Summary
De voortdurend groeiende muis snijtand is een model voor het bestuderen van de vernieuwing van tandweefsel van tandheelkundige epitheliale stamcellen (DESCs). Een robuust systeem voor consistente en betrouwbare wijze verkrijgen van deze cellen van de snijtanden en de uitbreiding van deze in vitro wordt hier gemeld.
Abstract
Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die tand regeneratie en vernieuwing ten grondslag liggen is uitgegroeid tot een onderwerp van groot belang 1-4, en de muis snijtand biedt een model voor deze processen. Deze opmerkelijke orgaan groeit continu gedurende het hele leven van het dier en genereert alle benodigde celtypen uit actieve pools van volwassen stamcellen gehuisvest in de labiale (in de richting van de lip) en linguale (in de richting van de tong) cervicale lus (CL) regio's. Alleen de dentale stamcellen van de labiale CL leiden tot ameloblasts dat glazuur, de buitenste laag van de tanden, op de labiale oppervlak genereren. Deze asymmetrische emaille formatie kan schuren tegen de snijtanden uiteinde en progenitors en stamcellen in het proximale snijtand zodat het tandweefsel voortdurend aangevuld. Het vermogen om te isoleren en te groeien deze voorlopercellen of stamcellen in vitro kan de expansie en opent deuren talrijke experimenten niet haalbaar in vivo, zoals hoge throughput testen van potentiële stamcellen regulerende factoren. Hier hebben we beschrijven en demonstreren een betrouwbare en consistente methode om de cultuur cellen van de labiale CL van de muis snijtand.
Introduction
Een van de unieke kenmerken van vertebraten is de evolutie van tanden. De tand is uitgegroeid tot een belangrijk modelsysteem voor veel gebieden van onderzoek, en de moleculaire mechanismen morfologische specialisaties om dit orgel relevant zijn onderzocht vanuit verschillende perspectieven, onder meer door de ontwikkeling en evolutiebiologen 5. Meer recent, het gebied van regeneratieve geneeskunde is begonnen om waardevolle inzichten te krijgen met behulp van de tand als model. Met name de ontdekking van tandheelkundige epitheliale stamcellen een belangrijke vooruitgang 6-13 geweest.
Alle knaagdieren hebben continu groeiende snijtanden waarvan de groei wordt gevoed door stamcellen, waardoor deze tanden een toegankelijk modelsysteem om volwassen stamcellen regelgeving te bestuderen. Labeling experimenten 1970 10,11, gevolgd door genetische lineage tracing 8,9,12,14 experimenten hebben aangetoond dat DESCs in het proximale gebied van de snijtand bevinden. De steelcel nageslacht in de epitheliale compartiment aan de labiale zijde verhuizing uit de vermeende niche, bekend als de labiale cervicale lus (CL), en bijdragen aan een populatie van cellen genoemd-transit versterken (TA) cellen (figuur 1). Concreet DESCs wonen in de buitenste glazuur epitheel (OEE) en gestraalde reticulum (SR) 8,9,14, en de binnenste emaille epitheel (IEE) geeft aanleiding tot de TA-cellen die vooruitgang door middel van een beperkt aantal celcycli en dan bewegen distaal langs de lengte van de snijtand (figuur 1). De onderscheidende ameloblasts in de muis snijtand verder distaal bewegen langs de snijtanden op een opmerkelijke snelheid van ongeveer 350 um in een enkele dag 15,16. Als ze bewegen, de cellen differentiëren tot rijpe ameloblasts en stratum intermedium (SI) cellen. Na het afzetten van de volledige dikte van glazuurmatrixeiwitten, veel ameloblasts apoptose en de resterende cellen kleiner worden en reguleren emaille rijping <sup> 17. De lijn van de andere celtypes in het labiale CL, zoals SR, minder duidelijk, en gegevens over de stamcellen in het mesenchym 18 en de linguale CL alleen beginnen te ontstaan.
