Summary
Mitochondrial प्रोटीन एन्कोडिंग कई mRNAs mitochondria बाहरी झिल्ली के साथ जुड़े रहे हैं. हम उसके संबंधित mRNAs और राइबोसोम के साथ खमीर माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के उद्देश्य से एक subcellular fractionation प्रक्रिया का वर्णन. इस प्रोटोकॉल mRNA स्थानीयकरण का तंत्र और mitochondria निकट स्थानीयकृत अनुवाद प्रकट करने के क्रम में विविध परिस्थितियों में विकसित कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
Mitochondrial प्रोटीन की अधिकांश नाभिक में इनकोडिंग और organelle में आयात करने की आवश्यकता है. प्रोटीन mitochondria के पास संश्लेषित है जबकि आयात हो सकता है. इस संभावना के लिए समर्थन mitochondrial प्रोटीन एन्कोडिंग कई mRNAs mitochondria आसपास के क्षेत्र के लिए स्थानीय होना दिखाया गया है, जिसमें हाल ही के अध्ययन से प्राप्त होती है. साथ में बाहरी झिल्ली के साथ राइबोसोम एसोसिएशन के पूर्व प्रदर्शनों के साथ, इन परिणामों को एक स्थानीय अनुवाद प्रक्रिया का सुझाव. इस तरह स्थानीयकृत अनुवाद, आयात दक्षता में सुधार अनूठा विनियमन साइटों प्रदान और अस्थानिक अभिव्यक्ति के मामलों को कम कर सकते हैं. विविध तरीकों स्थानीयकृत अनुवाद कि मध्यस्थता और कारक तत्व चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इनमें मानक अंतर centrifugation द्वारा subcellular fractionation है. इस प्रोटोकॉल एक ही प्रक्रिया में mRNAs, राइबोसोम और प्रोटीन के अलगाव का लाभ दिया है. ये तो विभिन्न आणविक और द्वि द्वारा होती जा सकता हैochemical तरीकों. इसके अलावा, transcriptomics और प्रोटिओमिक्स तरीकों जिससे जीनोम चौड़ा अंतर्दृष्टि की अनुमति है, जिसके परिणामस्वरूप सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है. इस तरह के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में जीव खमीर का उपयोग गति, लागत और सादगी के फायदे हैं. इसके अलावा, उन्नत आनुवंशिक उपकरण और उपलब्ध विलोपन उपभेदों उम्मीदवार कारकों के सत्यापन की सुविधा.
Introduction
कोशिकाओं विशिष्ट कार्य होने के अलग डिब्बों में आयोजित कर रहे हैं. अपने कार्य को पूरा करने के लिए, प्रत्येक डिब्बे अपनी गतिविधि के लिए आवश्यक हैं कि प्रोटीन का एक अनूठा सेट होता है. इन प्रोटीनों उनके डिब्बे दृष्टिकोण के माध्यम से जो एक संभव तंत्र स्थानीयकृत अनुवाद 1,2 से है. इस प्रक्रिया में, प्रोटीन राइबोसोम और वहाँ स्थित हैं कि mRNAs द्वारा अपने गंतव्य पर संश्लेषित है. स्थानीयकृत अनुवाद के संभावित फायदे लक्ष्य प्रोटीन की दक्षता बढ़ रहे हैं के अलावा, प्रोटीन संरक्षिकाओं के लिए की जरूरत कम है, और साइट विशेष नियमन तंत्र को सक्षम करने. इसके अलावा, स्थानीय mRNAs और राइबोसोम जनरल अनुवाद हिचकते है जब सेलुलर तनाव के मामलों में अनुवाद मशीनरी के एक सुनसान जलाशय किया जा सकता है.
