Summary
Mange mRNA'er koder mitokondrielle proteiner er associeret med mitochondrier ydre membran. Vi beskriver en subcellulær fraktionering procedure med henblik på isolering af gær mitokondrier med tilhørende mRNA'er og ribosomer. Denne protokol kan anvendes på celler dyrket under forskellige betingelser for at afsløre mekanismer mRNA lokalisering og lokaliseret oversættelse nær mitokondrierne.
Abstract
De fleste af mitokondrielle proteiner er kodet i kernen og skal importeres til organel. Import kan forekomme, mens proteinet er syntetiseret nær mitokondrier. Støtte til denne mulighed er afledt fra de seneste undersøgelser, hvor mange mRNAer koder for mitokondrielle proteiner viste sig at være lokaliseret til mitokondrierne nærhed. Sammen med tidligere demonstrationer af ribosomer associering den ydre membran, tyder disse resultater på en lokaliseret oversættelsesprocessen. Sådanne lokaliseret oversættelse kan forbedre import effektivitet, giver unikke regulering sites og minimere tilfælde af ektopisk udtryk. Forskellige metoder er blevet brugt til at karakterisere de faktorer og elementer, der medierer lokaliseret oversættelse. Standard blandt disse er subcellulær fraktionering ved differential centrifugering. Denne protokol har den fordel, at isolation af mRNAs, ribosomer og proteiner i en enkelt procedure. Disse kan så være præget af forskellige molekylære og biochemical metoder. Desuden kan anvendes transcriptomics og proteomics metoder til den resulterende materiale, og derved tillade genom-dækkende indsigt. Udnyttelsen af gær som en model organisme til sådanne undersøgelser har fordele af hastighed, omkostninger og enkelhed. Desuden avancerede genetiske værktøjer og tilgængelige deletionsstammer muliggøre kontrol af kandidat faktorer.
Introduction
Eukaryote celler er organiseret i adskilte rum med specifikke funktioner. For at opnå funktion, hvert rum indeholder et unikt sæt af proteiner, der er afgørende for dets aktivitet. En mulig mekanisme, hvorigennem disse proteiner nærmer deres rum er ved lokaliseret oversættelse 1,2. I denne proces proteinet syntetiseres på bestemmelsesstedet ved ribosomer og mRNA'er, der er placeret der. Blandt de sandsynlige fordele ved lokaliseret oversættelse øges effektiviteten af målretning protein, nedsat behov for protein chaperones og aktivering stedspecifikke reguleringsmekanismer. Desuden kan lokaliserede mRNAs og ribosomer være en afsondret reservoir oversættelse maskiner i tilfælde af cellulært stress, når generel oversættelse er spærret.
Mitokondrier blev i de senere år et centralt model til at studere lokaliseret oversættelse. De fleste mitokondrier proteiner er kodet i kernen, oversat i cytosolen,og importeres til organel. Forskellige former for evidens tyder på, at mange af disse proteiner er produceret gennem en lokal oversættelse proces. I første omgang, elektronmikroskopi og biokemisk fraktionering undersøgelser påvist ribosomer associeret med mitochondrier 3-5. Disse undersøgelser, hvor så underbygges in vivo ved arbejde på specifikke mRNA'er, der blev anset for at kun indføres i en cotranslational måde 6,7. Genom-dækkende undersøgelser af mRNAer forbindelse med mitochondrier afslørede, at en betydelig del af mRNA'er lokaliseret til mitokondrierne nærhed 8-10. Nogle af disse mRNA'er blev yderligere karakteriseret ved in vivo fluorescens metoder, såsom fisk eller mTAG 9,11. En straight-forward fortolkning af denne forening er, at disse mRNA'eme tjener som skabeloner for lokaliseret oversættelse.
