Summary
미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
미토콘드리아 단백질의 대부분은 핵으로 인코딩 및 세포 기관으로 수입 할 필요가있다. 단백질이 미토콘드리아 근처에 합성하는 동안 수입이 발생할 수 있습니다. 이 가능성에 대한 지원은 미토콘드리아 단백질을 코딩하는 많은의 mRNA가 미토콘드리아 부근에 지역화하는 것으로 된 최근 연구에서 파생됩니다. 함께 외부 막과 리보솜 협회 이전 시위, 이러한 결과는 현지화 번역 과정을 제안한다. 현지화 번역, 수입 효율을 향상 독특한 규제 사이트를 제공하고 자궁외 표현의 경우를 최소화 할 수 있습니다. 다양한 방법이 지역화 된 번역을 중재 요인과 요소를 특성화하기 위해 사용되어왔다. 이 가운데 표준 차동 원심 분리하여 세포 내 분획이다. 이 프로토콜은 하나의 절차에서 mRNA가 리보솜 단백질의 분리의 장점이 있습니다. 이들은 다음 다양한 분자량 및 BI에 의해 특성화 될 수있다ochemical 방법. 또한, transcriptomics 및 프로테오믹스 방법하여 게놈 넓은 통찰력에게 수, 생성 된 물질에 적용 할 수 있습니다. 이러한 연구의 모델 생물로 효모의 활용 속도, 비용과 단순성의 이점이있다. 또한, 진보 된 유전 도구와 사용 가능한 삭제 균주 후보 요인의 검증을 용이하게한다.
Introduction
진핵 세포는 특정 기능을 가지는 별개의 구획으로 구성되어 있습니다. 그 기능을 수행하기 위해, 각 구획의 활동에 필수적인 단백질의 고유 한 집합이 포함되어 있습니다. 이 단백질은 자신의 구획에 접근 통해 가능한 메커니즘은 로컬 라이즈 1,2입니다. 이 과정에서, 단백질은 리보솜 군데 위치에서 mRNA를 대상으로 합성된다. 현지화 번역의 가능성 장점이 단백질의 타겟팅의 효율성을 증가하는 가운데, 단백질 보호자에 필요한 감소하고, 사이트 별 규제 메커니즘을 가능하게한다. 또한, 지역화의 mRNA와 리보솜은 일반 번역이 억제되어 세포 스트레스의 경우 번역 기계의 외딴 저장 될 수 있습니다.
미토콘드리아는 최근 몇 년 동안 현지화 번역을 연구 중심 모델이되었다. 대부분의 미토콘드리아 단백질은 세포질로 번역 핵, 인코딩 된와 세포 기관으로 수입. 증거의 다양한 라인이 단백질의 많은 지역의 번역 과정을 통해 생산되는 것을 나타냅니다. 처음에는 전자 현미경 및 생화학 적 분류 연구는 미토콘드리아 3-5과 관련된 변이를 발견했습니다. 다음 만 cotranslational 방식으로 6,7 가져온 것으로 나타났다 특정의 mRNA에 일에 의해 생체 내에서 뒷받침 이러한 연구. 미토콘드리아와의 mRNA 협회의 게놈 넓은 연구의 mRNA의 상당 부분이 미토콘드리아 부근 8-10로 지역화 된 것으로 나타났다. 이들의 mRNA 중 일부는 또한 생선이나 MTAG 9, 11 등의 생체 내 형광 방법을 특징으로했다. 이 협회의 직선적 해석은 이들의 mRNA가 현지화 번역에 대한 템플릿 역할을한다는 것입니다.