Mitochondria हाल के वर्षों में स्थानीय अनुवाद अध्ययन करने के लिए एक केंद्रीय मॉडल बन गई. अधिकांश mitochondria प्रोटीन, cytosol में अनुवादित नाभिक में इनकोडऔर organelle में आयात किया. सबूत के विभिन्न लाइनों इन प्रोटीनों की कई एक स्थानीय अनुवाद प्रक्रिया के माध्यम से उत्पादन किया जाता है कि संकेत मिलता है. प्रारंभ में, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और जैव रासायनिक fractionation पढ़ाई mitochondria 3-5 से जुड़े राइबोसोम का पता चला. तब केवल एक cotranslational ढंग 6,7 में आयातित किया जाना पाया गया है कि विशिष्ट mRNAs, पर काम से vivo में पुष्टि की है, जहां ये अध्ययन. Mitochondria साथ mRNAs एसोसिएशन के जीनोम चौड़ा पढ़ाई mRNAs का एक महत्वपूर्ण अंश mitochondria आसपास के क्षेत्र में 8-10 के लिए स्थानीय कर रहे हैं कि पता चला. इन mRNAs से कुछ आगे ऐसी मछली या mTAG 9,11 के रूप में vivo प्रतिदीप्ति तरीकों, द्वारा विशेषता थे. इस संघ के एक सीधे आगे व्याख्या इन mRNAs स्थानीयकृत अनुवाद के लिए टेम्पलेट्स के रूप में काम करता है.
इन mRNAs mitochondria दृष्टिकोण तंत्र है जिसके द्वारा अज्ञात हैं. Noncoding डोमेन (सबसे significantlY 3 'UTRs) mitochondria से 12 mRNA संघ में शामिल होना दिखाया गया. इन डोमेन उनके परिवहन मध्यस्थता जो शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन के लिए एक बाध्यकारी साइट के रूप में काम करने की संभावना है. खमीर में अध्ययन प्रोटीन की पम परिवार (Puf3) के एक सदस्य mitochondria 8,13 साथ mRNA एसोसिएशन का समर्थन करता है कि पता चला. परिवार के अन्य सदस्यों के कार्यों पर आधारित है जो Puf3, के लिए एक प्रशंसनीय भूमिका, mRNA मार्ग 14 एन है जबकि अनुवाद बाधित है. इस प्रकार, mRNAs noncoding क्षेत्रों के साथ बातचीत कि शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन से, एक nontranslated स्थिति में ले जाया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, काम का एक बड़ा शरीर प्रोटीन संश्लेषित किया जा रहा है, जबकि परिवहन होता है कि पता चलता है. विशेष रूप से, अनुवाद inhibitors mRNAs एसोसिएशन 8,13 को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया. इसके अलावा, इस तरह के अगस्त के रूप में अनुवाद सुविधाओं, mitochondrial लक्ष्यीकरण अनुक्रम (एमटीएस) या ओआरएफ क्षेत्रों स्थानीयकरण 8,11,15 में सहायता करने के लिए दिखाया गया. Hsp70 परिवार प्रोटीन चर्चाmitochondria बाहरी झिल्ली पर aperone और प्रोटीन रिसेप्टर भी आगे इनकोडिंग प्रोटीन सुविधाओं mRNA स्थानीयकरण 16 के लिए महत्वपूर्ण हैं जिसका अर्थ है कि mRNA संघ का समर्थन करने के लिए दिखाया गया. इस राइबोसोम उभरते प्रोटीन mitochondria से 17 mRNA-राइबोसोम प्रोटीन परिसर को निशाना बनाने के लिए मान्यता तत्व के रूप में कार्य करता है, जिसमें एक मॉडल के साथ संगत है.