De mekanismer, som disse mRNAs nærmer mitokondrier er ukendte. Ikke-kodende områder (mest significantly 3 'UTR'er) blev vist at være involveret i mRNA association til mitokondrierne 12. Disse domæner er tilbøjelige til at tjene som et bindingssted til RNA-bindende proteiner, som medierer transporten. Studier i gær afslørede, at et medlem af PUM familie af proteiner (Puf3) støtter mRNA forening med mitokondrier 8,13. En plausibel rolle for Puf3, som er baseret på funktioner af andre familiemedlemmer, er at hæmme translation mens mRNA er på vej 14. Således kan mRNA'er transporteres i en ikke-translateret status af RNA-bindende proteiner, som interagerer med ikke-kodende regioner. Alternativt kan en stor mængde arbejde tyder på, at transporten sker, mens proteinet syntetiseres. Især blev translationsinhibitorer vist sig at påvirke mRNA'er forening 8,13. Desuden oversatte funktioner såsom AUG, mitokondrie-targeting sekvens (MTS), eller ORF regioner viste sig at hjælpe med lokalisering 8,11,15. Hsp70-familien protein chaperone og protein receptor på mitokondrier ydre membran blev også vist at støtte mRNA forening yderligere indebærer, at kodet-protein funktioner er vigtige for mRNA-lokalisering 16. Dette er i overensstemmelse med en model, hvor ribosomet-spirende protein fungerer som anerkendelse element for at målrette mRNA-ribosom-protein-komplekset til mitokondrierne 17.
Lokaliseret oversættelse nær mitokondrier blev undersøgt ved forskellige metoder, herunder elektronmikroskopi (for at visualisere ribosomer) 3, FISH 9, grøn RNA (til påvisning af specifikke mRNA'er) 11, og biokemisk fraktionering (til påvisning af både RNA og ribosomer) 10,18. Mens de tidligere metoder til påvisning af lokalisering in vivo og kan tillade visualisering af transport dynamik, hvor sidstnævnte muliggør påvisning af mange forskellige mRNA'er i et enkelt eksperiment. Desuden har til biokemisk fraktionering kodende eller ikke-kodende domæner behøver ikke at være alstreret, derfor deres specifikke roller kan evalueres. Biokemiske fraktionering held har været anvendt i mange år, til isolering af mange forskellige cellulære rum. Dets opdragsgivere og begrænsninger er veletablerede, og man kan nemt modificere eksisterende protokoller til forskellige formål. Den nødvendige instrumentering er standard i mange laboratorier, er det derfor sædvanligvis den første foretrukne metode til at studere intracellulær lokalisering. Vi beskriver en protokol, der er optimeret til isolering af mRNAs mens ribosomer er forbundet med mitokondrier. Denne protokol er derfor optimal til at studere faktorer involveret i lokaliserede oversættelse nær mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Mitochondria Oprensning
Pellet af celler afvejes. Omkring 0,6 g udtages fra 100 ml celler.
- Grow 100-150 ml gærceller OD600 = 1-1,5 ved 30 ° C på en fermenterbare vækstmedium, såsom galactose-dyrkningsmedium med henblik på at berige for mitokondrier.
- Centrifugér cellerne ved 3.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og supernatanten.
- Vask pelleten med dobbelt destilleret vand og centrifugeres igen. Supernatanten.
- Resuspender pellet i 1 ml DTT buffer per 0,5 g celler. Det er vigtigt at behandle cellerne med et reduktionsmiddel for at bryde disulfidbindingerne i cellevæggen, hvorved hydrolyse forbedres.
- Inkubér cellerne i 10 minutter ved 30 ° C med forsigtig rystning. I mellemtiden, vejer 6 mg zymolyase per 1 g af celler og suspendere den i Zymolyase Buffer.
- Centrifugér cellerne ved 3.000 xg i 5 min ent stuetemperatur og supernatanten.
- Pellet resuspenderes i 1 ml Zymolyase Buffer pr 0,15 g af celler. Undlad at slynge.
- Måle OD600 på 10 ul aliquot af celler i 990 pi vand.
- Tilføj Zymolyase (trin 1.5) til cellerne til at hydrolysere glucosepolymerer på β-1 ,3-glucan bindinger og generere spheroplaster. Fra dette trin, bør spheroplaster holdes i en isotonisk opløsning for at undgå lyse.