이들의 mRNA가 미토콘드리아에 접근하는 메커니즘은 알려져 있지 않다. 비 암호화 도메인 (대부분의 significantlY 3 '의 UTRs)은 미토콘드리아 12 mRNA의 연관에 관여하는 것으로 나타났다. 이 도메인은 자신의 전송을 중재 RNA 결합 단백질에 결합 부위의 역할을 할 가능성이있다. 효모의 연구는 단백질의 PUM 가족 (Puf3)의 회원이 미토콘드리아 8,13와 mRNA의 연결을 지원하는 것으로 나타났다. 다른 가족 구성원의 기능을 기반으로 Puf3에 대한 그럴듯한 역할은 mRNA의 라우팅 14 엉 동안 번역을 억제하는 것입니다. 따라서,의 mRNA는 비 암호화 영역과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질에 의해, 비 번역 상태로 운송 할 수있다. 또한, 작품의 큰 몸은 단백질이 합성되는 동안 전송이 발생하는 것이 좋습니다. 특히, 번역 억제제의 mRNA에게 연결 8,13에 영향을 표시했다. 또한, 같은 8월로 번역 기능은, 미토콘드리아 타겟팅 순서 (MTS) 또는 ORF 영역은 현지화 8,11,15에 도움을 나타내었다. HSP70 세대 단백질 채널미토콘드리아 외부 막에 aperone 단백질 수용체는 또한 추가로 인코딩 된 단백질의 기능은 mRNA의 현지화 16 중요하다는 것을 의미한다, mRNA의 연결을 지원하기 위해 표시했다. 이는 리보솜 대두 단백질이 미토콘드리아에 17의 mRNA-리보솜 단백질 복합체를 표적 인식을위한 요소로서 기능하는 모델과 일치한다.
미토콘드리아 부근의 현지화 된 번역은 전자 현미경 (리보솜을 시각화하기 위해) 3 FISH 9, (특정의 mRNA를 검출하는) 녹색 RNA 11, 생화학 적 분류 (RNA와 리보솜을 모두 감지하는) 10,18 등 다양한 방법으로 연구 하였다. 전자의 방법은 생체 내에서 현지화를 감지하고 전송 역학의 시각화를 허용 할 수 있지만, 후자는 하나의 실험에서 여러 가지의 mRNA를 검출 할 수 있습니다. 또한, 생화학 분류 코딩 또는 비 암호화 도메인에 대해 알 수 필요가 없습니다까지 입력 그러므로 특정 역할이 평가 될 수있다. 생화학 분별 성공적 많은 다른 세포 구획 분리를 위해 수년 동안 사용되어왔다. 그 원칙과 한계는 잘 설립하고, 하나는 쉽게 다른 목적을 위해 기존의 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 필요한 장비, 따라서 그것은 일반적으로 세포 내 현지화를 공부에 대한 선택의 첫 번째 방법이다, 많은 실험실에서 표준입니다. 우리는 리보솜이 미토콘드리아와 관련된 동안의 mRNA의 분리에 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 따라서 미토콘드리아 부근의 현지화 번역에 관련된 요인을 공부에 최적입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 미토콘드리아 정화
세포의 펠렛을 단다. 약 0.6 g을 100 ㎖의 세포에서 얻을 수있다.
- 30에서 600 = 1.5 과다 복용 효모 세포의 100 ~ 150 ㎖의 성장 미토콘드리아에 대한 풍부하기 위해, 이러한 갈락토스 기반 성장 매체로서 nonfermentable 성장 배지에 C를 °.
- 원심 분리기 세포 실온에서 5 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다.
- 다시 증류수와 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. 상층 액을 버린다.
- 세포의 0.5 g 당 1 ㎖ DTT 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 그것에 의해 가수 분해를 향상 세포벽 내 이황화 결합을 파괴하기 위해 환원제로 세포를 치료하는 데 중요하다.
- 30에서 10 분 동안 세포를 배양한다 부드러운 흔들림와 C를 °. 한편, 세포 1g 당 6 밀리그램 zymolyase의 무게를 Zymolyase 버퍼에 일시 중지합니다.
- 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포T 실내 온도와 상층 액을 버린다.
- 세포의 0.15 g 당 1 ㎖ Zymolyase 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 없는 소용돌이를 수행합니다.
- 물 990 μL에있는 세포의 10 μL 나누어지는의 OD 600을 측정합니다.
- β-1, 3 - 글루칸 결합에 포도당 중합체를 가수 분해 spheroplasts를 생성하는 세포에 Zymolyase (단계 1.5)를 추가합니다. 이 단계에서, spheroplasts 용균을 피하기 위하여 등장액에 보관한다.
- 부드러운 흔들림으로 30 ° C (zymolyase 최적의 활동에 대한)에서 15 분 동안 세포를 품어. 세포벽과 spheroplasts 세대의 가수 분해를 확인하기 위해, 물 990 μL와 세포의 10 μl를 섞는다. Spheroplasts 인해 삼투압 차이에 용해 할 것으로 예상되고, OD (600)은 적어도 1.9 단계에서 결정된 값 미만을 10 배량한다. 그렇지 않을 경우, 또 다른 15 분 동안 zymolyase과 배양을 계속합니다.