Mitochondria के पास स्थानीयकृत अनुवाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (राइबोसोम कल्पना करने के लिए) 3, मछली 9, (विशिष्ट mRNAs का पता लगाने के लिए) ग्रीन आरएनए 11, और जैव रासायनिक fractionation (आरएनए और राइबोसोम दोनों का पता लगाने में) 10,18 सहित विभिन्न तरीकों से अध्ययन किया गया. पूर्व तरीकों vivo में स्थानीयकरण का पता लगाने और गतिशीलता परिवहन के दृश्य की अनुमति सकता है, बाद एक ही प्रयोग में कई अलग अलग mRNAs का पता लगाने की अनुमति देता है. इसके अलावा, जैव रासायनिक fractionation कोडिंग या noncoding डोमेन के लिए अल होने की जरूरत नहीं हैचार्टर्ड, इसलिए उनकी विशिष्ट भूमिका का मूल्यांकन किया जा सकता है. बायोकेमिकल fractionation सफलतापूर्वक कई अलग अलग सेलुलर डिब्बों के अलगाव के लिए, कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है. उसके प्रधानाचार्यों और सीमाएं अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, और एक को आसानी से विभिन्न उद्देश्य के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल को संशोधित कर सकते हैं. आवश्यक इंस्ट्रूमेंटेशन इसलिए यह आम तौर पर intracellular स्थानीयकरण के अध्ययन के लिए पसंद की पहली विधि है, कई प्रयोगशालाओं में मानक है. हम राइबोसोम mitochondria के साथ जुड़े रहे हैं, जबकि mRNAs का अलगाव के लिए अनुकूलित किया गया था कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल इसलिए mitochondria निकट स्थानीयकृत अनुवाद में शामिल कारकों के अध्ययन के लिए इष्टतम है.
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Protocol
1. Mitochondria शोधन
कोशिकाओं की गोली वजन. मोटे तौर पर 0.6 ग्राम 100 मिलीग्राम कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं.
- 30 पर 600 = 1-1.5 आयुध डिपो खमीर कोशिकाओं की 100-150 मिलीलीटर बढ़ो Mitochondria के लिए समृद्ध करने के क्रम में, इस तरह के गैलेक्टोज आधारित मध्यम विकास के रूप में एक nonfermentable मध्यम विकास, सी °.
- अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3000 XG पर और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- फिर दोहरा आसुत जल और अपकेंद्रित्र के साथ गोली धो लें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- कोशिकाओं की 0.5 ग्राम प्रति 1 मिलीलीटर डीटीटी बफर में गोली Resuspend. यह इस प्रकार हाइड्रोलिसिस में सुधार, सेल की दीवार के भीतर डाइसल्फ़ाइड बांड तोड़ने के क्रम में एक एजेंट को कम करने के साथ कोशिकाओं के इलाज के लिए महत्वपूर्ण है.
- 30 पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते कोमल झटकों के साथ सी °. इस बीच, कोशिकाओं की 1 ग्राम प्रति 6 मिलीग्राम zymolyase वजन और Zymolyase बफर में यह रोक देते हैं.
- 5 मिनट में एक के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओंटी कमरे के तापमान और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- कोशिकाओं की 0.15 ग्राम प्रति 1 मिलीलीटर Zymolyase बफर में गोली Resuspend. नहीं भंवर करो.
- पानी के 990 μl में कोशिकाओं के 10 μl विभाज्य के आयुध डिपो 600 उपाय.
- Β-1 ,3-glucan संबंधों में ग्लूकोज पॉलिमर hydrolyze और स्फेरोप्लास्ट उत्पन्न करने के लिए कोशिकाओं को Zymolyase (1.5 कदम) जोड़ें. इस कदम से, स्फेरोप्लास्ट सेल से बचने के क्रम में एक isotonic समाधान में रखा जाना चाहिए.
- कोमल झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस (zymolyase का इष्टतम गतिविधि के लिए) पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. सेल की दीवार और स्फेरोप्लास्ट पीढ़ी की hydrolysis सत्यापित करने के लिए, पानी के 990 μl के साथ कोशिकाओं के 10 μl मिश्रण. स्फेरोप्लास्ट कारण आसमाटिक अंतर को lyse की उम्मीद कर रहे हैं, और 600 आयुध डिपो में कम से कम कदम 1.9 में निर्धारित मूल्य से कम 10 गुना होना चाहिए. यदि नहीं, एक और 15 मिनट के लिए zymolyase साथ ऊष्मायन जारी है.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 3000 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं. ध्यान से जिलेकार्ड पर तैरनेवाला, गोली के रूप में अस्थिर हो सकता है.
