanismer som styr endocytic handel med enskilda proteiner. Studier som undersöker de molekylära grunderna för människohandel har i första hand åberopas ytan biotinyleringen att kvantitativt mäta förändringar i membranprotein yta uttryck som svar på exogena stimuli och genmanipulation. Dock har denna metod varit huvudsakligen begränsad till odlade celler, som kanske troget återspeglar de fysiologiskt relevanta mekanismer som spelar in i vuxen nervceller. Dessutom kan odlade cell metoder underskattar regionspecifika skillnader i människohandel mekanismer. Här beskriver vi en strategi som sträcker sig cellytan biotinyleringen till den akuta hjärn skiva beredning. Vivisa att denna metod ger en hifi-metod för att mäta snabba förändringar i membranprotein yta nivåer hos vuxna nervceller. Denna strategi kommer sannolikt att ha en bred användbarhet inom neuronal endocytic människohandel.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Endocytic människohandel är en allestädes närvarande cellulär mekanism som finjusterar plasmamembranet presentera en mängd olika integrerade membranproteiner. Endocytos levererar viktiga näringsämnen till den intracellulära miljön 1 och desensitizes receptor signalering som svar på receptoraktivering 2. Endocytic återvinning tillbaka till plasmamembranet kan dessutom öka cellulär signalering genom att öka proteinexpressionsnivåer på cellytan 3. Dessutom är membran människohandel störningar inblandad i många sjukdomar och patologiska förhållanden 4,5 och betonade behovet av att undersöka de molekylära mekanismer som styr protein endocytic trafficking. Medan många proteiner använder klassiska clathrin beroende internamekanismer, monterings bevis under de senaste åren visar att flera clathrin oberoende endocytiska mekanismer styr endocytic potentialen i ett ökat utbud avproteiner 6,7. Därmed har behovet av att utreda endocytiska mekanismer som underlättar handel med fysiologiska relevanta system ökat avsevärt.

I hjärnan har endocytic handel med receptorer, jonkanaler och signalsubstanstransportörer en primär roll i upprättandet av synaptisk plasticitet 8-11 och reaktion på droger av missbruk 12-15, i slutändan påverkar neuronala retbarhet och synaptiska svar. Hittills har merparten av neuronala studier människohandel är beroende antingen heterologa expressionssystem eller odlade primära nervceller, varav ingen får en tillförlitlig bild mekanismer som spelar in i vuxen nervceller. Här rapporterar vi en metod som använder ytan biotinyleringen att kvantitativt mäta ytan proteinnivåer i akut hjärnan skivor som härrör från vuxna gnagare. Med hjälp av denna metod, presenterar vi uppgifter som visar att musen striatal dopamin transportören internaliserar snabbt i rerespons till forbolester-medierad proteinkinas C (PKC)-aktivering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurhantering och vävnads skörd utfördes i enlighet med riktlinjerna från University of Massachusetts Medical School Institutional Animal Care användning kommittén (IACUC), efter det godkända protokoll # A1506 (Melikian, PI).

Obligatoriska lösningar

Konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) - Se färskt dagligen

125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCOs 3, och 11 mM glukos

OBS: Förbered ACSF som en 10x stamlösning, exklusive NaHCOs 3 och glukos. Gör 1x arbetslösningar dagligen från 10x lager, komplettera med färsk NaHCOs 3 och glukos.

Sackaros-kompletterad ACSF (SACSF) - Se färskt dagligen

250 mM sucros, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCOs 3, och 11 mM glukos

OBS: Förbered SACSF som en 10x stamlösning, exklusive NaHCOs 3 och glukos. Gör 1x arbetslösningar dagligen från 10x lager, komplettera med färsk NaHCOs 3 och glukos.

Sulfo-N-hydroxisuccinyl-SS-biotin (sulfo-NHS-SS-biotin, Pierce Chemical Company)

Stamlösningarna bör vara 200 mg / ml i DMSO och är resistenta mot flera frysnings / upptiningscykler. Alikvoter lagrades vid -20 ° C. Den succinyl stern hydrolyseras snabbt i vattenlösning, så att fungerande lösningar skall beredas omedelbart före ansökan till skivor.

Slice Quench Lösning

ACSF kompletterad med 100 mM glycin

RIPA Lysis Buffer

10 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,0 mM EDTA, 1% Triton-X-100, 0,1% SDS, 1% Na-deoxicholat

RIPA med proteashämmare (RIPA / PI) - Se färskt dagligen

RIPA kompletterat med 1 pM leupeptin, 1 pM pepstatin, 1 fiM aprotinin och 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid.