- 상온에서 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포. 조심스럽게 병에 감염카드 상층 액, 펠릿으로 불안정 할 수 있습니다.
- Zymolyase 버퍼 spheroplasts을 세척하고 상층 액을 버린다.
- 100 ㎖의 복구 매체와 spheroplasts을 재현 탁. 삼각 플라스크에 spheroplasts를 전송하고 30에서 1 시간 동안 배양 동요와 C를 °. Zymolyase 처리 번역 중에 체포되고, mRNA의 현지화 (그림 1B) 중단되기 때문에이 복구 단계가 필요합니다.
- 예비 냉각 50 ML 원뿔 튜브에 0.1 ㎎ / ㎖의 CHX 및 전송 spheroplasts를 추가합니다. CHX의 추가의 mRNA와 리보솜 협회를 동결하는 것이 중요합니다. 따라서, 미토콘드리아와 리보솜에 의존하는 mRNA의 관계가 유지됩니다.
- 원심 분리기 spheroplasts 4 ° C에서 5 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다.
- 차가운 만니톨 버퍼로 두 번 씻으십시오.
- 4 ML 차가운 만니톨 버퍼 spheroplasts을 재현 탁하고 꽉 끼는을 갖춘 15 ㎖의 용량의 다운스 균질로 전송유. 조심스럽게 15 선을 spheroplasts을 중단하고 13 ML 튜브에 해물을 전송합니다.
- 핵 및 손상되지 않은 세포를 펠렛 4 ° C에서 10 분 동안 1,500 XG에서 해물을 원심 분리기.
- 조심스럽게 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 미분 획 샘플 ( "전체"샘플)로 옆으로 시료 1 ㎖ (25 %)을 설정합니다. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다. "총"샘플의 나머지 침전물 RNA는 (프로토콜 3, RNA 침전 참조).
- 4시 10 분 10,000 XG에 뜨는을 원심 분리기 미토콘드리아 펠렛 C를 °.
- 새로운 튜브에 뜨는 (~ 3 ㎖)를 전송하고 얼음에 보관. 이것은 "세포질"조각이다. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다. "세포질"샘플의 나머지 침전물 RNA는 (보호 해주는에게보기ocol 3, RNA 침전).
- 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 XG에 다시 3 ㎖ 만니톨 버퍼와 원심 분리기와 펠렛을 씻으
- 3 ㎖ 만니톨 버퍼와 펠렛을 Resuspend. 이 샘플은 미토콘드리아를 포함하고 "미토콘드리아"분수로 함. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다.
2. RNA 추출
- 각 샘플에 8 M 구 아니 디늄-HCl을 하나의 볼륨 및 100 % 에탄올 두 개의 볼륨에 추가합니다. 소용돌이 -20 적어도 2 시간 동안 배양 ° C.
- 4 20 분 10,000 XG에 원심 분리기 샘플 ° C. 상층 액을 버린다. 펠릿이 불안정 할 수 있습니다로주의해야합니다.
- 70 % EtOH로 펠렛을 씻으십시오.
- RNase가없는 물 400 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 새로운 에펜 도르프 튜브에 샘플을 전송합니다.
- 3 M 나트륨 acetat 0.1 볼륨을 추가하여 다시 RNA를 침전전자의 pH 5.2와 100 %의 EtOH 두 권. 소용돌이 -20 적어도 2 시간 동안 배양 ° C.
- 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 샘플 뜨는을 취소하고 70 % EtOH로 세척한다.
- 공기는 펠렛을 건조 및 RNase가없는 물에 재현 탁. -80에서 보관 RNA 샘플 ° C. 샘플 북부 분석 19 또는 마이크로 어레이 분석 18 (프로토콜 3 참조)를 사용할 수 있습니다.
3. 마이크로 어레이 분석을위한 RNA 준비
- RNase가없는 물 650 mL를 2.2 단계에서의 mRNA를 재현 탁.
- 적극적으로 클로로포름 (5:1의 pH 4.7)와 소용돌이 : 잔여 DNA 또는 단백질을 제거하려면, 같은 산성 페놀의 양 (650 ㎖)에 추가합니다. 2 분 동안 최대 속도로 원심 분리기.