Met de muis snijtand model, een aantal groepen hebben gewerkt om de genetische wegen en celbiologische processen die betrokken zijn in de natuurlijke basis van stamcellen orgel vernieuwing toe te lichten. De labiale CL een relatief klein aantal cellen geschat op ongeveer 5.000 per muis snijtand, waardoor het werken met primaire cellen uitdagend. Daarom zijn pogingen gedaan om de cultuur en vergroten deze cellen in vitro 6,16,19,20 om nieuwe deuren experimentele benaderingen die niet haalbaar in vivo. De meest recente studie heeft aangetoond dat deze cellen kunnen zowel zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in amelogenin expressie cellen indien gekweekt 13. Hier beschrijven we en een werkwijze voor e tonene betrouwbare en consistente cultuur van cellen van de muis labiale CL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dissect Lower Hemi-kaken van volwassen muis
- Voorafgaand aan het uitvoeren van dit protocol, te verkrijgen nodige institutionele goedkeuring en er zeker van te voldoen aan alle richtlijnen verzorging van dieren. Euthanaseren van dieren met behulp van standaard IACUC goedgekeurde procedures. Voor dit werk werd de CO 2 stikken gebruikt gevolgd door cervicale dislocatie.
- OPTIE: Aparte hoofd van de rest van het lichaam met behulp van een scheermesje.
- Verwijder het vel van de onderlip aan de hals.
- Met behulp van een scalpel een incisie tussen de twee onderste snijtanden, die losjes zijn aangesloten. Bij het uitoefenen van druk, wordt de onderkaak worden gesplitst in twee helften.
- Wig de scalpel tussen de condylus van de kaak en de tijdelijke mandibulaire gewricht en snijd langs de kauwspieren aan de kaak los.
- Verwijder alle spieren, pezen en gewrichtsbanden totdat alleen het bot blijft.
2. Isoleer de Incisor
- Met behulp van een # 15 scalpelVoorzichtig scheren het bot op een 45 ° hoek vanaf het distale uiteinde naar het proximale uiteinde van de membraneuze regio. Gebruik de punt van het scalpel weg te halen resterende bot zoals de botfragmenten aan de rand. Langzaam beginnen weg te halen bij de linguale corticale plaat van de onderkaak, te beginnen net onder de 3 de mol.
- Ga door tot de snijtand is schoon, zorgvuldig werken aan het gebied met de CL.
- Verwijder inferieure alveolaire zenuw bundel.
- Maak een schone snede om eerst het bot en weefsel proximaal van de CL te verwijderen.
- Maak een tweede snede distaal met de scalpel, ruwweg onder de 2 e kies. De proximale snijtand regio wordt vervolgens ontleed door het invoegen van de scalpel tussen het bot en de mediale oppervlak van de proximale snijtand. Dit moet zorgvuldig gebeuren, om niet aan het weefsel scheurt. De incisie beweging proximale-distale.
ALTERNATIEVE STAP:
Verwijder zoveel bot mogelijk langs het gebied boven de incisor. Zodra gebied is ontruimd, zorgvuldig hele snijtand te verwijderen met behulp van een maat 5 tang om het glazuur gedeelte dichtst bij CL regio behandelen. - Plaats ontleed weefsel (hetzij geïsoleerd CL in figuur 3E, of hele snijtand volgens mogelijkheid stap 2.5) in 2% collagenase in 1X PBS gedurende 3-4 uur bij 4 ° C in een lage hechting plaat. Voor 1-10 snijtanden Gebruik 100 ul per putje in een 12-wells plaat. Voor meer dan 10 snijtanden, gebruiken 500 ul per putje in een 6-wells lage therapietrouw plaat.
3. Microdissect de Labiaal Baarmoederhalskanker Loop
- Verwijder CL regio in de collagenase en plaats in koude DMEM/F12 media.
- Trek voorzichtig aan de onderkant van de CL met behulp van maat 5 pincet of een insulinespuit (1 cc, 28 G ½); het mesenchym uit elkaar zal vallen, terwijl het epitheel intact blijft. De CL en de aangrenzende epitheel dat zich zijdelings als een "vleugel-achtige" structuur zichtbaar.
