Summary
Mange av mRNA som koder for mitokondrielle proteiner er forbundet med mitokondrier ytre membran. Vi beskriver en subcellulære fraksjone fremgangsmåte rettet mot isolering av gjær mitokondrier med tilhørende mRNAer og ribosomer. Denne protokollen kan brukes på celler dyrket under ulike forhold for å avdekke mekanismene for mRNA lokalisering og lokaliserte oversettelse nær mitokondriene.
Abstract
De fleste av mitokondrielle proteiner er kodet i kjernen, og må importeres inn i organeller. Import kan forekomme når proteinet blir syntetisert i nærheten av mitochondria. Støtte for denne muligheten er avledet fra nylige studier hvor mange mRNAer som koder mitokondrie protein ble vist til å være lokalisert til mitokondriene nærhet. Sammen med tidligere demonstrasjoner av ribosomer Organisasjon med den ytre membran, disse resultatene tyder på en lokalisert oversettelsesprosessen. Slike lokalisert oversettelse kan forbedre import effektivitet, gir unike regulerings områder og redusere tilfeller av ektopisk uttrykk. Diverse metoder har blitt brukt for å karakterisere hvilke faktorer og elementer som formidler lokaliserte oversettelse. Standard blant disse er subcellulære fraksjonering av differensial sentrifugering. Denne protokollen har fordelen av isolering av mRNA, ribosomer og proteiner i en enkelt prosedyre. Disse kan da være preget av ulike molekylære og bikjemiske metoder. Videre kan transcriptomics og proteomikk metoder anvendes på det resulterende materiale, og dermed tillate genom innsikt. Utnyttelsen av gjær som modellorganisme for slike studier har fordelene av hastighet, kostnader og enkelhet. Videre er de avanserte genetiske verktøy og tilgjengelige delesjonsstammer lette verifisering av kandidat faktorer.
Introduction
Eukaryote celler er organisert i forskjellige avdelinger som har spesifikke funksjoner. For å oppnå dens funksjon, inneholder hvert kammer et unikt sett av proteiner som er nødvendig for dens aktivitet. En mulig mekanisme som disse proteinene nærmer seg deres kammer er ved lokal oversettelse 1,2. I denne prosessen, blir proteinet syntetisert på bestemmelsesstedet ved ribosomer og mRNA som er lokalisert der. Blant de sannsynlige fordelene med lokaliserte oversettelse er økt effektivitet av protein målretting, redusert behov for protein anstand, og muliggjør stedsspesifikke reguleringsmekanismer. Også, kan lokaliserte mRNA og ribosomer være en bortgjemt reservoar av oversettelses maskiner i tilfeller av mobilnettet stress, når generell oversettelse hemmes.
Mitokondrier ble i de senere år en sentral modell for å studere lokaliserte oversettelse. De fleste mitokondrier proteiner er kodet i kjernen, oversatt i cytosol,og importert inn i organeller. Forskjellige linjer av bevis indikerer at mange av disse proteinene er produsert gjennom en lokal oversettelsesprosessen. I utgangspunktet elektronmikroskopi og biokjemiske fraksjone studier oppdaget ribosomer assosiert med mitokondrier 3-5. Disse studiene der da bekreftet in vivo ved arbeid på spesifikke mRNA, som ble funnet å være importeres bare i en cotranslational måte 6,7. Genom studier av mRNA assosiasjon med mitokondrier viste at en betydelig andel av mRNA er lokalisert til mitokondriene nærhet 8-10. Noen av disse mRNA ble videre karakterisert ved in vivo fluorescens-metoder, slik som fisk-eller mTAG 9,11. En rett-frem tolkning av denne foreningen er at disse mRNA tjene som maler for lokaliserte oversettelse.