- 새로운 튜브로 위 상 (수상) 500 ㎖를 전송합니다. 그것은 DNA가 들어 있으므로, 계면을 복용하지 마십시오. 또한, 역전사 반응을 억제 할 수있는 페놀을 복용에주의. </ 리>
- RNA 샘플은 역전사 효소의 강력한 억제제이다 헤파린의 상당한 양이 포함되어 있습니다. 따라서, RT-PCR 또는 마이크로 어레이 라벨링을 위해 제거 될 필요가있다. LiCl을 침전에 의해 헤파린을 제거 2 M의 최종 농도로하여 LiCl을 추가하고 -20에서 밤새 샘플을 품어 ° C.
- 4에서 샘플을 해동 ° C와 11 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기
- 조심스럽게 뜨는을 취소하고 80 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. 단계 3.5에 설명 된대로 다시 원심 분리기.
- 상층 액, 공기 건조를 취소하고 RNase가없는 물 150 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
- 잔류하여 LiCl을 제거하려면, 3 M 아세트산 나트륨의 pH 5.3의 0.1 볼륨 및 100 % 에탄올의 전 3 권으로 다시 침전. -20 품다 최소 2 시간 동안 C를 °.
- 4에서 20 분 동안 최고 속도로 원심 분리기 ° C. 80 %의 에탄올과 건조한 공기로 조심스럽게 투명 펠렛을 씻으십시오.
- 재현 탁25 ㎖의 RNase가없는 물과 펠렛 -80에서 샘플을 유지 ° C.
- (18, 20)에 설명 된 RNA의 라벨 및 하이브리드의 단계를 따릅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 프로토콜은 세포질 구성 요소에서 미토콘드리아 함유 부분을 분리 할 수 있습니다. 성공을 테스트하는 가장 좋은 방법은 다른 분리 단계에서 샘플을 분석 북부와 서부 분석 (그림 1) 수행하는 것입니다. 격리 품질에 대한 세 가지 매개 변수는이 분석에서 파생됩니다. 첫째, 샘플에서 RNA 나 단백질은 손상 여부 - 이러한 분석에서 뚜렷한 밴드로 감지됩니다. 분해 이벤트를 추가, 짧은 밴드 또는 얼룩의 모양을 유도 할 것이다. 둘째, 입력 (즉, 전체)로부터의 신호와 각 단계에서의 신호를 비교하는 제제 중에 손실에 관한 중요한 정보를 제공한다. 심한 손실은 전체 신호의 상대적인 양 사이의 상당한 차이로 관찰 될 것이다. 마지막으로, 가장 중요한 미토콘드리아와 세포질 성분들 사이의 분리의 품질이 결정될 수있다. 그대로 mitochondri의 분리는 미토콘드리아 분획이 아닌 세포질 분획 (그림 1A)에서 미토콘드리아 전사 증명서를위한 신호가 발생합니다. 또한, 미토콘드리아 관련된 단백질은 미토콘드리아 분획에서 웨스턴 블롯 및 세포질 분획 (그림 1B)의 세포질 단백질에 의해 나타납니다.
그림 1은 이러한 프로토콜에 대한 표준 두 개의 추가 결과를 보여줍니다 : 첫 번째, 미토콘드리아 핵 인코딩의 mRNA 협회는 유전자 사이에 다릅니다. 의 mRNA가 세포질 분획 (그림 1C)에 주로있는 세포질 액틴 단백질 (ACT1)를 인코딩하는 동안 하나는 미토콘드리아 단백질을 암호화 ACO1의 mRNA는, 미토콘드리아 분획에서 주로 나타나는 것을 볼 수 있습니다. 게놈 전체 분석 많은 유전자 8,10,21,22이 다양성에 대한 기준들 계시 변화는 광범위한 연구 중입니다. ER 관련 물질의의 둘째, 상당한 양의L은 미토콘드리아 분획 coisolated됩니다. ER-관련된 mRNA를 인코딩 SEC61은 북부 오점 (그림 1A)에 의해 감지되고, ER-막 단백질 큐 1은 서양 얼룩 (그림 1B)에 의해 검출된다. 이 ER 및 미토콘드리아의 알려진 물리적 접촉의 결과 일 수있다. 미토콘드리아의 추가 정제가 가능하지만, 그것은 몇 가지 제한 사항을 소개 할 수 있습니다, 이러한 토론에서 논의된다.