1. Förbered Brain Slices

  1. Gör fräsch 1x SACSF och 1x ACSF
  2. Chill SACSF på is i en liten bägare. Detta kommer att användas för att hålla den nyskördade musen hjärnan.
  3. Mätta ACSF och SACSF med syre genom att bubbla med 95% / 5% O 2 / CO 2, 20 minuter på is.
  4. P30-38 möss bör användas för optimal vävnadslivsduglighet. Offra djuren genom halshuggning och halshuggning, och snabbt ta bort hjärnor i förkyld, syresatt SACSF.
  5. Med hjälp av en vibrerande mikrotom, gör 300 ìm hjärnan sektioner i regionen av intresse.
  6. Om så önskas, kan skivor ytterligare dissekeras före återvinning för att berika för särskilda områden i hjärnan eller separata höger och vänster hjärnhalva för att använda som kontroll och experimentella skivor, respektive.
  7. Med hjälp av en brand-polerat pasteurpipett, överföra skivor för mesh-botten kammare som i 24-hålsplattor.
  8. Tillåt skivor återhämta sig under 40 min, 31 ° C i syresatt ACSF, med kontinuerlig, försiktig bubbling.

2. Läkemedelsbehandling (i förekommande fall) och Slice Biotinylation

  1. Efter återhämtning, tvätta skivor 3x i förvärmd (37 ° C), syresatt ACSF bubblande konstant med 95% / 5% O 2 / CO 2.
  2. Lägg testföreningar och inkubera med kontinuerlig syresättning.
    1. För enkelhetens skull lägga till en 1/10: e volym på 10x koncentrerad läkemedel, och blanda genom att försiktigt vända.
    2. Skaka plattorna försiktigt i ett vattenbad vid den önskade temperaturen.
  3. Efter läkemedelsbehandling, snabbtchill skivor genom att tvätta 3x i iskallt ACSF.

3. Biotinylera ytproteiner

  1. Bered 1,0 mg / ml sulfo-NHS-SS-biotin i iskallt ACSF omedelbart före märkning.
  2. Lägg till 0,75 ml sulfo-NHS-SS-biotin till skivor och inkubera skivor på is, 45 min.
  3. Tvätta skivor snabbt tre gånger med iskallt ACSF, sedan inkubera i 10 minuter i iskallt ACSF på is.
  4. Tvätta skivorna tre gånger med iskall skiva släckningsbuffert och inkubera med 0,75 ml skiva quench buffert två gånger, 25 min, på is för att stoppa fri sulfo-NHS-SS-biotin.

4. Förbered Vävnads Lysat

  1. Tvätta skivorna tre gånger i iskallt ACSF och överföra varje skiva till en mikrocentrifugrör med hjälp av en brand-polerat pasteurpipett.
  2. Pellets försiktigt skiva genom att centrifugera 200 xg, 1 min och försiktigt aspirera återstående ACSF.
  3. Addera 400 pl iskall RIPA / PI och bryta upp vävnaden genom att pipettera upp och ned en gång genom en P200 pipette.
  4. Transfer dissocierade skiva / RIPA till ett nytt rör och inkubera i 30 min, 4 ° C, rotering, för att slutföra lys.
  5. Pellecellrester genom centrifugering, 18.000 xg, 15 min, 4 ° C.
  6. Bestäm lysat proteinkoncentrationer med användning av BCA-proteinanalysen med bovint serumalbumin (BSA) som en standard.