De mekanismer som disse mRNA nærmer mitokondriene er ukjent. Noncoding domener (mest significantly 3 'UTRs) ble vist å være involvert i mRNA tilknytning til mitokondriene 12. Disse domenene er sannsynlig å tjene som et bindingssete for RNA-bindende proteiner som medierer deres transport. Studier i gjær avslørt at et medlem av PUM familie av proteiner (Puf3) støtter mRNA forening med mitokondrier 8,13. En plausibel rolle for Puf3, som er basert på funksjoner av andre familiemedlemmer, er å inhibere oversettelses mens mRNA er en rute 14.. Dermed kan mRNA transporteres i en nontranslated status, etter RNA bindende proteiner som samhandler med noncoding regioner. Alternativt en stor mengde arbeid antyder at transport skjer mens proteinet blir syntetisert. Spesielt ble oversettings hemmere vist å påvirke mRNA foreningen 8,13. Videre oversatte funksjoner som den aug, mitokondrie målretting sekvens (MTS) eller ORF regioner ble vist for å bistå i lokalisering 8,11,15. Hsp70-familien protein chaperone og protein reseptor på mitokondriene ytre membran ble også vist seg å støtte mRNA forening, videre antyde at kodet-protein funksjoner er viktig for mRNA lokalisering 16. Dette er konsistent med en modell der ribosom-dukker protein fungerer som anerkjennelse element for målretting mRNA-ribosom-protein kompleks til mitokondriene 17.
Lokalisert oversettelses nær mitokondrier ble studert ved forskjellige metoder, inkludert elektronmikroskopi (for å visualisere ribosomer) 3, FISH 9, grønn RNA (for å påvise spesifikke mRNA) 11, og biokjemiske fraksjonering (for å detektere både RNA og ribosomer) 10,18. Mens de tidligere metoder detektere lokalisering in vivo, og kan tillate visualisering av transport dynamikk, at sistnevnte deteksjon av mange forskjellige mRNA i et enkelt eksperiment. Videre, for biokjemisk fraksjone koding eller noncoding domener trenger ikke å være alangitt, derfor deres spesifikke roller kan evalueres. Biochemical fraksjone har blitt brukt i mange år, for isolering av mange forskjellige cellene. Sine oppdragsgivere og begrensninger er godt etablert, og man kan enkelt endre eksisterende protokoller for ulike formål. Den nødvendige instrumentering er standard i mange laboratorier, derfor er det vanligvis den første metoden for valg for å studere intracellulær lokalisering. Vi beskriver en protokoll som var optimalisert for isolering av mRNA, mens ribosomer er forbundet med mitokondrier. Denne protokollen er derfor optimal for å studere faktorer involvert i lokaliserte oversettelse nær mitokondrier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Mitokondrier Rensing
Vei opp pelleten av celler. Omtrent 0.6 g ble oppnådd fra 100 ml-celler.
- Grow 100-150 ml av gjærceller til OD 600 = 1-1,5 på 30 ° C på en nonfermentable vekstmedium, så som galaktose basert vekstmedium, for å berike til mitokondriene.
- Sentrifuger cellene ved 3000 xg i 5 min ved romtemperatur og kast supernatant.
- Vask pelleten med dobbelt destillert vann og sentrifugering på nytt. Kast supernatanten.
- Resuspender pellet i 1 ml DTT-buffer per 0,5 g av cellene. Det er viktig å behandle cellene med et reduksjonsmiddel for å bryte disulfidbindingene i celleveggen, og dermed bedre hydrolyse.
- Inkuber cellene i 10 minutter ved 30 ° C med forsiktig risting. I mellomtiden veie 6 mg Zymolyase per 1 g av cellene og suspendere den i Zymolyase buffer.
- Sentrifuger cellene ved 3000 xg i 5 min ent romtemperatur og kast supernatanten.
- Resuspender pellet i 1 ml Zymolyase buffer per 0,15 g celler. Ikke vortex.
- Måle OD 600 av 10 pl alikvot av cellene i 990 pl vann.
- Legg Zymolyase (trinn 1.5) til cellene for å hydrolysere polymerer av glukose ved β-1 ,3-glukan-bindinger og gi sfæroplaster. Fra dette trinn, bør sfæroplaster holdes i en isotonisk oppløsning for å unngå lyse.
- Inkuber cellene i 15 minutter ved 30 ° C (for optimal aktivitet av Zymolyase) med forsiktig risting. For å kontrollere hydrolyse av celleveggen og sfæroplaster generasjon, bland 10 ul av cellene med 990 ul vann. Sfæroplaster er forventet å lysere på grunn av osmotisk forskjell, og OD 600 bør være minst 10 ganger mindre enn den verdi som er bestemt i trinn 1.9. Hvis ikke, fortsetter inkubering med Zymolyase i ytterligere 15 min.