- Zymolyase बफर साथ स्फेरोप्लास्ट धोएं और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- 100 मिलीलीटर रिकवरी मध्यम साथ स्फेरोप्लास्ट Resuspend. एक Erlenmeyer कुप्पी स्फेरोप्लास्ट स्थानांतरण और 30 पर 1 घंटे के लिए सेते झटकों के साथ सी °. Zymolyase उपचार अनुवाद के दौरान गिरफ्तार कर लिया है और mRNA स्थानीयकरण (चित्रा 1 बी) बाधित है के बाद से यह वसूली कदम आवश्यक है.
- एक precooled 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 0.1 मिलीग्राम / एमएल CHX और हस्तांतरण स्फेरोप्लास्ट जोड़ें. CHX अलावा mRNAs साथ राइबोसोम एसोसिएशन फ्रीज करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, mitochondria साथ राइबोसोम पर निर्भर mRNA एसोसिएशन बनाए रखा है.
- अपकेंद्रित्र स्फेरोप्लास्ट 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3000 XG पर और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- ठंड Mannitol बफर के साथ दो बार धोएं.
- 4 एमएल ठंड Mannitol बफर साथ स्फेरोप्लास्ट Resuspend और टाइट फिटिंग के साथ सुसज्जित 15 मिलीलीटर क्षमता का एक Dounce homogenizer के लिए उन्हें स्थानांतरितमूसल. धीरे 15 स्ट्रोक के साथ स्फेरोप्लास्ट तोड़ने के लिए और एक 13 मिलीलीटर ट्यूब lysate हस्तांतरण.
- नाभिक और अटूट गोली कोशिकाओं के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए 1500 XG पर lysate अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. एक unfractionated नमूना ("कुल" नमूना) के रूप में अलग नमूने के 1 मिलीलीटर (25%) सेट करें. एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण इस नमूने के 50 एमएल और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 4X LSB की 15 मिलीलीटर जोड़ें. "कुल" नमूना के बाकी हिस्सों से वेग आरएनए (प्रोटोकॉल 3, शाही सेना तेज़ी देखें).
- 4 में 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र Mitochondria गोली सी °.
- एक नया ट्यूब पर तैरनेवाला (~ 3 मिलीलीटर) हस्तांतरण और बर्फ पर रहते हैं. यह "साइटोसोलिक" अंश है. एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण इस नमूने के 50 एमएल और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 4x LSB की 15 मिलीलीटर जोड़ें. "साइटोसोलिक" नमूना के बाकी हिस्सों से वेग आरएनए (Prot देखेंocol 3, शाही सेना तेज़ी).
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 XG पर फिर से 3 मिलीग्राम Mannitol बफर और अपकेंद्रित्र के साथ गोली धोने
- 3 मिलीलीटर Mannitol बफर के साथ गोली Resuspend. यह नमूना mitochondria होता है, और "Mitochondria" अंश के रूप में भेजा. एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण इस नमूने के 50 एमएल और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 4x LSB की 15 मिलीलीटर जोड़ें.
2. शाही सेना निष्कर्षण
- प्रत्येक नमूना 8 एम guanidinium-एचसीएल की एक मात्रा और 100% इथेनॉल के दो संस्करणों में जोड़ें. भंवर और -20 पर कम से कम 2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- 4 में 20 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला त्यागें. गोली अस्थिर हो सकता है के रूप में सावधान रहें.
- 70% EtOH के साथ गोली धोने.
- RNase मुक्त पानी के 400 मिलीलीटर के साथ गोली Resuspend और एक नया Eppendorf ट्यूब नमूना हस्तांतरण.
- 3 एम सोडियम Acetat का 0.1 मात्रा जोड़कर फिर से शाही सेना वेगई पीएच 5.2 और 100% EtOH के दो संस्करणों. भंवर और -20 पर कम से कम 2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 70% EtOH से धो लें.
- एयर गोली सूखी और RNase मुक्त पानी के साथ resuspend. -80 पर स्टोर शाही सेना के नमूने डिग्री सेल्सियस नमूने उत्तरी विश्लेषण 19 या माइक्रोएरे विश्लेषण 18 (प्रोटोकॉल 3 देखें) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए शाही सेना की तैयारी
- RNase मुक्त पानी के 650 मिलीलीटर के साथ 2.2 कदम से mRNA Resuspend.