- Cellerne inkuberes i 15 minutter ved 30 ° C (for optimal aktivitet af zymolyase) med forsigtig omrystning. For at verificere hydrolyse af cellevæggen og sfæroplaster generation, bland 10 pi af cellerne med 990 ul vand. Spheroplaster forventes at lysere på grund af osmotisk forskel, og OD 600 skal mindst 10 gange mindre end den værdi, bestemt i trin 1.9. Hvis ikke, fortsætter inkubation med zymolyase for en anden 15 min.
- Centrifuger cellerne ved 3000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Dis omhyggeligtkort supernatanten, som pelleten kan være ustabil.
- Vask spheroplaster med Zymolyase Buffer og supernatanten.
- Resuspender spheroplaster med 100 ml Recovery medium. Overførsel spheroplaster til en Erlenmeyer-kolbe, og der inkuberes i 1 time ved 30 ° C under omrystning. Dette opsving trin er nødvendigt, da under Zymolyase behandling oversættelse er anholdt og mRNA lokalisering er forstyrret (Figur 1B).
- Tilføj 0,1 mg / ml CHX og overføre sfæroplaster til en forafkølet 50 ml konisk rør. CHX Derudover er det vigtigt at fryse ribosomer associering mRNA'er. Således er ribosomer afhængige mRNA forening med mitokondrier opretholdes.
- Centrifugér spheroplaster ved 3.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C og supernatanten.
- Vaskes to gange med kold Mannitol bufferen.
- Resuspender spheroplaster med 4 ml kold Mannitol Buffer og overføre dem til en Dounce homogenisator på 15 ml udstyret med stramtsiddendepistil. Forsigtigt bryde spheroplaster med 15 slag og overføre lysatet til en 13 ml rør.
- Centrifuger lysatet ved 1500 xg i 6 min ved 4 ° C for at pelletere kerner og ubrudte celler.
- Overføre forsigtigt supernatanten til et nyt rør. Braklægning 1 ml (25%) af prøven som en ufraktioneret prøve ("Total" prøve). Overfør 50 ml af denne prøve til et nyt rør, og der tilsættes 15 ml 4X LSB for Western blot-analyse. Bundfald RNA fra resten af "Total" prøve (se protokol 3, RNA udfældning).
- Centrifugeres supernatanten ved 10.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C til pelletering af mitokondrier.
- Overfør supernatanten (~ 3 ml) til et nyt rør og holde det på is. Dette er den "cytosol" fraktion. Overfør 50 ml af denne prøve til et nyt rør, og der tilsættes 15 ml 4x LSB for Western blot-analyse. Bundfald RNA fra resten af "cytosol" prøve (se Protocol 3, RNA udfældning).
- Vask pelleten med 3 ml Mannitol puffer og centrifugeres igen ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes med 3 ml Mannitol Buffer. Denne prøve indeholder mitokondrier, og benævnt "Mitokondrier" fraktion. Overfør 50 ml af denne prøve til et nyt rør, og der tilsættes 15 ml 4x LSB for Western blot-analyse.
2. RNA-ekstraktion
- Tilføj til hver prøve et volumen 8 M guanidinium-HCI og to volumener af 100% ethanol. Vortexes og inkuberes i mindst 2 timer ved -20 ° C.
- Centrifugér prøver ved 10.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten kasseres. Vær forsigtig, da pillen kan være ustabil.
- Vask pellet med 70% EtOH.
- Pelleten resuspenderes med 400 ml RNase-frit vand og overføre prøven til et nyt Eppendorf-rør.
- Præcipitere RNA'et igen ved tilsætning af 0,1 volumen 3 M natrium-acetate pH 5,2 og to volumener 100% EtOH. Vortexes og inkuberes i mindst 2 timer ved -20 ° C.
- Centrifugér prøver ved 20.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og vaskes med 70% EtOH.