- Sentrifuger cellene ved 3000 xg i 5 min ved romtemperatur. Dis nøyekortet supernatanten, som pelleten kan være ustabil.
- Vask sfæroplaster med Zymolyase Buffer og kast supernatanten.
- Susp sfæroplaster med 100 ml Recovery medium. Overfør sfæroplaster til en Erlenmeyer-kolbe og inkuberes i 1 time ved 30 ° C med risting. Dette utvinning trinnet er nødvendig siden under Zymolyase behandling oversettelsen er arrestert og mRNA lokalisering blir forstyrret (Figur 1B).
- Til 0,1 mg / ml CHX og overføre sfæroplaster til en foravkjølt 50 ml konisk rør. CHX tillegg er viktig å fryse ribosomer Organisasjon med mRNA. Således er ribosomer-avhengige mRNA assosiasjon med mitokondrier opprettholdes.
- Sentrifuger sfæroplaster på 3000 xg i 5 min ved 4 ° C og kast supernatanten.
- Vask to ganger med kaldt Mannitol Buffer.
- Susp sfæroplaster med 4 ml kaldt Mannitol Buffer og overføre dem til en Douce-homogenisator av 15 ml kapasitet utstyrt med tettsittendestampe. Forsiktig bryte sfæroplaster med 15 slag og overføre lysat til et 13 ml rør.
- Sentrifuger lysatet ved 1500 xg i 6 min ved 4 ° C for å pelletere cellekjerner og ubrutte celler.
- Overfør supernatanten forsiktig til et nytt rør. Sett av 1 ml (25%) av prøven som et ikke-fraksjonerte prøve ("Total" prøve). Overføring 50 ml av denne prøve til et nytt rør og tilsett 15 ml 4X LSB for western blot analyse. Precipitate RNA fra resten av "Total" sample (Se protokoll 3, RNA nedbør).
- Sentrifuger supernatanten ved 10 000 xg i 10 min ved 4 ° C for å pelletere mitokondriene.
- Overfør supernatanten (~ 3 ml) i et nytt rør, og holde det på is. Dette er den "cytosoliske" fraksjon. Overføring 50 ml av denne prøve til et nytt rør og tilsett 15 ml 4x LSB for western blot analyse. Bunnfall RNA fra resten av "cytosoliske" prøve (Se Protocol 3, RNA nedbør).
- Vask pelleten med 3 ml Mannitol buffer og sentrifuger på nytt ved 10 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Resuspender pelleten med 3 ml Mannitol buffer. Denne prøven inneholder mitokondrier, og referert til som "Mitokondrier" fraksjon. Overføring 50 ml av denne prøve til et nytt rør og tilsett 15 ml 4x LSB for western blot analyse.
2. RNA Utvinning
- Legg til hver prøve en volum på 8 M guanidinium-HCl og to volumer av 100% etanol. Vortex og inkuberes i minst 2 timer ved -20 ° C.
- Sentrifuger prøvene på 10 000 xg i 20 min ved 4 ° C. Kast supernatant. Vær forsiktig så den pellet kan være ustabil.
- Vask pelleten med 70% EtOH.
- Resuspender pelleten med 400 ml RNase-fritt vann og å overføre prøven til et nytt Eppendorf-rør.
- Utfelle RNA på nytt ved å tilsette 0,1 volum av 3 M natrium-acetate pH 5,2, og to volumer av 100% EtOH. Vortex og inkuberes i minst 2 timer ved -20 ° C.
- Sentrifuger prøvene ved 20 000 xg i 20 min ved 4 ° C. Kast supernatanten og vask med 70% EtOH.
- Lufttørker pellet og resuspender med RNase-fritt vann. Butikk RNA prøver på -80 ° C. Prøver kan bli brukt for northern-analyse 19 eller mikromatriseanalyse 18 (Se protokoll 3).
Tre. Klargjøring av RNA for microarray analyse
- Resuspender mRNA fra trinn 2.2 med 650 ml RNase-fritt vann.
- For å fjerne eventuelle rester av DNA eller proteiner, legge tilsvarende volum (650 ml) av syrlig fenol: kloroform (05:01, pH 4,7) og virvle kraftig. Sentrifuger ved maksimal hastighet i 2 min.