그림 1. . 격리 품질의 품질 검증 절차의 대표적인 3 가지 단계에서 가져온 샘플 시험을 할 때 : 분별하기 전에 (총 [단계 1.20], T, 세포질 분획 [단계 1.22], C, 그리고 미토콘드리아 분획 [단계 1.24], M). 샘플을 노던 분석 (실시 아르. 다음의 mRNA에 대한 A, C) 또는 서부 분석 (B) A) 북부 분석 : COB 따라서 그 신호가 미토콘드리아에 독점적으로해야 미토콘드리아 내부에 전사 된 RNA이다. C 분수의 모양은 준비하는 동안 미토콘드리아 용해으로 표시됩니다. ACT1는 세포질 단백질을 코딩 mRNA를, 따라서 세포질 리보솜 번역 및 C 분획에 주로 나타난다. ACO1는 미토콘드리아로 가져 단백질을 암호화 mRNA를하고, 미토콘드리아의 일부에 주로 나타납니다. SEC61는 ER 상주 단백질을 암호화의 mRNA이며, M의 부분에있는 그것의 존재는이 부분에서 ER 구성 요소의 존재를 나타냅니다. 하단 패널은 북부 막 메틸렌 블루 염색을 선물 두 rRNAs (18S와 25S)이 검출 된 것입니다. 이 패널은 리보솜의 상당한 양이 followi의 M 분획. B) 서부 분석에 나타나는 것을 보여줍니다단백질을 겨 : Por1 따라서 그 신호 만 M 분획에서 예상되는 미토콘드리아 외막 단백질이다. C 분획 신호는 준비하는 동안 미토콘드리아 구성 요소의 분리를 제안합니다. Hxk1는 세포질 단백질과 큐 1은 ER의 단백질이다. 모두 미토콘드리아 분획 이러한 분수의 copurification에보고합니다. Rpl39 다시 두 분수의 변이의 존재를 입증, 리보솜 단백질이다. 패널의 "복구없이 Rpl39는"프로토콜이 복구 단계 (1.14 단계) CCP1하십시오. C) 북부 분석, 미토콘드리아로 가져 단백질을 암호화 mRNA를 제외 리보솜의 분별을 선물한다. 전체 젤이 짧은 분해 유래 밴드의 부족을 설명하기 위해 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이미징 기술의 발전은 mRNA의 현지화를 연구하는 높은 해상도 도구를 산출했다. 오늘날, 하나는 msec의 시간 스케일 23-26이라도 단일의 mRNA 분자의 움직임을 측정 할 수있다. 그러나, 전통적인 생화학 적 접근법은, 상술 한대로, 또한 유익한 일부 경우에 바람직하다. 생화학 격리의 mRNA 및 단백질의 큰 레퍼토리의 정화를 허용하고, 게놈 넓은 연구에 대한 것이 바람직하다. 하나의 분리, 하나는 DNA 마이크로 어레이 또는 RNA-SEQ 18,27 의해 하나, 수천 개의 유전자의 특성화를 허용하도록 충분한 mRNA 수준을 얻을 수있다. 이와 병행하여, 하나의 단백질을 분리 및 미토콘드리아 28 프로테옴을 특성화 단백질체 분석을 수행 할 수있다. 생화학 fractionations은 ER (29) 특히, 다른 세포 소기관 미토콘드리아로부터 분리하도록 구성 될 수있다. 이것은 세포의 몇 가지 유형에 유리할 수있다 높은 공간 중첩이 있었다ER 및 미토콘드리아 사이에 미세한 현지화 분석을 방해한다. 생화학 fractionations의 중요한 장점은 다양한 샘플의 분석을 허용 그들의 저비용이다. 생체 내 이미징 연구의 경우와 같이, 생화학 분별, 상술 한대로, 통상의 mRNA 힘드는 형광 태그를 필요로하지 않는 - 관련 장점은 단순성이다. 마지막으로, 많은 함정과 유물은 이미 따라서 필요한 컨트롤이 잘 확립되어, 이러한 기존의 프로토콜에 대한 진단을하고 있습니다.