- Lufttørre pellet og resuspenderes med RNase-frit vand. Store RNA-prøver ved -80 ° C. Prøverne kan bruges til det nordlige analyse 19 eller microarray analyse 18 (se protokol 3).
3. Klargøring af RNA til microarray analyse
- Resuspender mRNA fra trin 2.2 med 650 ml RNase-frit vand.
- For at fjerne enhver rest af DNA eller proteiner tilsættes tilsvarende mængde (650 ml) af sure phenol: chloroform (5:1, pH 4.7) og vortex kraftigt. Centrifugeres ved maksimal hastighed i 2 min.
- Overfør 500 ml af den øvre fase (den vandige fase) til et nyt rør. Undgå at tage mellemfasen, da det indeholder DNA. Også være forsigtig med at tage fenol, som kan hæmme revers transkription reaktion. </ Li>
- RNA-prøven indeholder en signifikant mængde heparin, der er en potent hæmmer af revers transkriptase. Således til RT-PCR eller microarray mærkning det skal fjernes. Fjern heparin LiCI nedbør: tilføje LiCl til en endelig koncentration på 2 M, og inkuber prøverne natten over ved -20 ° C.
- Optø prøverne ved 4 ° C og centrifugeres ved 20.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
- Kassere forsigtigt supernatanten og vask bundfaldet med 80% ethanol. Der centrifugeres igen som beskrevet i trin 3.5.
- Supernatanten fjernes, lufttørring og pellet resuspenderes i 150 ml RNase-frit vand.
- For at fjerne enhver rest af LiCI, udfældes igen med 0,1 volumen af 3 M natriumacetat pH 5,3 og 3 volumener 100% ethanol. Inkuber ved -20 ° C i mindst 2 timer.
- Centrifuger ved tophastighed i 20 minutter ved 4 ° C. Vask omhyggeligt den gennemsigtige pille med 80% ethanol og lufttørre.
- Resuspenderpellet med 25 ml RNase-frit vand og holde prøverne ved -80 ° C.
- Følg trinene for RNA mærkning og hybridisering beskrevet i 18,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol tillader separation af en mitokondrier fraktion fra cytosoliske bestanddele. Den bedste måde at teste dens succes er at udføre Northern analyse og western-analyse (figur 1) på prøver fra de forskellige isoleringstrin. Tre parametre for isolation kvalitet stammer fra disse analyser. Det første, om RNA eller proteiner i prøverne er intakte - disse vil blive opdaget som særskilte bånd i analyserne. Nedbrydning begivenheder vil fremkalde udseende yderligere, kortere bånd eller pletter. For det andet, sammenligne signalerne fra hvert trin med signalet fra indgangen (dvs. i alt) giver vigtig information om tab under forberedelse. Alvorlige tab vil blive observeret som en væsentlig forskel mellem den samlede og den relative mængde af signal. Endelig, og vigtigst, kan kvaliteten af adskillelsen mellem mitokondrie og cytosolisk komponenter bestemmes. Isolering af intakte mitochondrien vil resultere i signalet for mitokondrier transkriberet transkript kun fraktionen mitokondrier og ikke i den cytosoliske fraktion (figur 1A). Desuden vil proteiner, der mitokondrier-associerede vist ved Western blot kun fraktionen mitokondrier og cytosoliske proteiner i den cytosoliske fraktion (figur 1B).
Figur 1 viser yderligere to resultater, der er standard for denne protokol: først, forening af nukleare-kodet mRNA'er med mitokondrier varierer mellem gener. Man kan se, at ACO1-mRNA, som koder for et mitokondrieprotein forekommer hovedsagelig i fraktion mitokondrier, mens mRNA, der koder det cytosoliske actin protein (AKT1) er for det meste i den cytosoliske fraktion (figur 1C). Genom-dækkende analyser afslørede variation blandt mange gener 8,10,21,22 og grundlaget for denne mangfoldighed er under omfattende forskning. Andet, betydelige mængder af ER-relateret material er coisolated i mitochondriefraktionen. MRNA'et, der koder SEC61, som er ER-associeret, detekteres ved Northern blot (Figur 1A) og ER-membranprotein Cue1 påvises ved western blot (figur 1B). Dette kan være et resultat af de kendte fysiske kontakt mellem ER og mitokondrier. Mens yderligere rensning af mitokondrier er muligt, kan det indføre nogle begrænsninger, disse er diskuteret i diskussionen.