- Overfør 500 ml av den øvre fase (vandig fase) i et nytt rør. Unngå å ta den interfase, da den inneholder DNA. Også være forsiktig med å ta fenol, som kan hemme revers transkripsjon reaksjon. </ Li>
- Den RNA prøven inneholder en betydelig mengde av heparin, som er en potent inhibitor for revers transkriptase. Således, for RT-PCR-eller mikromatrise merking det må fjernes. Fjern heparin av LiCl ventet: legg LiCl til en endelig konsentrasjon på 2 M, og prøvene inkuberes over natten ved -20 ° C.
- Tine prøvene på 4 ° C og sentrifuger ved 20 000 xg i 20 min ved 4 ° C.
- Forkaste forsiktig supernatanten og vask pelleten med 80% etanol. Sentrifuger på nytt som beskrevet i trinn 3.5.
- Kast supernatanten, lufttørkes og resuspender pelleten i 150 ml RNase-fritt vann.
- For å fjerne eventuelle rester av LiCl, utfelles igjen med 0,1 volum av 3 M natriumacetat pH 5,3 og 3 volumer av 100% etanol. Inkuber ved -20 ° C i minst 2 timer.
- Sentrifuger i full fart for 20 min ved 4 ° C. Vask nøye gjennomsiktig pellet med 80% etanol og lufttørke.
- Resuspenderpellet med 25 ml RNase-fritt vann og holde prøvene ved -80 ° C.
- Følg fremgangsmåten for RNA merking og hybridisering beskrevet i 18,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen tillater separasjon av en mitokondrier-holdige fraksjon fra cytosoliske komponenter. Den beste måten å teste dens suksess er å utføre nord analyse og western-analyse (figur 1) til prøver fra de forskjellige isoleringstrinn. Tre parametere for isolasjonskvaliteten er utledet fra disse analysene. Først om-RNA eller proteiner i prøvene er intakte - disse vil bli gjenkjent som distinkte bånd i analysene. Nedbrytnings hendelser vil medføre at man får flere, kortere bånd eller flekker. For det andre, å sammenligne signaler fra hver takt med signalet fra den inngang (dvs. totalt) gir viktig informasjon angående tap i blandingen. Store tap vil bli observert som en signifikant forskjell mellom den totale og relative mengder signal. Endelig, og mest viktig, kan kvaliteten av separasjon mellom mitokondriell og cytosoliske komponenter bestemmes. Isolering av intakte mitochondriet vil resultere i signal for mitochondrially-transkribert transkripsjon bare i mitokondriene fraksjonen og ikke i den cytosoliske fraksjon (figur 1A). Videre vil proteiner som mitokondrier-assosierte vist ved Western blot bare på mitokondrier fraksjonen, og cytosoliske proteiner i den cytosoliske fraksjonen (figur 1B).
Figur 1 viser ytterligere to utfall som er standard for denne protokollen: første, sammenslutning av atom kodet mRNA med mitokondrier varierer mellom gener. Man kan se at ACO1 mRNA, som koder for et mitokondrie protein, synes stort sett i mitokondriene fraksjon, mens den mRNA som koder for det cytosoliske aktin protein (ACT1) er for det meste i den cytosoliske fraksjonen (figur 1C). Genome-wide analyser viste variasjon mellom mange gener 8,10,21,22 og grunnlaget for dette mangfoldet er under omfattende forskning. Second, betydelige mengder ER-relaterte Material er coisolated i mitokondrie brøkdel. MRNA som koder for SEC61, som er ER-forbundet, blir detektert ved Northern blot (Fig. 1A) og ER-membranprotein Cue1 detekteres ved Western blot (Fig. 1B). Dette kan være et resultat av de kjente fysiske kontakter mellom ER og mitokondrier. Mens ytterligere rensing av mitokondrier er mulig, kan det å innføre noen begrensninger, og disse er omtalt i diskusjonen.