5. Isolera Biotinylerade Proteiner

  1. Optimera Bead / totalt proteinförhållande.
    OBS: Individuella proteinexpressionsnivåer kan variera kraftigt mellan olika områden i hjärnan. Om inte alla av biotinylerat protein i en given mängd vävnad lysat fångas, är det inte möjligt att exakt upptäcka eventuella förändringar i ytan uttryck. Därför är det absolut nödvändigt att empiriskt bestämma den optimala vulst / totalt proteinförhållande för ett särskilt protein / hjärnregion innan man inleder en ny skiva biotinylering studien.
    1. Inkubera 25 il streptavidin agarospärlor med ökande mängds vävnads lysat (ungefärliga intervallet 25-200 mikrogram) och fortsätt enligt nedan för bindning, tvätt och elueringsstegen.
    2. Kvantifiera de resulterande immunreaktiva band och väljer en pärla / lysat förhållandet i det linjära området av bindning som möjliggör noggrann kvantifiering av antingen ökad eller minskad proteinytan uttryck.
  2. Förbered streptavidin-agarospärlor
    1. Bestäm total pärla volym som krävs för alla prover. Förbered en tillräckligt sträng volym för det beloppet plus en extra (dvs. 4 prover vid 25 il / prov = 100 ^ pärlor + en extra = 125 il pärlor.
    2. Vortex Streptavidin pärla lager och pipett ut önskad volym. Om du använder en P200 pipett, avskurna änden av spetsen för att förhindra blockering eller pärla skador.
    3. Tvätta pärlorna tre gånger i 0,5 till 1,0 ml RIPA / PI för att avlägsna konserveringsmedel, vortexa efter varje RIPA tillsats och uttag av pärlor mellan tvättar genom centrifugering 18.000 xg, 1 min, vid rumstempeturen.
    4. Sug bort buffert mellan tvättningar med användning av en glas pasteurpipett ansluten till en vakuumkolv. En plast P200 spets fäst i änden av glaset pasteurpipett ger bättre kontroll när aspirera. Det är inte nödvändigt att avlägsna absolut all buffert under de första två tvättarna, eftersom det riskerar att aspire pärlor in i pipetten. Efter den slutliga tvätten, ta bort så mycket överskott av buffert som möjligt utan att aspirera pärlorna.
    5. Lägg RIPA / PI för att få kulor tillbaka till sin ursprungliga volym, pipettera upp och ner för att blanda. Undvik virvelbildning vid denna punkt, eftersom kulor fastnar på rörväggen.
    6. Alikvotera pärlor i mikrocentrifugrör med hjälp av en P200 med spetsen avskuren. Pipettera upp och ned flera gånger mellan provtagning för att försäkra pärlor förblir jämnt svävande och spridda bland rören.
  3. Bind biotinylerade proteiner till streptavidin pärlor
    1. Fördela cellysat till rören innehåller agarospärlorna. För experiment whe re flera prover jämförs, se till att använda samma mängd protein för varje prov för korrekta jämförelser.
    2. Lägg till ytterligare RIPA / PI för att ta med till prov till en 200 l minimal volym. Detta försäkrar att prover kommer att blanda ett adekvat sätt under inkubation och även förenar proteinhalter över prover.
    3. Placera rören i en tub rotator och blanda över natt vid 4 ° C.
    4. I separata rör, dosera en motsvarighet till det totala lysat volym som används för varje prov. Alternativt, om provvolymer är höga, en bråkdel av det totala lysatet volym kan reserveras i stället, för att rymma maximala lastvolymer på SDS-PAGE-geler. Dessa kommer att användas för att normalisera ytexpression till den totala proteinmängden.
    5. Lägg antingen en lika stor volym av 2x eller 1/5 volym av 6x SDS-PAGE-provbuffert och antingen inkubera vid 4 ° C, parallellt med däckfots prover, eller förvara vid -20 ° C tills proverna analyseras.
ove_title "> 6. Elute och analysera prov