Figur 1. . Verifikation Kvaliteten af isolation Kvalitet testes for prøver udtaget i tre repræsentative trin i proceduren: Før fraktionering (Total [trin 1.20] T; cytosol fraktion [trin 1.22], C, og mitochondriefraktionen [trin 1.24], M). Prøverne udsættes for det nordlige analyse (. A, C) eller western-analyse (B) A) Northern analyse af følgende mRNA'er: COB er et RNA, som transkriberes inde i mitokondrierne derfor signalet, udelukkende er i mitokondrierne. Dens udseende i C-fraktionen vil indikere mitokondrier lysis under forberedelse. AKT1 er et mRNA, som koder for et cytosolisk protein og derfor oversat af cytosoliske ribosomer og forekommer hovedsagelig ved C-fraktionen. ACO1 er et mRNA, som koder for et protein, der er importeret til mitokondrierne, og synes hovedsagelig på brøkdel mitokondrier. SEC61 er et mRNA, der koder for ER bosat protein; sin tilstedeværelse i M-fraktionen indikerer tilstedeværelsen af ER-komponenter i denne fraktion. Det nederste panel viser en methylenblåt-farvning af den nordlige membran er der to rRNA'er (18S og 25S) opdages. Dette panel viser, at en betydelig mængde af ribosomer vises i M-fraktionen. B) Western-analyse for following proteiner: Por1 er en mitokondrier ydre membran-protein forventes derfor signalet kun i M-fraktionen. Signal i C-fraktionen vil foreslå dissociation af mitokondrie komponenter under forberedelse. Hxk1 er en cytosolisk protein og Cue1 er en ER-protein. Begge rapport om copurification af disse fraktioner med fraktionen mitokondrier. Rpl39 er ribosomalt protein, igen at påvise forekomst af ribosomer i begge fraktioner. Panelet "Rpl39 uden nyttiggørelse", præsenterer fraktionering af ribosomer, når protokollen er udelukket af opsvinget trin (trin 1.14). C) Northern analyse for CCP1, et mRNA, der koder for et protein, der er importeret til mitokondrierne. Hele gel præsenteres demonstrere manglen på kortere, nedbrydnings-stammer bands. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknologiske fremskridt i billedbehandling havde givet høj opløsning værktøjer til at studere mRNA lokalisering. I dag kan man måle bevægelsen af selv en enkelt mRNA-molekyle på den msek tidsskala 23-26. Men traditionelle biokemiske metoder, som er beskrevet ovenfor, er også informativ og er at foretrække i nogle tilfælde. Biokemisk isolering tillader oprensning af et stort repertoire af mRNA'er og proteiner, og er derfor at foretrække for genom-dækkende studier. I et enkelt isoleret, kan man opnå tilstrækkelige mRNA-niveauer for at tillade karakterisering af tusinder af gener, enten ved DNA microarrays eller RNA-seq 18,27. Parallelt hermed kan man isolere proteiner og udføre en proteomisk analyse for at karakterisere proteom på mitokondrier 28.. Biokemiske fraktioneringer kan være indrettet til at separere mitokondrier fra andre cellulære organeller, især ER 29. Dette kan være fordelagtigt i visse typer af celler var høj rumlig overlapningmellem ER og mitokondrier hindrer mikroskopiske lokalisering analyser. En vigtig fordel ved biokemiske fraktioneringer er deres lave omkostninger, som tillader analyse af mange forskellige prøver. En beslægtet fordel er deres enkelhed - biokemisk fraktionering, som beskrevet ovenfor, normalt ikke kræver besværlige fluorescerende mærkning af mRNA'er, som det er tilfældet in vivo billeddannelse undersøgelser. Endelig er mange faldgruber og artefakter allerede diagnosticeret for disse traditionelle protokoller, derfor den nødvendige kontrol veletableret.