Figur 1. . Kvalitet verifisering av isolasjon kvalitet blir testet for prøver tatt i tre representative trinn i fremgangsmåten: Før fraksjonering (Total [trinn 1,20], T; cytosoliske fraksjon [trinn 1,22], C, and mitochondrial fraksjon [trinn 1,24], M). Prøvene ble underkastet Northern-analyse (. A, C) og western-analyse (B) A) Northern-analyse etter følgende mRNA: COB er en RNA som er transkribert inn i mitokondriene og derfor er signalet skal være utelukkende i mitochondria. Sin opptreden i C brøkdel vil indikere av mitokondrier lyse under forberedelse. ACT1 er et mRNA som koder for et cytosolisk protein, og derfor oversettes ved ribosomene cytosoliske og synes for det meste ved C-fraksjon. ACO1 er et mRNA som koder for et protein som er importert til mitokondriene, og synes det meste på mitokondriene brøkdel. SEC61 er et mRNA som koder ER hørende protein, og dens tilstedeværelse i M fraksjon indikerer tilstedeværelse av ER-komponenter i denne fraksjonen. Bunnpanelet presenterer en metylenblå farging av den nordlige membran, er som to rRNAs (18S og 25S) registreres. Dette panelet viser at betydelig mengde ribosomer vises i M brøkdel. B) Western analyse for following proteiner: Por1 er et mitokondrier ytre membranprotein og derfor er signalet er ventet bare i M-fraksjon. Signal i C brøkdel vil foreslå dissosiasjon av mitokondrielle komponentene under forberedelse. Hxk1 er en cytosolprotein og Cue1 er en ER protein. Begge rapporterer om copurification av disse fraksjonene med mitokondriene brøkdel. Rpl39 er et ribosomalt protein, som igjen viser tilstedeværelse av ribosomer på begge fraksjoner. Panelet "Rpl39 uten recovery", presenterer fraksjonering av ribosomer når protokollen er ekskludert av oppgangen trinn (trinn 1.14). C) Nord-analyse for CCP1, en mRNA som koder for et protein som er importert til mitokondriene. Hele gel er presentert for å demonstrere mangel på kortere, degraderings-stammer band. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknologiske fremskritt i bilde hadde gitt høy oppløsning verktøy for å studere mRNA lokalisering. I dag kan man måle bevegelse av en eneste mRNA molekyl i msek tidsskala 23-26. Likevel, tradisjonelle biokjemiske metoder, som den som er beskrevet ovenfor, er også rikt og er å foretrekke i noen tilfeller. Biochemical isolasjon tillater rensing av et stort repertoar av mRNA og proteiner, og er derfor å foretrekke for genom-wide-studier. I en enkel isolasjon, kan man oppnå tilstrekkelig mRNA-nivåer for å tillate karakterisering av tusener av gener, enten ved DNA mikromatriser eller RNA-seq 18,27. Parallelt, kan man isolere proteiner og utføre en proteomikk analyser for å karakter proteomet på mitokondriene 28. Biokjemiske fractionations kan tilpasses for å separere mitokondrier fra andre cellulære organeller, spesielt ER 29.. Dette kan være fordelaktig i visse typer celler var høy romlig overlappingmellom ER og mitokondrier hindrer mikroskopisk lokalisering analyser. En viktig fordel med biokjemiske fractionations er deres lave kostnad, som tillater analyse av mange forskjellige prøver. En beslektet fordel er deres enkelhet - biokjemiske fraksjonering, som beskrevet ovenfor, vanligvis ikke krever møysommelige fluorescerende merking av mRNA, som tilfellet er i in vivo bildediagnostikk. Til slutt, er mange fallgruver og gjenstander som allerede er diagnostisert for disse tradisjonelle protokoller, derfor de nødvendige kontrollene er godt etablert.
Den fremlagte protokoll innebærer en gjenvinningstrinn (trinn 1.14) som følger Zymolyase behandling. Dette trinnet er viktig, fordi stress indusert under Zymolyase behandling fører til nesten umiddelbar translasjonsforskning arrest og ribosomer 'dissosiasjon fra mRNA. Selve avtrekkeren for ribosomer dissosiasjon kan en hvilken som helst av de trinn som inngår i denne behandlingen, nemlig fjerning av karbonkilden, exposure til høy g under sentrifugering, behandling med reduksjonsmidler (DTT), celle-vegg-fjerning ved Zymolyase eller innføring av høye osmotiske forhold, er hver av disse er kjent for å indusere en translasjons-arrest. Dette translasjonell arrestasjonen påvirker trolig foreningen av ribosomer med mitokondrier. Følgelig har vi funnet at mRNA forening med mitokondrier er lav etter Zymolyase behandling, og øker under utvinning (ikke vist).