- सख्ती क्लोरोफॉर्म (5:1, पीएच 4.7) और भंवर: किसी भी अवशिष्ट डीएनए या प्रोटीन निकालने के लिए, बराबर अम्लीय फिनोल की मात्रा (650 मिलीलीटर) जोड़ें. 2 मिनट के लिए अधिकतम गति पर अपकेंद्रित्र.
- एक नया ट्यूब ऊपरी चरण (जलीय चरण) के 500 मिलीलीटर स्थानांतरण. यह डीएनए होता है, अंतरावस्था लेने से बचें. इसके अलावा रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया को बाधित कर सकते हैं जो फिनोल, लेने के लिए सावधान रहना. </ ली>
- शाही सेना नमूना रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला है जो हेपरिन की एक महत्वपूर्ण राशि शामिल है. इस प्रकार, RT-पीसीआर या माइक्रोएरे लेबलिंग के लिए इसे हटा दिया जाना चाहिए. LiCl तेज़ी से हेपरिन निकालें: 2 एम की एक अंतिम एकाग्रता के लिए LiCl जोड़ने और -20 पर रात में नमूने सेते डिग्री सेल्सियस
- 4 में नमूने पिघलना डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 80% इथेनॉल के साथ गोली धोने. 3.5 चरण में वर्णित के रूप में फिर से अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला, शुष्क हवा त्यागें और RNase मुक्त पानी की 150 मिलीलीटर में गोली resuspend.
- किसी भी अवशिष्ट LiCl निकालने के लिए, 3 एम सोडियम एसीटेट पीएच 5.3 से 0.1 मात्रा और 100% इथेनॉल के 3 खंडों के साथ फिर से वेग. -20 पर सेते कम से कम 2 घंटे के लिए सी °.
- 4 में 20 मिनट के लिए ऊपर की गति पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस 80% इथेनॉल और शुष्क हवा के साथ सावधानी से पारदर्शी गोली धो लें.
- Resuspend25 मिलीलीटर RNase मुक्त पानी के साथ गोली और -80 पर नमूने रखना डिग्री सेल्सियस
- 18,20 में वर्णित शाही सेना लेबलिंग और संकरण के लिए चरणों का पालन करें.
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Representative Results
इस प्रोटोकॉल साइटोसोलिक घटकों से एक mitochondria युक्त अंश की जुदाई की अनुमति देता है. अपनी सफलता का परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा तरीका अलग अलगाव कदम से नमूने के उत्तरी विश्लेषण और पश्चिमी विश्लेषण (चित्रा 1) प्रदर्शन करने के लिए है. अलगाव की गुणवत्ता के लिए तीन मानकों इन विश्लेषण से निकाली गई है. सबसे पहले, नमूने में शाही सेना या प्रोटीन बरकरार हैं - चाहे इन विश्लेषण में अलग बैंड के रूप में पता लगाया जाएगा. गिरावट घटनाओं अतिरिक्त, छोटे बैंड या स्मीयरों की उपस्थिति के लिए प्रेरित करेंगे. दूसरा, इनपुट (यानी कुल) से संकेत के साथ हर कदम से संकेत की तुलना तैयारी के दौरान नुकसान के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है. गंभीर नुकसान कुल और संकेत के रिश्तेदार राशि के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर के रूप में मनाया जाएगा. अन्त में, और सबसे महत्वपूर्ण, mitochondrial और साइटोसोलिक घटकों के बीच अलगाव की गुणवत्ता निर्धारित किया जा सकता है. बरकरार mitochondri का अलगावएक ही mitochondria अंश में और नहीं साइटोसोलिक अंश (चित्रा 1 ए) में mitochondrially-लिखित प्रतिलिपि के लिए संकेत का परिणाम देगा. इसके अलावा, mitochondria जुड़े रहे हैं कि प्रोटीन केवल mitochondria अंश पर पश्चिमी धब्बा, और साइटोसोलिक अंश (चित्रा 1 बी) में साइटोसोलिक प्रोटीन से दिखाई देगा.
चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल के लिए मानक हैं कि दो अतिरिक्त परिणामों को दर्शाता है: पहला, mitochondria के साथ परमाणु इनकोडिंग mRNAs का संघ जीन के बीच होती है. MRNA साइटोसोलिक अंश (चित्रा 1C) में ज्यादातर है साइटोसोलिक एक्टिन प्रोटीन (ACT1) एन्कोडिंग जबकि एक, एक mitochondrial प्रोटीन encodes जो ACO1 mRNA, mitochondria अंश में ज्यादातर प्रतीत होता है कि देख सकते हैं. जीनोम चौड़ा विश्लेषण कई जीनों 8,10,21,22 और इस विविधता के लिए आधार के बीच में पता चला भिन्नता व्यापक शोध के दायरे में है. ईआर से संबंधित मटेरिया का दूसरा, काफी मात्रा मेंएल mitochondrial अंश में coisolated रहे हैं. ईआर जुड़ा हुआ है mRNA एन्कोडिंग SEC61, उत्तरी दाग (चित्रा 1 ए) द्वारा पता लगाया है और ईआर झिल्ली प्रोटीन Cue1 वेस्टर्न ब्लॉट (चित्रा 1 बी) द्वारा पता लगाया है. इस ईआर और mitochondria के बीच में जाना जाता शारीरिक संपर्क का नतीजा हो सकता है. माइटोकॉन्ड्रिया के आगे शुद्धि संभव है, यह कुछ सीमाएँ लागू कर सकते हैं, ये चर्चा में चर्चा कर रहे हैं.
चित्रा 1. . अलगाव गुणवत्ता की गुणवत्ता सत्यापन प्रक्रिया के तीन प्रतिनिधि चरणों में लिए गए नमूनों के लिए परीक्षण किया गया है: विभाजन से पहले (कुल [कदम 1.20], टी, साइटोसोलिक अंश [कदम 1.22], सी, और mitochondrial अंश [कदम 1.24], एम). नमूने उत्तरी विश्लेषण (के अधीन हैं. निम्नलिखित mRNAs के लिए ए, सी) या पश्चिमी विश्लेषण (बी) ए) उत्तरी विश्लेषण: ढेला इसलिए इसके संकेत mitochondria में विशेष रूप से होना चाहिए mitochondria अंदर लिखित है कि एक शाही सेना है. सी अंश में अपनी उपस्थिति की तैयारी के दौरान mitochondria सेल का संकेत होगा. ACT1 एक साइटोसोलिक प्रोटीन encodes कि एक mRNA है, और इसलिए साइटोसोलिक राइबोसोम द्वारा अनुवादित और सी अंश पर ज्यादातर प्रकट होता है. ACO1 mitochondria में आयात किया जाता है कि एक प्रोटीन encodes कि एक mRNA है, और mitochondria अंश पर ज्यादातर प्रकट होता है. SEC61 ईआर निवासी प्रोटीन encodes कि एक mRNA है; एम अंश में अपनी उपस्थिति इस अंश में ईआर घटकों की उपस्थिति का संकेत है. नीचे पैनल, उत्तरी झिल्ली का एक methylene नीले धुंधला प्रस्तुत करता है दो rRNAs (18S और 25S) पता चला रहे हैं जो है. इस पैनल राइबोसोम की महत्वपूर्ण राशि followi के लिए एम अंश. बी) पश्चिमी विश्लेषण में दिखाई देते हैं दर्शाताप्रोटीन एनजी: Por1 इसलिए इसके संकेत केवल एम अंश में उम्मीद है एक mitochondria बाहरी झिल्ली प्रोटीन है. सी अंश में संकेत तैयारी के दौरान mitochondrial घटकों की हदबंदी का सुझाव देगा. Hxk1 एक साइटोसोलिक प्रोटीन होता है और Cue1 एक ईआर प्रोटीन होता है. दोनों mitochondria अंश के साथ इन अंशों की copurification पर रिपोर्ट. Rpl39 फिर दोनों भागों में राइबोसोम की उपस्थिति का प्रदर्शन, एक ribosomal प्रोटीन है. पैनल "वसूली के बिना Rpl39", प्रोटोकॉल वसूली कदम (1.14 कदम) CCP1 के लिए. सी) उत्तरी विश्लेषण, mitochondria में आयात किया जाता है कि एक