- Verwijderende apicale knop van de aangrenzende epitheel door een V-vormige insnijding aan beide zijden en zij plaatst in koud DMEM/F12 op ijs.
- Herhaal dit voor alle CVS, verzamelen in 1,5 ml microfugebuis.
- Spin down microfugebuis met exemplaren, verwijder media, te vervangen door 100 ul cel detachement oplossing.
- Incubeer weefsels in cel onthechting oplossing gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Distantiëren de weefsels naar een enkele cel suspensie te produceren door de pipet voorzichtig op en neer met een 1000 ui lage wrijvingscoëfficiënt pipet tip. Cellen kunnen ook door een steriel cel zeef geplaatst dissociatie bereiken.
- Tellen cellen met hemocytometer, plaat op weefselkweek plastic of andere gewenste materiaal.
4. Primaire Cultuur van DESCs
- Plaat cellen in een 6-well plaat bij 1-6 x 10 4 cellen / ml in aflopend media, bestaande uit DMEM/F12 aangevuld met muis EGF recombinant eiwit bij een concentratie van 20 ng / ml, FGF recombinant eiwit bij een concentratie van 25 ng / ml, 1X B27 supplement en 1% antibiotische oplossing (penicilline, 100 U / ml, streptomycine 50 ug / ml).
- Kweek cellen op een 6-puts plaat bij 37 ° C in 5% CO2 in 1 ml aflopend media. Heeft initiële culturen gedurende 5 dagen niet storen na plating naar cel adhesie en kolonie vorming mogelijk te maken.
- Voor de eerste media verandering vervangen halve volume (500 pl) van oude media met half volume (500 pl) van nieuwe media. Controleer kolonies onder de microscoop bij het wisselen van media.
- Na de eerste media veranderen, blijven de media (1-2 ml) elke 2 dagen. Controleer kolonies onder de microscoop bij het wisselen van media.
5. Passage DESCs
- Zuig media en was cellen 3x met voorverwarmd PBS.
- Add voorverwarmde 0,25% trypsine-EDTA in zoutoplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 10-15 min voor de DESCs losraken.
- Voeg DESC media om de trypsine te neutraliseren voorzichtig pipetteren langs weefselkweek plaat om de cellen en plaats verzamelen een 15 ml conische buis.
- Spin down cellen op 800 xg gedurende 2 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De muis hemi-onderkaak bestaat uit een continu groeiende snijtand en drie geworteld kiezen (Figuur 1A). Alle tanden bestaan uit tandbeen en glazuur, de twee gemineraliseerde onderdelen van de tand kroon (figuren 1A en 1A '). De snijtand huizen twee stamcelniches genaamd de labiale CL en linguale CL, en emaille wordt uitsluitend gevormd op de labiale zijde (Figuur 1A). DESCs zijn verantwoordelijk voor snijtanden glazuur vorming en zijn ondergebracht in de labiale CL bijzonder de OEE en SR (figuur 1A'') 8,9. De labiale CL bevat ook de IEE, TA-cellen, en de SI (Figuur 1A''). De techniek is gericht op de dissectie en isolatie van DESCs van de labiale CL (Figuur 1A''). Krt14-actine GFP marks-epitheliale cellen afgeleide van de hemi-onderkaak (figuur 1B), en de labiale CL duidelijk zichtbaar doorgaandugh de onderkaak (Figuur 1B ', witte pijl). Opgemerkt zij dat alle celtypen kunnen worden geïdentificeerd onder hogere vergroting (vergelijk Figuren 1A 'en B'').
De procedure voor de isolatie van DESCs van de labiale CL wordt samengevat in figuur 2. Kort wordt het hemi-onderkaak eerst uit het dier wordt onderkaak bot verwijderd om de labiale CL bloot, en vervolgens de labiale CL behandeld met collagenase te scheiden het epitheel van de omringende mesenchym. De CL gemicrodissecteerde, behandeld met celdissociatiebuffer en uitgeplaat in weefselkweekplaten. Scheiding van de labiale CL van de onderliggende kaakbot (figuur 3) en toevoeging van de juiste hoeveelheid media zijn essentieel voor de isolatie en de groei van de kolonies, respectievelijk. Kleine, strakke epitheliale kolonies gevormd met deze techniek zijn zichtbaar door 7 dagen (fig. 4A),en deze groeien tot grote kolonies binnen 2-3 weken (Figuur 4B).