Den mitokondrielle fraksjon som isoleres ved denne protokollen inneholder en betydelig mengde av ER som fremgår av nærvær av forskjellige ER markører (for eksempel figur 1). En åpenbar ønske er å fjerne ytterligere ER komponenter og for å få ren mitokondriene, ved hjelp av en av flere standardprotokoller som utnytter gradienter 29-33. Men disse protokollene nødvendig stripping av ribosomer på mitokondrier, enten på grunn av stress Zymolyase behandling (figur 1B (dvs. når ribosomer opprette tilknytningen med mitochondria), både ER og mitokondrier markører sedimenteres til den samme fraksjon. Dette er sannsynligvis fordi de tilknyttede ribosomer tilsløre forskjellene i deres tettheter (data ikke vist). Dermed for ribosom assosiasjonsstudier, vil alternative metoder for mitokondriene isolasjon må utvikles.
For mange studier, er imidlertid tilstedeværelsen av ER komponentene nødvendigvis ikke problematisk. Sammenslutning av mRNA som koder veletablerte mitokondrielle proteiner (f.eksAconitase, er ATP2, Oxa1) sannsynligvis være med mitokondrier og ikke ER komponent i denne primitive forberedelse. Det anbefales derfor å bruke en av disse typiske mitokondrielle mRNA som lettleselig for innvirkning på mitokondriene. Proteiner som ikke har blitt verifisert som mitokondrie bør ikke brukes som pressen, og dette er viktig særlig når det på genom mRNA studier er utført (for eksempel mikromatriseanalyse), så mis-tildelte mRNA kan innføre en feil.
Den store tekniske utfordringen med denne protokollen er å minimalisere mRNA degradering. Mens du bruker RNase-frie reagenser er alltid anbefalt, bør man huske på at ved lysis av celler enorme mengder RNases blir sluppet løs i løsningen. Heparin er en meget effektiv RNAse inhibitor og tilsettes i betydelige mengder. Når store ekstraktvolum blir fremstilt, gir den relativt lave kostnader ytterligere fordel sammenlignet med andre RNase inhibitorer. Heparin hemmer imidlertid også omvendt transkripsjonase, og derfor bør fjernes for studier som involverer slike enzymatisk aktivitet (f.eks RT-PCR eller DNA microarray merking). Heri presenterer vi en fjerning prosedyre som er basert på LiCl nedbør (trinn 03.04 til 03.10). Dette nedbør effektivt fjerner heparin, men tydeligvis også betydelige mengder av mRNA er tapt. Alternativt finnes det ulike spin-kolonner som er ment å fjerne heparin fra RNA prøver, men vi hadde en begrenset suksess med disse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker legene. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines og Doron Rapaport for hjelp og kommentarer under etableringen av denne protokollen. Dette arbeidet er finansiert av ISF (stipend nummer 1193-1109).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M Tris-HCl, pH 9.4 | |||
| 30 mM Tris-HCl, pH 7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2 μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/g | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/ml Heparin | |||
| 1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8 M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate, pH 5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-Mercaptoethanol | |||
| Bromophenol blue | |||
| 4x LSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle |
References
- Holt, C. E., Bullock, S. L. Subcellular mRNA localization in animal cells and why it matters. Science. 326, 1212-1216 (2009).
- Donnelly, C. J., Fainzilber, M., Twiss, J. L. Subcellular communication through RNA transport and localized protein synthesis. Traffic. 11, 1498-1505 (2010).
- Kellems, R. E., Allison, V. F., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. II. Evidence for the association of cytoplasmic ribosomes with the outer mitochondrial membrane in situ. J. Biol. Chem. 249, 3297-3303 (1974).
- Kellems, R. E., Butow, R. A. Cytoplasmic type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. 3. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J. Biol. Chem. 249, 3304-3310 (1974).
- Suissa, M., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Translatable mRNAs for imported mitochondrial proteins are present in free as well as mitochondria-bound cytoplasmic polysomes. J. Biol. Chem. 257, 13048-13055 (1982).