प्रोटीन encodes कि एक mRNA के बाहर रखा गया है जब राइबोसोम की fractionation प्रस्तुत करता है. पूरी जेल में कम, गिरावट उत्पत्ति बैंड की कमी को प्रदर्शित करने के लिए प्रस्तुत किया है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इमेजिंग में तकनीकी प्रगति mRNA स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए उच्च संकल्प उपकरण झुकेंगे था. आज, एक मिसे समय के पैमाने 23-26 में एक भी mRNA अणु का आंदोलन उपाय कर सकते हैं. फिर भी, परंपरागत जैव रासायनिक दृष्टिकोण, ऊपर वर्णित के रूप में, यह भी जानकारीपूर्ण हैं और कुछ मामलों में बेहतर कर रहे हैं. बायोकेमिकल अलगाव mRNAs और प्रोटीन के एक बड़े प्रदर्शनों की सूची के शुद्धिकरण की अनुमति देता है, और जीनोम चौड़ा अध्ययन के लिए इसलिए बेहतर है. एक भी अलगाव में, एक डीएनए या आरएनए seq 18,27 द्वारा, या तो जीनों के हजारों के लक्षण वर्णन अनुमति देने के लिए पर्याप्त mRNA स्तर प्राप्त कर सकते हैं. समानांतर में, एक प्रोटीन को अलग और mitochondria 28 proteome चिह्नित करने के लिए एक प्रोटिओमिक विश्लेषण प्रदर्शन कर सकते हैं. बायोकेमिकल fractionations ईआर 29 विशेष रूप से, अन्य सेलुलर organelles से mitochondria अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. यह कोशिकाओं के कुछ प्रकार में फायदेमंद हो सकता है उच्च स्थानिक ओवरलैप थेईआर और mitochondria के बीच सूक्ष्म स्थानीयकरण का विश्लेषण करती है नुकसान पहुँचा है. जैव रासायनिक fractionations का एक महत्वपूर्ण लाभ कई विभिन्न नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देता है जो उनके कम लागत, है. में vivo इमेजिंग अध्ययन में मामला है, जैव रासायनिक fractionation, ऊपर वर्णित के रूप में, आमतौर पर mRNAs का श्रमसाध्य फ्लोरोसेंट टैगिंग की आवश्यकता नहीं है - एक संबंधित लाभ उनकी सादगी है. अंत में, कई बाधाएं और कलाकृतियों पहले से ही इसलिए आवश्यक नियंत्रण अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं, इन पारंपरिक प्रोटोकॉल के लिए निदान कर रहे हैं.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल zymolyase उपचार इस प्रकार है कि एक वसूली कदम (कदम 1.14) पर जोर देता. Zymolyase उपचार के दौरान प्रेरित तनाव लगभग तत्काल translational गिरफ्तारी और mRNAs से राइबोसोम 'हदबंदी की ओर जाता है, क्योंकि यह कदम महत्वपूर्ण है. राइबोसोम हदबंदी के लिए वास्तविक गति प्रदान कर सकते इस उपचार, कार्बन स्रोत के अर्थात् हटाने, expos में शामिल है कि कोई भी चरणcentrifugation, एजेंट (डीटीटी) को कम करने के साथ इलाज के दौरान उच्च छ ure, zymolyase या उच्च आसमाटिक शर्तों के लागू होने से सेल दीवार हटाने, इनमें से प्रत्येक एक translational गिरफ्तारी के लिए प्रेरित करने के लिए जाना जाता है. इस translational गिरफ्तारी शायद mitochondria साथ राइबोसोम की एसोसिएशन को प्रभावित करता है. तदनुसार, हम mitochondria साथ mRNA एसोसिएशन zymolyase उपचार के बाद कम है, और वसूली के दौरान बढ़ जाती है (नहीं दिखाया गया है) में पाया गया कि.