Figuur 1. Illustraties van de volwassen muis snijtand. (A) De volwassen muis hemi-onderkaak toont de gemineraliseerde componenten, glazuur en dentine, en de twee soorten tanden, kiezen en snijtanden. De proximale snijtand regio waar de DESCs zijn ondergebracht is gemarkeerd in A '. (A') Sagittale van het proximale snijtand met de 2 stamcelniches, de labiale en linguale cervicale lus (LACL en LiCl), ameloblasts dat glazuur te genereren, en de odontoblasten dat dentine vormen. De LACL, die uitsluitend genereert ameloblast stamcellen en vormen uiteindelijk snijtand glazuur is gemarkeerd in A''. (A'') De LACL waaruit de buitenste glazuur epitheel (OEE), gestraalde reticulum (SR), innerlijke emaille epitheel (IEE), transit-versterkend (TA) regio, en het stratum intermedium (SI). De SR is vertegenwoordigd in blauw en donker roze tot de subpopulaties met verschillende dichtheden weerspiegelen. (B) Visualisatie van de cervicale lus met behulp van een fluorescerende reporter muis, KRT14-EGFP/Actb. Bone relatief autofluorescente en verwijdering van het bot bloot de cervicale lijn (B) en de rest van het epitheel, die dan gemakkelijk kunnen worden uitgesneden. (B'') alle structuren van de cervicale lus inclusief OEE, IEE, TA en SI kan gemakkelijk worden gevisualiseerd met het reportergen. Schaalbalken B ', B "= 2 mm, B' = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
es/ftp_upload/51266/51266fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 2. Overzicht van de dissectie en isolatie van de CL van de muis snijtand. Schematische weergave van de procedure. De CL is gelegen aan het proximale uiteinde van de onderkaak snijtand. De eerste stap is het omliggende kaakbot verwijderen om de snijtanden bloot CL intact. Vervolgens wordt de tand orgaan geïsoleerd en geplaatst in 2% collagenase afzonderlijke epitheel van mesenchym. Na 4 uur incubatie wordt de CL hand uitgesneden, gedissocieerd tot afzonderlijke cellen en gekweekte boven standaard weefselkweekplaten.
Figuur 3. Bone verwijdering van de muis onderkaak de onderliggende CL gebied bloot. Visuele controlepunten voor de botverwijdering van de dissectie proces weergegeven. (A) toont de hemi-onderkaak eenfter Stap 1.5, wanneer de spieren, pezen en ligament worden verwijderd uit het bot. (B) geeft het gebied beginnen met het verwijderen bot, vanaf net onder de 3e molaire, beweegt proximaal naar het gebied dat de CL. Vervolgens wordt alle bot proximaal van de CL verwijderd (C), zoals in stap 2.4. De volgende insnijding aan de rest van het bot te verwijderen zoals in stap 2.5 is weergegeven in (D). Tenslotte wordt de CL verwijderd uit het resterende bot zoals in stap 2.6 (E), vergrote weergave (inzet).