제시된 프로토콜 zymolyase 처리를 다음 복구 단계 (단계 1.14)을 수반한다. zymolyase 처리시 유발되는 스트레스는 거의 즉시 번역의 체포와 mRNA가 리보솜에서 '해리 리드하기 때문에이 단계는 중요합니다. 리보솜 해리에 대한 실제 트리거 할 이러한 처리, 탄소원, 즉 제거, 박람회에서 포함하는 단계 중 어느원심 분리, 에이전트 (DTT)을 감소시키는 치료 기간 동안 높은 g에 우레는 zymolyase 또는 고 삼투압 조건의 도입에 의해 세포벽 제거, 이들 각각은 번역 체포를 유도하는 것으로 알려져있다. 이 번역 체포 아마도 미토콘드리아와 리보솜의 관계에 영향을 미칩니다. 따라서, 우리는 미토콘드리아와 mRNA의 협회가 zymolyase 치료 후 낮고, 복구하는 동안 증가 (도시하지 않음) 것으로 나타났습니다.
이 프로토콜에 의해 격리 된 미토콘드리아 분획은 여러 ER 마커의 존재에서 알 수있는 바와 같이, ER 상당한 양의 (예를 들어, 그림 1)가 포함되어 있습니다. 명백한 욕망은 더 ER 구성 요소를 제거하고 순수한 미토콘드리아를 얻기 위해, 그라디언트 29-33을 활용 몇 가지 표준 프로토콜 중 하나를 사용하고 있습니다. 그러나 이러한 프로토콜로 인해 스트레스 zymolyase의 치료 (그림 1B 하나, 미토콘드리아의 리보솜의 스트립 필요로 (즉 리보솜을 미토콘드리아로 재접속시)까지 복구 후 구배 분리를 적용하면 예를 들어, 두 ER 및 미토콘드리아 마커가 동일 분획 침전. 연관된 리보솜 그들의 밀도 (데이터는 도시하지 않음)의 차이를 불명료하기 때문에 이것은 아마이다. 따라서, 리보솜 협회의 연구에 대해, 미토콘드리아의 분리를위한 대체 방법을 개발해야합니다.
많은 연구의 경우, 그러나, ER 성분의 존재는 반드시 문제가 아니다. 잘 확립 된 미토콘드리아 단백질 (예를 인코딩의 mRNA 협회Aconitase, ATP2, Oxa1)이 원유 준비에 미토콘드리아가 아닌 ER 구성 요소가 될 가능성이 높습니다. 그것은 따라서 미토콘드리아에 미치는 영향에 대한 판독 이러한 일반적인 미토콘드리아의 mRNA 중 하나를 사용하는 것이 좋습니다. 미토콘드리아로 확인되지 않은 단백질은 기자로 사용할 수 없습니다, 잘못 할당의 mRNA가 오류를 소개 할 수 있습니다으로 게놈 전체의 mRNA의 연구가, (예를 들어, 마이크로 어레이 분석)을 수행 할 때이 특히 중요합니다.
이 프로토콜의 주요한 기술적 과제는 mRNA의 분해를 최소화한다. RNase가없는 시약을 사용하여 항상 조언하는 동안, 하나는 RNAses 엄청난 양의 용액에 푹 빠져있다 세포의 용해에 그 기억해야합니다. 헤파린은 매우 효과적인 RNA 분해 효소 억제제와 상당한 양의 추가됩니다. 큰 추출물의 볼륨을 준비 할 때, 상대적으로 저렴한 비용으로 다른 RNA 분해 효소 억제제에 비해 추가적인 이점을 제공한다. 헤파린은 그러나 또한 반대 성적을 억제ASE, 따라서 이러한 효소의 활동을 포함하는 연구에 제거해야합니다 (예 : RT-PCR 또는 DNA 마이크로 어레이 (microarray) 라벨링). 여기서 우리는 (3.4-3.10 단계)하여 LiCl의 침전에 기초 분리 절차를 제시한다. 이 침전을 효과적으로 헤파린을 제거하지만의 mRNA 분명히 상당한 양이 손실됩니다. 또한, RNA 샘플에서 헤파린을 제거하는데, 아직 우리가이 가진 제한된 성공을 거두었 각종 스핀 열이 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 Drs에 감사드립니다. Erez Eliyahu, 다니엘 멜라 메드, Ophry 소나무와이 프로토콜의 설립시 도움과 의견을 주셔서 도론 라파. 이 작품은 ISF (허가 번호 1193년에서 1109년까지)에 의해 투자된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