इस प्रोटोकॉल से अलग है कि mitochondrial अंश विभिन्न ईआर मार्कर की उपस्थिति से स्पष्ट रूप में ईआर का एक महत्वपूर्ण राशि (जैसे चित्रा 1) शामिल हैं. एक स्पष्ट इच्छा आगे ईआर घटकों को दूर करने के लिए और शुद्ध mitochondria प्राप्त करने के लिए, ढ़ाल 29-33 उपयोग कि कई मानक प्रोटोकॉल में से एक का उपयोग कर रहा है. हालांकि, इन प्रोटोकॉल की वजह से तनावपूर्ण zymolyase उपचार के लिए (चित्रा 1 बी या तो, माइटोकॉन्ड्रिया के राइबोसोम की अलग करना जरूरत (यानी राइबोसोम mitochondria साथ reassociate जब) से वसूली के बाद ढाल जुदाई लागू करते हैं, उदाहरण के लिए, दोनों ईआर और mitochondria मार्कर एक ही अंश को sedimented. जुड़े राइबोसोम उनके घनत्व (नहीं दिखाया डेटा) में मतभेद अस्पष्ट है क्योंकि यह शायद है. इस प्रकार, राइबोसोम संघ अध्ययन के लिए, mitochondria अलगाव के लिए वैकल्पिक तरीके विकसित करने की आवश्यकता होगी.
कई अध्ययनों के लिए, हालांकि, ईआर घटकों की उपस्थिति जरूरी नहीं समस्याग्रस्त है. अच्छी तरह से स्थापित mitochondrial प्रोटीन (जैसे सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि mRNAs की एसोसिएशनAconitase, ATP2, Oxa1) इस कच्चे तेल की तैयारी में mitochondria और नहीं ईआर घटक के साथ होने की संभावना है. इसलिए यह mitochondria पर प्रभाव के लिए readouts के रूप में इन विशिष्ट mitochondrial mRNAs से एक का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. Mitochondrial के रूप में सत्यापित नहीं किया गया है कि प्रोटीन संवाददाताओं के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, गलत सौंपा mRNAs एक त्रुटि परिचय हो सकता है के रूप में जीनोम चौड़ा mRNA पढ़ाई, (जैसे माइक्रोएरे विश्लेषण) प्रदर्शन कर रहे हैं जब यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
इस प्रोटोकॉल का प्रमुख तकनीकी चुनौती mRNA कम से कम गिरावट है. RNase मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग हमेशा की सलाह दी है, वहीं एक RNases की भारी मात्रा में समाधान में जीत रहे हैं कोशिकाओं के सेल पर याद रखना चाहिए कि. हेपरिन एक बहुत प्रभावी RNAse अवरोध करनेवाला है और काफी मात्रा में जोड़ा जाता है. बड़े निकालने मात्रा में तैयार कर रहे हैं, इसकी अपेक्षाकृत कम लागत अन्य RNAse inhibitors की तुलना में अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है. हेपरिन हालांकि, यह भी रिवर्स प्रतिलिपि रोकताएएसई, और इसलिए इस तरह के enzymatic गतिविधि शामिल है कि अध्ययन के लिए हटा दिया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए RT-पीसीआर या डीएनए माइक्रोएरे लेबलिंग). इस के साथ साथ हम (3.4-3.10 कदम) LiCl वर्षा पर आधारित है जो किसी को हटाने की प्रक्रिया मौजूद है. इस वर्षा को प्रभावी ढंग से हेपरिन हटा, लेकिन mRNAs का जाहिरा तौर पर भी काफी मात्रा में खो जाते हैं. वैकल्पिक रूप से, शाही सेना के नमूने से हेपरिन को दूर करने के लिए माना जाता है, फिर भी हम इन के साथ एक सीमित सफलता मिली हैं जो विभिन्न स्पिन स्तंभ हैं.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.
Acknowledgments
हम डीआरएस धन्यवाद. Erez एलियाहू, डैनियल Melamed, Ophry पाइंस और इस प्रोटोकॉल की स्थापना के दौरान मदद और टिप्पणियों के लिए Doron रेपापोर्ट. इस काम ISF (अनुदान संख्या 1193-1109) द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
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