Den præsenterede protokol indebærer et opsving trin (trin 1.14), der følger zymolyase behandling. Dette trin er kritisk, fordi stress induceret under zymolyase behandling fører til næsten øjeblikkelig translationel anholdelse og ribosomer 'afstandtagen fra mRNA'er. Den egentlige udløser for ribosomer dissociation kan nogen af de skridt, der indgår i denne behandling, nemlig fjernelse af kulstof kilde, udstillingerure til høj g under centrifugering, behandling med reduktionsmidler (DTT), celle-væg fjernelse af zymolyase eller indførelse af høje osmotiske betingelser er hver af disse er kendt for at fremkalde en translationel anholdelse. Denne translationel anholdelse sandsynligvis påvirker sammenslutning af ribosomer med mitokondrier. Derfor fandt vi, at mRNA forbindelse med mitokondrier er lav efter zymolyase behandling og stiger i løbet nyttiggørelse (ikke vist).
Mitochondriefraktionen der isoleres ved denne protokol indeholder en betydelig mængde af ER, som det fremgår af tilstedeværelsen af forskellige ER markører (fx figur 1). En oplagt ønske er at fjerne yderligere ER komponenter og for at opnå ren mitokondrier, ved hjælp af en af flere standardprotokoller, der udnytter gradienter 29-33. Men disse protokoller kræver fjernelse af ribosomer i mitokondrierne, enten på grund af stressende zymolyase behandling (figur 1B (dvs. når ribosomer reassociere med mitokondrier), både ER og mitokondrier markører sedimenteret til samme fraktion. Det er sandsynligvis fordi de tilknyttede ribosomer tilsløre forskellene i deres tætheder (data ikke vist). Således ribosomet forening undersøgelser, vil alternative metoder til mitokondrier isolation skal udvikles.
For mange undersøgelser har imidlertid tilstedeværelsen af ER-komponenter er ikke nødvendigvis problematisk. Sammenslutningen af mRNA'er, der koder for veletablerede mitokondrielle proteiner (fxAconitase, ATP2, Oxa1) er tilbøjelige til at være med mitokondrier og ikke ER komponent i dette rå præparat. Det anbefales derfor at bruge en af disse typiske mitokondrie mRNAer som udlæsninger for indvirkning på mitokondrier. Proteiner, der ikke er verificeret som mitokondrie bør ikke anvendes som reportere, hvilket er vigtigt især når genom-dækkende mRNA undersøgelser udføres (f.eks microarray analyse), som mis-tildelte mRNAs kan indføre en fejl.
Den største tekniske udfordring i denne protokol er at minimere mRNA nedbrydning. Mens du bruger RNase fri reagenser er altid rådes, bør man huske, at ved lysis af celler enorme mængder af RNAser bliver sluppet løs i løsningen. Heparin er en meget effektiv RNAse hæmmer og tilsættes i betydelige mængder. Når store ekstrakt mængder er forberedt, dens relativt lave omkostninger giver ekstra fordel i forhold til andre RNAse inhibitorer. Heparin dog hæmmer også omvendt udskriftase, og derfor bør fjernes til undersøgelser, der involverer en sådan enzymatisk aktivitet (fx RT-PCR eller DNA microarray mærkning). Heri præsenterer vi en fjernelse procedure, der er baseret på LiCl nedbør (trin 3,4-3,10). Denne udfældning effektivt fjerner heparin, men tilsyneladende også betydelige mængder af mRNA'er tabt. Alternativt er der forskellige spin-kolonner, som formodes at fjerne heparin fra RNA-prøver, men vi har haft en begrænset succes med disse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines og Doron Rapaport om hjælp og kommentarer under etableringen af denne protokol. Dette arbejde er finansieret af ISF (tilskud nr. 1193-1109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