  1. Pelle pärlorna genom centrifugering 18.000 x g, 2 min, vid rumstemperatur.
  2. Aspirera supernatanten och tvätta pärlor tre gånger med 0,75 ml RIPA. För att minimera pärla förlust, lämna ett litet huvud volym buffert ovanför pärlor mellan tvättar. Efter den slutliga tvätten, ta bort så mycket RIPA som möjligt, utan att störa pärlpelleten.
  3. Eluera biotinylerade proteiner från streptavidinpärloma genom att minska disulfidkoppling. Tillsätt 25 | il 2x SDS-PAGE reducerande provbuffert, vortex väl och rotera proverna 30 minuter, rumstemperatur.
    Anm: Många membranproteiner har en hög tendens att aggregera när kokades i SDS-PAGE-provbuffert, vilket allvarligt försämrar deras elektroforetiska mobilitet. Om detta är fallet för det protein som undersöks, undvika uppvärmning av prover, och i stället, eluera långsamt vid rumstemperatur. Om kokning är absolut nödvändigt (t.ex. om ett annat protein bedöms parallellt kräver kokning), sample buffert kan kompletteras med 2 M urea (slutkoncentration) för att minimera aggregering. Medan effektiva för att minska aggregationen i vissa fall kompromissar urea ofta band utseenden.
  4. Analysera prover genom immunoblotting.
  5. Tina totala lysat prover och rotera parallellt med däckfots prover, 30 min, rumstemperatur.
  6. Separata proteiner på SDS-PAGE-geler.
  7. Identifiera protein (er) av intresse genom immunoblotting.
    1. Var säker på att band detekteras i det linjära området för upptäckt för korrekt kvantifiering.
    2. För att säkerställa att biotinyleringsreagens inte har fått tillgång till intracellulära proteiner via skadade / infekterade celler. Detta uppnås bäst genom immunoblotting parallellt för ett intracellulärt protein är specifik för den celltyp som undersöks.
    3. Kvantifiera bandtäthet och beräkna relativ proteinytan densitet som en procent av den totala proteinexpressionsnivå.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den neuronala dopamintransportörer är internaliserad som svar på PKC-aktivering i cellinjer 16-20. Trots många rapporter som visar PKC-inducerad DAT yta förluster i en rad olika cellinjer och expressionssystem, har det varit en utmaning att bekräfta detta fynd i odlade dopaminerga neuron 21-23. Vi använde musen striatum skivor för att direkt testa om DAT internaliserar svar på PKC-aktivering i vuxna dopaminerga neuroner. Efter skiva framställning togs skivor hemisected längs mittlinjen och segment från identiska plan behandlades ± 1 | iM forbol-myristat-13-acetat (PMA) under 30 min, 37 ° C. Skivor var snabbt kylda och ytproteiner biotinylerades och isolerades såsom beskrivs i protokollet. Immunoblots sonderades för DAT, och även för tyrosin hydroxylas (TH), parallellt, för att mäta om biotinyleringsreagens fått någon intracellulär tillgång i dopaminerga neuroner. Såsom kan ses iFigur 1 (Top) upptäckte vi robust DAT yta uttryck i mus striatum i basala (vehikelbehandlade) villkor, med 81,4 ± 5,8% av det totala DAT vid cellytan. PKC-aktivering med 1 uM PMA, 30 min, 37 ° C minskade betydligt DAT ytexpression till 60,8 ± 5,2% total DAT, vilket motsvarar ca 30% förlust av DAT från plasmamembranet. Däremot var endast 1,6 ± 0,4% av de totala TH biotinylerad (fig. 1 nedtill), i överensstämmelse med dess intracellulär lokalisering och som bekräftar att den biotinyleringsreagens uteslöts från cellens inre av dopaminerga neuroner.

Figur 1
Figur 1. Akut PKC aktivering minskar dopamintransportörer yta nivåer hos vuxna striatala neuroner. Mouse Striatal Slice Biotinylation. Akuta mus striatala skivor framställdes såsom beskrivits i protokollet och behandlades ± 1 uM PMA, 30 min, 37 ° C. Ytproteiner kopplades kovalent till biotin och isolerades med sats streptavidin kromatografi. Proven genomgick SDS-PAGE och immunoblotting med rått-anti-DAT-och mus anti-TH-antikroppar. Immunoreaktiva band fångades med en VersaDoc CCD-kamera bildbehandling och densiteter från icke mättande band kvantifierades med hjälp Antal One. Överst: Representant immunoblot visar biotinylerad och total DAT och TH efter de angivna behandlingarna. Botten: Genomsnittlig uppgifter. Biotinylerad protein signal uttrycks som% totalt protein ± SEM * Signifikant skillnad från kontroll, Students t-test, p <0,03, n = 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trots mångåriga kunskap som endocytic handel kritiskt effekter synaptisk signalering i hjärnan, har det visat sig svårt att kvantitativt mäta förändringar i proteinytan uttryck hos vuxna nervceller. I detta arbete, rapporterar vi en tillförlitlig metod för att märka ytprotein ex vivo i akut hjärnan skivor. Brain skiva förberedelser har en lång historia av verktyg för elektrofysiologiska inspelningar, eftersom de upprätthåller synapsförbindelser och cellviabilitet upp till timmar efter beredning. Dessutom kan skivning strategier optimeras för att bevara specifika synaptiska kopplingar mellan olika hjärnregioner av intresse.