Figuur 4. Representatieve resultaten van succesvolle kolonievorming in vitro. A. Fase contrast microscopie van DESCs na plating in kweek gedurende 7 dagen. Strakke kolonie vorming geeft aan succesvolle epitheliale Isolation zonder mesenchymale vervuiling. Schaal bar = 400 urn. B. Na 10 dagen incuberen kolonies zijn groter en cellen een typisch geplaveide epitheliale morfologie. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitheelcellen werden voor het eerst met succes gekweekt meer dan 40 jaar geleden 21-24, en meer recentelijk, succesvolle isolatie van epitheliale stamcellen 25-27 heeft geavanceerde onze kennis van epitheliale biologie. Wij rapporteren een protocol voor het isoleren van de DESCs van de volwassen muis snijtand, een relatief weinig bestudeerd populatie van stamcellen die het potentieel om belangrijke inzichten in tandheelkundige biologie en emaille vorming opbrengst heeft. Dit protocol werd aanvankelijk gebaseerd op eerdere verslagen van epitheliale stamcellen geïsoleerd van de haarfollikel 28. Waar veel protocollen gebruiken feeder lagen en serum om epitheliale stamcellen te behouden, onze methode is een feeder gratis, serum-vrij systeem. Echter, onze groei media vereist het gebruik van een cocktail van EGF, FGF2 en B27 supplement. EGF is lange tijd gebruikt om ongedifferentieerde cellen te handhaven 29. Een cocktail van EGF en FGF2 samen met B27 werd vroeger gebruikt om de cultuur haarfollikel stamcellen 27, en B27 wordt veel gebruikt om neurale stamcellen te handhaven in kweek 30,31. We hebben ook eerder gemeten de levensvatbaarheid en groei kenmerken van DESCs bovenop weefselkweek plastic en op een verscheidenheid van ECM substraten, en in de tarieven van de proliferatie 19 werden geen verschillen aangetroffen. Cellen kunnen worden behouden gedurende 10 achtereenvolgende passages 19.
We gebruiken de onderste snijtanden voor deze procedure omdat het gemak van verwijdering ten opzichte van de bovenste snijtanden. De belangrijkste stappen in ons protocol tijdens isolement zijn de volledige verwijdering van de CL gebied van de onderkaak bot voordat u het in collagenase en een schone microdissection van de CL. Omdat de proximale snijtand is zeer delicaat, is het belangrijk om het niet te beschadigen tijdens dissectie, wat kan leiden tot verlies van de labiale CL. Onvolledige verwijdering zal leiden tot resten van de labialCL en een lagere opbrengst van DESCs. Bovendien is het belangrijk om verontreiniging met niet-C vermijdenL epitheelcellen. Aldus, nadat het epitheel is gescheiden van het mesenchym, een schone V-vormige incisie moet worden aan de labiale CL van de naburige epitheel verwijderd. Tenslotte is het essentieel om deze cellen plaat bij een concentratie van meer dan 1 x 10 4 cellen per ml en laat de helft van het geconditioneerde medium van de eerste media verandering.
Het grote voordeel van dit protocol om tandheelkundige activiteit is dat het mogelijk efficiënte productie en manipuleren van DESCs in vitro. Hoewel de muis snijtand wordt vastgesteld als een in vivo model 7-9,12,32-34, de ontwikkeling van een in vitro systeem voorschotten het veld tandheelkundig onderzoek door het openen van de deuren voor experimenten die moeilijk uit te voeren in vivo zijn. Voordelen van dit systeem omvatten de mogelijkheid om gemakkelijk manipuleren cellen in verschillende kweekomstandigheden, eenvoudig richten van een of zelfs meerdere signaalwegen en remming of activatie van targeted moleculen met behulp van siRNA of groeifactoren. Stroomafwaarts toepassingen van dit in vitro systeem onder toepassing van de hierboven genoemde technieken en andere geavanceerde technieken voor functionele en / of mechanistische studies, vooral op enkele cel.
Al met al kan informatie uit DESC in vitro cultuur helpen om de fijne kneepjes van stamcellen gebaseerde tand vernieuwing ontrafelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken Xiu-Ping Wang voor eerste hulp bij DESC culturen. De auteurs worden deels gefinancierd door beurzen en subsidies van de National Institutes of Health (K99-DE022059 om AHJ, K12-GM081266 naar MGC, K08-DE022377-02 tot OH, en R01-DE021420 te ODK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel |
| Forceps straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
References
- Sharpe, P. T., Young, C. S.
- D'Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
- Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
- Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
- Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
- Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
- Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
- Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
- Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
- Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
- Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
- Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
- Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
- Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
- Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
- Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
- Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
- Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
- Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
- Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
- Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
- Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
- Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).