- Fujiki, M., Verner, K. Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J. Biol. Chem. 268, 1914-1920 (1993).
- Yogev, O., Karniely, S., Pines, O. Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J. Biol. Chem. 282, 29222-29229 (2007).
- Eliyahu, E., et al. Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol. Cell. Biol. 30, 284-294 (2010).
- Garcia, M., et al. Mitochondria-associated yeast mRNAs and the biogenesis of molecular complexes. Mol. Cell. Biol. 18, 362-368 (2007).
- Marc, P., et al. Genome-wide analysis of mRNAs targeted to yeast mitochondria. EMBO Rep. 3, 159-164 (2002).
- Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA. 17, 1551-1565 (2011).
- Margeot, A., et al. In Saccharomyces cerevisiae, ATP2 mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is essential for respiratory function. J EMBO. 21, 6893-6904 (2002).
- Saint-Georges, Y., et al. Yeast mitochondrial biogenesis: a role for the PUF RNA-binding protein Puf3p in mRNA localization. PloS one. 3, (2008).
- Quenault, T., Lithgow, T., Traven, A. PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol. 21, 104-112 (2011).
- Garcia, M., Delaveau, T., Goussard, S., Jacq, C. Mitochondrial presequence and open reading frame mediate asymmetric localization of messenger RNA. EMBO Rep. 11, 285-291 (2010).
- Eliyahu, E., Lesnik, C., Arava, Y. The protein chaperone Ssa1 affects mRNA localization to the mitochondria. FEBS Lett. 586, 64-69 (2012).
- Ahmed, A. U., Fisher, P. R. Import of nuclear-encoded mitochondrial proteins: a cotranslational perspective. Int. Rev. Cell Biol. 273, 49-68 (2009).
- Eliyahu, E., Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of RNA extracted from isolated mitochondria. Methods Mol. Biol. 714, 287-299 (2011).
- Eldad, N., Yosefzon, Y., Arava, Y. Identification and characterization of extensive intra-molecular associations between 3'-UTRs and their ORFs. Nucleic Acids RES. 36, 6728-6738 (2008).
- Melamed, D., Arava, Y. Genome-wide analysis of mRNA polysomal profiles with spotted DNA microarrays. Methods Enzymol. 431, 177-201 (2007).
- Margeot, A., et al. Why are many mRNAs translated to the vicinity of mitochondria: a role in protein complex assembly. Gene. 354, 64-71 (2005).
- Mathieu, L., Marsy, S., Saint-Georges, Y., Jacq, C., Dujardin, G. A transcriptome screen in yeast identifies a novel assembly factor for the mitochondrial complex III. Mitochondrion. 11, 391-396 (2011).
- Hocine, S., Raymond, P., Zenklusen, D., Chao, J. A., Singer, R. H. Single-molecule analysis of gene expression using two-color RNA labeling in live yeast. Nat. Methods. 10, 119-121 (2013).
- Park, H. Y., Buxbaum, A. R., Singer, R. H. Single mRNA tracking in live cells. Methods Enzymol. 472, 387-406 (2010).
- Thompson, M. A., Casolari, J. M., Badieirostami, M., Brown, P. O., Moerner, W. E. Three-dimensional tracking of single mRNA particles in Saccharomyces cerevisiae using a double-helix point spread function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17864-17871 (2010).
- Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat. Methods. 6, 331-338 (2009).
- Garcia, M., Darzacq, X., Devaux, F., Singer, R. H., Jacq, C. Yeast mitochondrial transcriptomics. Methods Mol. Biol. 372, 505-528 (2007).
- Reinders, J., Sickmann, A. Proteomics of yeast mitochondria. Methods Mol. Biol. 372, 543-557 (2007).
- Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Anal. Biochem. 287, 339-342 (2000).
- Glick, B. S., Pon, L. A. Isolation of highly purified mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 260, 213-223 (1995).
- Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 80, 45-64 (2007).
- Rieder, S. E., Emr, S. D., et al. Isolation of subcellular fractions from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Current protocols in cell biology / editorial board. Bonifacino, J. S. 8, (2001).
- Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Cell Biol. 65, 37-51 (2001).