Mycket av tidigare arbete undersöker neuronal protein handel med hjärnan-härledda preparat har berodde främst på synaptosomer och primära odlade nervceller. Den akuta slice biotinylation tillvägagångssätt metod har flera fördelar jämfört med någon av these: Synaptosomer flyttats från axonen och får inte innehålla de molekylära faktorer som krävs för att troget rekapitulera intakt neuronal protein trafficking. Dessutom är synaptosomala preparat ofta förorenade med membranfragment som kan förvränga experimentella resultat. Primära neuronala kulturer är vanligtvis härledd från utvecklingsmässigt omogna neuroner som inte kan ha lämplig differentiering i sina mogna neuronala fenotyper som uttrycker cellspecifika trafficking mekanismer. Däremot akut skivor uppvisar hög grad av cellviabiliteten och härrör från vuxna djur. Dessutom kan ytan handel jämföras efter molekylära manipulationer in vivo, till exempel gen leverans / knockdown, optogenetic neuronal stimulering / hämning, eller efter in vivo läkemedelsbehandlingar eller beteendemässiga anpassningar.

Även om det finns många fördelar med att ex vivo slöss strategi, finns det flera begränsningar också. Akut (noncultured) hjärnan skivor har begränsad lönsamhet och är därför inte lämplig för kroniska läkemedelsbehandlingar. Dessutom konstaterade vi att de inte förbli livskraftig under temperaturskiftexperiment, där skivor snabbt kylda och rewarmed. Vidare, skivor är mest lönsamt när framställda av P21-P35 möss, eventuellt begränsa den tid som in vivo-behandlingar kan utföras innan du utför experiment. I själva verket, med hjälp av en hög sackaros lösning för kapning, finner vi att DAT trafficking är mindre reproducerbart observeras i skivor framställda från P35-P42 möss (Gabriel och Melikian, opublicerade data). Men observera att vi markant förbättrad slice livskraft i äldre djur med den modifierade skiva beredning som beskrivs av Zhao et al. 24 Denna metod är ett utmärkt alternativ där metodologiska parametrar behöver använda äldre djur (dvs. Efter eithennes virusmedierad protein / RNA-uttryck, upprättande av beteenden, eller kronisk in vivo läkemedelsbehandlingar).

Det finns flera andra tekniska faktorer som kan påverka den experimentella resultat. Det är absolut nödvändigt att empiriskt bestämma den optimala pärla / total proteinhalt som krävs för att fånga in alla de biotinylerade protein i en given mängd av total-lysat proteinet före försök kvantitativa experiment. Denna fråga är ofta förbisedd, men kan vara den avgörande faktorn i att kunna upptäcka förändringar i proteinytan uttryck. Om alla de biotinylerade proteinet inte är kvantitativt återvinns, kommer förändringar i ytan nivåer antingen vara omätbara eller felaktigt mätt. En annan variabel som kan påverka resultaten är volymen av lysbuffert används för att dissociera de vävnadsskivor. Den absoluta vävnadsmassa som används kommer att bero på det intressanta området som undersöks, och kommer likely kräva mer eller mindre lysbuffert för att uppnå komplett vävnads solubilisering. Som sådan, kan slut lysat protein koncentrationer också variera mellan hjärnregioner. Därför bör lys betingelser bestämmas empiriskt för en given hjärnregion och hålls konstant mellan oberoende försök.

Sammanfattningsvis ger vi ett detaljerat protokoll för mätning av neuronal protein handel med vuxna nervceller med hjälp av ex vivo akut hjärnan skivor. Utnyttjande av denna metod kommer sannolikt att leda till en djupare förståelse av endocytiska människohandel mekanismer som ligger bakom neuronal funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga ekonomiska intressen som står i konflikt med detta arbete.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats av NIH bidrag DA15169 och DA035224 till HEM

Materials

Name Company Catalog Number Comments
sulfo NHS-SS-biotin Pierce 21331
Streptavidin agarose Pierce 20347
IgG-free, Protease-free bovine serum albumin Sigma A3059
Vibrating microtome sectioner various
Shaking water bath various
Millicell mesh-bottomed inserts (8 µm pore size) Millipore PI8P 012 50 These can be washed by hand and reused

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
  2. Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
  3. Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
  4. Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
  5. Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. 127-141 (2012).
  6. Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
  7. Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
  8. Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
  9. Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
  10. Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
  11. Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
  12. Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
  13. Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
  14. Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
  15. Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
  16. Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
  17. Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
  18. Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
  19. Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
  20. Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
  21. Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
  22. Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
  23. Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
Brain Slice Biotinylering: An<em&gt; Ex vivo</em&gt; Metoden att mäta Region specifika Plasma membranprotein handel med vuxna nervceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons. J. Vis. Exp. (86), e51240, doi:10.3791/51240 (2014).More

Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons. J. Vis. Exp. (86), e51240, doi:10.3791/51240 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter