Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Published: May 1, 2014 doi: 10.3791/51266
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1,3, 1, 4,5,6, 1,7, 1,8
1Department of Orofacial Sciences and Program in Craniofacial and Mesenchymal Biology, University of California, San Francisco, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 3Department of Pathology and Research Center, Zhongshan Hospital of Dalian University, 4Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, UMR S872, 5Centre de Recherche des Cordeliers, Université Pierre et Marie Curie, UMR S872, 6INSERM U872, 7Division of Endodontics, Department of Preventive and Restorative Dental Sciences, University of California, San Francisco, 8Department of Pediatrics and Institute for Human Genetics, University of California, San Francisco

Summary

השן החותכת העכבר הולך ומתרחבת מספקת מודל ללימוד חידוש רקמות שיניים מתאי גזע שיניים אפיתל (DESCs). מערכת חזקה בעקביות ובאמינות קבלת תאים אלה מהשן החותכת והרחבתן במבחנה הוא דיווח כאן.

Abstract

הבנת המנגנונים התאיים ומולקולריים העומדים בבסיס התחדשות שן וחידוש הפכה לנושא עניין רב 1-4, והשן החותכת העכבר מספקת מודל לתהליכים אלה. איבר מופלא זה גדל ברציפות לאורך כל חייו של בעל החיים ומייצר את כל סוגי התאים הדרושים מבריכות פעילה של תאי גזע בוגרים שוכנו בשפתני (לכיוון השפתיים) והלשוני (לכיוון הלשון) לולאת צוואר הרחם אזורים (CL). רק תאי גזע שיניים מCL שפתני להצמיח ameloblasts שיוצרים אמייל, כיסוי החיצוני של שיניים, על פני השטח שפתני. היווצרות אמייל סימטרית זה מאפשרת שחיקה בקצה השן החותכת, ואת האבות ותאי גזע בשן החותכת הפרוקסימלי להבטיח כי רקמות השיניים מתחדשת כל הזמן. היכולת לבודד ולגדל תאי גזע או אלה במבחנה מאפשרת הרחבה שלהם ופותחת דלתות למספר רבים של ניסויים לא השגה in vivo, כגון שעותבדיקת תפוקת igh של גורמי רגולציה בתאי גזע פוטנציאליים. כאן, אנו מתארים ומדגימים שיטה אמינה ועקבית לתאי תרבות מCL שפתני של השן החותכת העכבר.

Introduction

אחד המאפיינים הייחודיים של בעלי חוליות היא האבולוציה של שיניים. השן הפכה מערכת מודל חשובה לתחומים רבים של מחקר, כמו המסלולים המולקולריים ומורפולוגיים התמחויות רלוונטיות לאיבר זה נחקרו מכמה נקודות מבט, ובכלל זה על ידי ביולוגים התפתחותיים והאבולוציונית 5. לאחרונה, תחום של רפואת רגנרטיבית החל לצבור תובנות רבות ערך באמצעות שן כמודל. בפרט, את הגילוי של תאי גזע אפיתל שיניים כבר מקדמה חשובה 6-13.

כל המכרסמים יש שיניים חותכות הולכות ומתרחבות צמיחה שמונעת על ידי תאי גזע, מה שהופך את השיניים האלה מערכת מודל נגישה ללמוד ויסות תאי גזע בוגרים. ניסויי תיוג ב1970s 10,11, ואחרי ניסויי התחקות שושלת גנטית 8,9,12,14, הוכיחו כי DESCs מתגורר באזור הפרוקסימלי של השן החותכת. הגזעצאצאי תא בתא אפיתל בצד המהלך שפתני מהנישה המשוערת, המכונה לולאת שפתני צוואר הרחם (CL), ולתרום לאוכלוסייה של תאים הנקראת תאים (ת"א) הגברת מעבר (איור 1). באופן ספציפי, DESCs מתגורר באפיתל החיצוני האמייל (OEE) וreticulum stellate (SR) 8,9,14, ואפיתל האמייל הפנימי (IEE) מעורר את תאי ת"א שיתקדמו במספר מוגבל של מחזורי תא ולאחר מכן מהלך distally לאורכו של השן החותכת (איור 1). Ameloblasts ההבחנה בשן החותכת העכבר ימשיך לנוע distally לאורך השן החותכת בקצב מדהים של כ 350 מיקרומטר ביום אחד 15,16. כאשר הם עוברים, התאים להתמיין ameloblasts הבוגר וintermedium שכבת תאים (SI). לאחר ההפקדה בעובי המלא של מטריצת אמייל, רבים של ameloblasts עובר אפופטוזיס, והתאים שנותרו להתכווץ בגודל ולהסדיר התבגרות אמייל <sup> 17. השושלת של סוגי תאים האחרים בCL שפתני, כגון SR, היא פחות ברורה, ונתונים לגבי תאי הגזע בmesenchyme 18 ובCL הלשוני רק מתחילים לצוץ.

שימוש במודל חותך העכבר, מספר הקבוצות עבד על מנת להבהיר את המסלולים הגנטיים ותהליכים ביולוגיים תא מעורב בחידוש איברים טבעי גזע מבוסס תאים. עם זאת, CL שפתני מכיל מספר קטן יחסית של תאים, מוערך בכ -5,000 לשן חותכת עכבר, מה שהופך את העבודה עם תאים ראשוניים מאתגרים. לכן, נעשו מאמצים לתרבות ולהרחיב את התאים האלה במבחנה 6,16,19,20 על מנת לפתוח דלתות חדשות לגישות ניסיוניות שאינן ברי השגה in vivo. המחקר שנערך לאחרונה רוב הוכיח כי תאים אלה יכולים גם עצמי לחדש ולהתמיין לamelogenin לבטא בתאים כאשר 13 בתרבית. כאן, אנו מתארים ומדגימים שיטה להדואר תרבות אמינה ועקבית של תאים משפתני העכבר CL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לנתח תחתונה חמי-לסתות מעכבר למבוגרים

  1. קודם לביצוע פרוטוקול זה, לקבל את אישור מוסדי דרוש ולהיות בטוח כדי לעמוד בכל הנחיות הטיפול בבעלי החיים. להרדים בעלי חיים באמצעות IACUC הסטנדרטי אושר נהלים. עבור עבודה זו CO מחנק 2 היה בשימוש ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    1. אופציונלי: ראש נפרד משאר הגוף באמצעות סכין גילוח.
  2. הסר את העור מן השפה התחתונה למחשוף.
  3. באמצעות אזמל, עושה חתך בין שתי החותכות התחתונות, אשר מחוברות באופן רופף. לאחר הפעלת לחץ, הלסת התחתונה תהיה מחולקת לשני חצאים.
  4. טריז האזמל בין condyle של הלסת ומפרקי לסת התחתונים, הזמן ולחתוך לצד השרירים הלסת לנתק את הלסת.
  5. הסר את כל השריר, גיד, רצועה ועד שרק העצם נשאר.

2. לבודד את הארקטיק

  1. באמצעות אזמל # 15, לגלח בזהירות את העצם בזווית של ° 45 מהקצה הדיסטלי לקצה הפרוקסימלי של האזור הקרומי. השתמש בקצה של האזמל כדי לאסוף משם כל עצם שנותר ביניהם שברי עצמות בקצה. לאט לאט מתחיל לאסוף משם בצלחת קליפת המוח הלשונית של הלסת התחתונה, מתחיל ממש מתחת לשן טוחנת 3 rd.
  2. המשך עד השן החותכת היא נקייה, עובדת בזהירות לכיוון השטח שבו CL.
  3. הסר את צרור עצבים מכתשיים נחותים.
  4. לעשות חתך נקי כדי להסיר תחילה את העצם ורקמות הפרוקסימלי לCL.
  5. לעשות חתך שני distally עם האזמל, בערך מתחת לשן טוחנת 2 nd. אזור השן החותך הפרוקסימלי מכן גזור החוצה על ידי החדרת האזמל בין העצם לבין המשטח המדיאלי של השן החותכת הפרוקסימלי. זה חייב להיעשות בזהירות, כדי לא לקרוע את הרקמה. תנועת החתך היא הפרוקסימלי-דיסטלי.
    שלב חלופי:
    להסיר כמה שיותר עצם ככל האפשר לאורך האזור שמעלייncisor. ברגע שהשטח נוקתה, להסיר בזהירות את כל שן חותכת באמצעות גודל 5 מלקחיים כדי לטפל בחלק האמייל הקרוב ביותר לאזור CL.
  6. הנח רקמה גזור (או CL המבודד כמו באיור 3E, או כל שן חותכת כמו בשלב חלופי 2.5) בcollagenase 2% ב 1X PBS עבור 3-4 שעות ב 4 ° C בצלחת היענות נמוכה. ל1-10 חותכות, השתמש בכל טוב 100 μl ב12 גם צלחת. לגדול יותר מ10 חותכות, השתמש 500 μl לכל טוב ב6 היטב צלחת נמוכה דבקות.

3. Microdissect שפתני צוואר הרחם Loop

  1. הסר את אזור CL מcollagenase והמקום בתקשורת DMEM/F12 הקרה.
  2. משוך בעדינות בקצה התחתון של CL או באמצעות גודל 5 מלקחיים או מזרק אינסולין (1 סמ"ק, 28 G ½); mesenchyme יתפרק תוך האפיתל נותר בשלמותה. CL ואפיתל הסמוך המשתרע רוחבי כמבנה "כמו כנף" יהיה גלויים.
  3. להסירניצן apical מן האפיתל הסמוך על ידי ביצוע חתך בצורת V בכל צד, ומניח מייד בDMEM/F12 הקר על קרח.
  4. חזור על פעולה עבור כל CLS, לאסוף ב1.5 צינור microfuge מיליליטר.
  5. ספין למטה צינור microfuge עם דגימות, להסיר תקשורת, להחליף עם 100 פתרון ניתוק תא μl.
  6. דגירה רקמות בפתרון ניתוק תא ל30 דקות ב 37 ° C.
  7. לנתק את הרקמות לייצר השעיה תא בודדת על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה באמצעות פיפטה קצה נמוכה הידבקות 1,000 μl. יכולים גם להיות ממוקמים תאים דרך מסננת תא סטרילי כדי להשיג דיסוציאציה.
  8. ספירת תאים עם hemocytometer, צלחת פלסטיק בתרבית רקמה או חומר רצוי אחר.

4. תרבות העיקרית של DESCs

  1. פלייט תאים בצלחת 6 היטב ב1-6 x 10 4 תאים / מיליליטר בתקשורת DESC, אשר מורכב מDMEM/F12 בתוספת חלבון רקומביננטי EGF העכבר בריכוז של 20 nגר '/ מיליליטר, חלבון רקומביננטי FGF בריכוז של 25 ng / ml, תוסף B27 1X, ופתרון 1% אנטיביוטיקה (פניצילין, 100 U / ml, סטרפטומיצין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר).
  2. לגדל תאים מצופים על צלחת 6 היטב על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 ב 1 מיליליטר של תקשורת DESC. נא לא להפריע תרבויות ראשוניות במשך 5 ימים לאחר ציפוי לאפשר הידבקות תא והקמת מושבה.
  3. לשינוי התקשורתי הראשון, החלף חצי מהנפח (500 μl) של המדיה ישנה עם חצי נפח (500 μl) של המדיה חדשה. בדקו מושבות תחת מיקרוסקופ כאשר תקשורת משתנות.
  4. לאחר השינוי בתקשורת הראשון, ממשיך לשנות תקשורת (1-2 מיליליטר) כל 2 ימים. בדקו מושבות תחת מיקרוסקופ כאשר תקשורת משתנות.

5. DESCs המעבר

  1. תקשורת לשאוב ולשטוף תאי 3x עם PBS חימם מראש.
  2. להוסיף מראש חימם 0.25% טריפסין-EDTA בתמיסת מלח ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות לDESCs לניתוק.
  3. הוסף מדיה DESC לנטרל את טריפסין, בעדינות פיפטה לאורך צלחת תרבית רקמה כדי לאסוף את התאים, ומקום בצינור חרוטי 15 מיליליטר.
  4. ספין למטה תאים ב XG 800 למשך 2 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

החמים-הלסת התחתונה של העכבר כוללת אחד חותכת הולכים ומתרחב ושלוש טוחנות מושרשות (איור 1 א). כל השיניים מורכבות של דנטין ואמייל, שני הרכיבים mineralized של כתר השן (איורים 1 א ו 1 א '). הבתים החותכים שתי גומחות תאי גזע שנקראים CL שפתני וCL הלשוני, ואמייל נוצר אך ורק בצד שפתני (איור 1 א '). DESCs אחראי להיווצרות אמייל שן חותכת והם שוכנו בCL שפתני, במיוחד OEE וSR (איור 1 א'') 8,9. CL שפתני מכיל גם IEE, תאי ת"א, וSI (איור 1 א''). בנתיחה והבידוד של DESCs של CL שפתני (איור 1 א'') בטכניקה שלנו היא ממוקדת. Krt14-אקטין GFP מסמן את כל התאים שמקורם באפיתל של החמים-לסת תחתונה (איור 1), וCL שפתני ניתן לראות בבירור throאיכס הלסת התחתונה (איור 1 ב ', חץ לבן). יצוין, כי ניתן לזהות את כל סוגי התאים בהגדלה גבוהה יותר (השווה איורים 1 א 'וב''').

ההליך לבידודה של DESCs מCL שפתני מסוכם באיור 2. בקצרה, החמים-הלסת התחתונה מוסרים ראשונה מבעלי החיים, עצם לסת תחתון, הוא הוסר כדי לחשוף את CL שפתני, ולאחר מכן CL שפתני מטופל עם collagenase כדי להפריד את האפיתל מmesenchyme שמסביב. CL הוא microdissected, שטופלו בחיץ התא דיסוציאציה, ומצופה בצלחות תרבית רקמה. הפרדת CL שפתני מעצם לסת הבסיס (איור 3) ותוספת של נפח התקין של תקשורת חיונית לבידוד והצמיחה של המושבות, בהתאמה. מושבות קטנות, הדוקות אפיתל נוצרו באמצעות טכניקה זו הן גלויות של 7 ימים (איור 4 א),ולגדול אלה למושבות גדולות בתוך 2-3 שבועות (איור 4).

איור 1
איור 1. איורים של השן החותכת העכבר הבוגר. () העכבר הבוגר, חמי לסת תחתונה מראה את רכיבי mineralized, אמייל והדנטין, ושני סוגים של שיניים, שיניים טוחנות וחותכות. אזור השן החותך הפרוקסימלי בי DESCs הם שוכנו מודגש '. (' השקפת sagittal של השן החותכת הפרוקסימלי מראה 2 נישות של תאי גזע), לולאת שפתני והלשונית צוואר הרחם (LaCl וLiCl), ameloblasts שיוצרים אמייל, ו odontoblasts כי טופס דנטין. LaCl, אשר באופן בלעדי מייצר תאי אבות ameloblast וסופו של דבר יוצר אמייל שן חותך מודגש''. ('') LaCl מראה את האפיתל האמייל החיצוני , Reticulum stellate (SR), האפיתל אמייל פנימי, באזור מעבר-הגברה (ת"א) (IEE), וintermedium השכבה (SI) (OEE). SR מיוצג בורוד כחולה וכהה על מנת לשקף את האוכלוסיות עם צפיפויות שונות. ויזואליזציה (ב) ללולאה בצוואר הרחם באמצעות עכבר כתב ניאון, KRT14-EGFP/Actb. עצם הוא יחסית autofluorescent, והסרה של העצם חושפת את לולאת צוואר הרחם (ב ') ואת שאר אפיתל, אשר לאחר מכן ניתן נכרת בקלות. (ב'') כל המבנים של הלולאה בצוואר הרחם כולל OEE, IEE ת"א ויכול להיות דמיינו SI בקלות עם גן הכתב. ב 'סולם ברים', ב '= 2 מ"מ, B "= 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Width =" es/ftp_upload/51266/51266fig2highres.jpg 500 "/>
איור 2. סקירה כללית של הנתיחה והבידוד של CL של השן חותכת עכבר. ייצוג סכמטי של ההליך. CL ממוקם בקצה הפרוקסימלי של השן החותכת הלסת התחתונה. הצעד הראשון הוא להסיר את עצם לסת שמסביב כדי לחשוף את השן חותכת עם CL ללא פגע. בשלב הבא, איבר שן מבודד והניח בcollagenase 2% לאפיתל נפרד מmesenchyme. לאחר 4 שעות דגירה, CL הוא נכרת באופן ידני, ניתק לתוך תאים בודדים, ותרבותי על גבי צלחות תרבית רקמה רגילות.

איור 3
איור 3. הסרת עצם של הלסת התחתונה עכבר כדי לחשוף את אזור CL הבסיסי. מחסומים חזותיים להסרת העצם של תהליך הנתיחה מוצגים. () מציג את החמים-לסת תחתונהשלב חרי 1.5, ברגע שהשרירים, הגידים והרצועות מוסרים מהעצם. (ב ') מציין את האזור כדי להתחיל הסרת עצם, החל מרק מתחת לשן טוחנת 3 rd, נע proximally כלפי האזור המכיל את CL. בשלב הבא, כל הפרוקסימלי עצם CL מוסר (ג), כאמור בשלב 2.4. החתך הבא כדי להסיר את שאר העצם כאמור בשלב 2.5 מוצג ב( ד '). לבסוף, CL הוא להסיר את העצם שנותר כאמור בשלב 2.6 (E), תצוגה מוגדלת (הבלעה).

איור 4
איור 4. נציג תוצאות של הקמת מושבה מוצלחת במבחנה. מיקרוסקופיה א שלב ניגודיות של DESCs, לאחר ציפוי בתרבות למשך 7 ימים. הקמת מושבה הדוקה מציינת isolatio אפיתל המוצלחn ללא זיהום mesenchymal. בר = 400 מיקרומטר קנה המידה. B. לאחר 10 ימים של דגירה, מושבות גדולות יותר בגודלם ויש להם תאים אפיתל מורפולוגיה מרוצף טיפוסית. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תאי אפיתל היו ראשון בהצלחה בתרבית לפני למעלה 40 שנות 21-24, ולאחרונה, בידוד מוצלח של תאי גזע אפיתל 25-27 יש הידע מתקדם של ביולוגיה האפיתל שלנו. אנו מדווחים על פרוטוקול לבידוד DESCs של השן החותכת העכבר המבוגר, אוכלוסייה יחסית understudied של תאי גזע שיש לו הפוטנציאל להניב תובנות חשובות בביולוגיה שיניים והיווצרות אמייל. פרוטוקול זה היה ראשיתם בדוחות קודמים של בידוד תאי גזע אפיתל מזקיק השיער 28. ואילו פרוטוקולים רבים משתמשים בשכבות מזין וסרום כדי לשמור על תאי גזע אפיתל, השיטה שלנו היא מערכת מזין ללא תשלום, בסרום. עם זאת, תקשורת הצמיחה שלנו דורשת את השימוש בקוקטייל של EGF, FGF2 ותוסף B27. EGF משמש כבר זמן רב כדי לשמור על תאים שלא עברו התמיינות 29. קוקטייל של EGF וFGF2 יחד עם B27 שימש בעבר לתאי גזע זקיקי שיער התרבות 27, ו-B27 נעשה שימוש נרחב כדי לשמור על תאי גזע עצביים בתרבות 30,31. יש לנו גם נמדדו בעבר מאפייני כדאיות ושיעור צמיחה של DESCs על גבי פלסטיק בתרבית רקמה ועל מגוון רחב של מצעי ECM, ואין הבדלים התגלו בשיעורי הריבוי 19. תאים יכולים להישמר לתקופה של עד 10 מעברים סידוריים 19.

אנו משתמשים בחותכות התחתונות להליך זה בגלל הקלות של ההסרה בהשוואה לשיניים החותכות העליונות. הצעדים החשובים ביותר בפרוטוקול שלנו בבידוד הם הסרה המלאה של אזור CL מעצם הלסת התחתון, לפני הצבת בcollagenase וmicrodissection נקי של CL. בגלל השן החותכת הפרוקסימלי היא עדינה מאוד, חשוב שלא לפגוע בו במהלך נתיחה, שעלול לגרום לאובדן של CL שפתני. ההסרה שלמה תוביל לשרידי labialCL ותשואה נמוכה יותר של DESCs. בנוסף, חשוב כדי למנוע זיהום עם הלא Cתאי אפיתל L. כך, לאחר אפיתל הופרד מmesenchyme, חתך בצורת V נקי צריך להיעשות כדי להסיר את CL שפתני מן האפיתל השכן. לבסוף, זה חיוני לצלחת תאים אלה בריכוז של מעל 1 x 10 4 תאים לכל מיליליטר ולהשאיר מחצית התקשורת המותנה לשינוי בתקשורת הראשון.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה למחקר דנטלי הוא שהיא מאפשרת ייצור ומניפולציה של DESCs במבחנה יעילים. אמנם חותך העכבר הוקם כמודל vivo ב7-9,12,32-34, הפיתוח של מערכת במבחנה מקדם את תחום מחקר רפואת שיניים על ידי פתיחת הדלתות לניסויים שקשה לבצע בגוף חי. יתרונות של מערכת זו כוללים את היכולת לתמרן בקלות את התאים בתנאי תרבות שונים, מיקוד קל של מסלולי איתות בודדים או אפילו רבים, ועיכוב או הפעלה של ת"אמולקולות rgeted באמצעות siRNA או גורמי גדילה. יישומים במורד הזרם של מערכת זו במבחנה כוללים שימוש בטכניקות שצוינו לעיל, כמו גם טכניקות חדשניות אחרות כדי לבצע מחקרים תפקודיים ו / או מכניסטית, בעיקר ברמת התא הבודד.

בסך הכל, מידע שלוקטו DESC בתרבות חוץ גופית יכול לעזור לפענח את המורכבות של חידוש שן תאי גזע מבוסס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים Xiu-פינג וואנג לעזרה ראשונית עם תרבויות DESC. המחברים ממומנים בחלקו על ידי מלגות ומענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (K99-DE022059 לAHJ, K12-GM081266 לMGC, K08-DE022377-02 לאה, וR01-DE021420 לODK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharpe, P. T., Young, C. S. Test-tube teeth. Sci Am. 293, 34-41 (2005).
  2. D'Souza, R. N., Klein, O. D. Unraveling the molecular mechanisms that lead to supernumerary teeth in mice and men: Current concepts and novel approaches. Cells Tissues Organs. 186, 60-69 (2007).
  3. Jernvall, J., Thesleff, I. Tooth shape formation and tooth renewal: evolving with the same signals. Development. 139, 3487-3497 (2012).
  4. Yen, A. H., Yelick, P. C. Dental Tissue Regeneration A Mini-Review. Gerontology. 57, 85-94 (2011).
  5. Jheon, A. H., Seidel, K., Biehs, B., Klein, O. D. From molecules to mastication: the development and evolution of tooth development. WIREs Dev Biol. 2, 165-182 (2013).
  6. Wang, X. P., et al. An integrated gene regulatory network controls stem cell proliferation in teeth. PLoS Biol. 5, (2007).
  7. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. J Cell Biol. 147, 105-120 (1999).
  8. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Dev Cell. 23, 317-328 (2012).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137, 3753-3761 (2010).
  10. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. Anat Rec. 183, 523-561 (1975).
  11. Smith, C. E., Warshawsky, H. Quantitative analysis of cell turnover in the enamel organ of the rat incisor. Evidence for ameloblast death immediately after enamel matrix secretion. Anat Rec. 187, 63-98 (1977).
  12. Parsa, S., et al. Signaling by FGFR2b controls the regenerative capacity of adult mouse incisors. Development. 137, 3743-3752 (2010).
  13. Chang, J. Y., et al. Self-renewal and multilineage differentiation of mouse dental epithelial stem cells. Stem Cell Res. 11, 990-1002 (2013).
  14. Biehs, B., et al. Bmi1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nat Cell Biol. 15, 846-852 (2013).
  15. Hwang, W. S., Tonna, E. A. Autoradiographic Analysis of Labeling Indices and Migration Rates of Cellular Component of Mouse Incisors Using Tritiated Thymidine (H3tdr). J Dent Res. 44, 42-53 (1965).
  16. Li, C. Y., et al. E-cadherin regulates the behavior and fate of epithelial stem cells and their progeny in the mouse incisor. Dev Biol. 366, 357-366 (2012).
  17. Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Crit Rev Oral Biol Med. 9, 128-161 (1998).
  18. Lapthanasupkul, P., et al. Ring1a/b polycomb proteins regulate the mesenchymal stem cell niche in continuously growing incisors. Dev Biol. 367, 140-153 (2012).
  19. Chavez, M. G., et al. Characterization of dental epithelial stem cells from the mouse incisor with two-dimensional and three-dimensional platforms. Tissue Eng Part C Methods. 19, 15-24 (2013).
  20. Kawano, S., et al. Establishment of dental epithelial cell line (HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling pathway. Connect Tissue Res. 43, 409-412 (2002).
  21. Briggaman, R. A., Abele, D. C., Harris, S. R., Wheeler, C. E. Preparation and characterization of a viable suspension of postembryonic human epidermal cells. J Invest Dermatol. 48, 159-168 (1967).
  22. Fusenig, N. E. Isolation and cultivation of epidermal cells from embryonic mouse skin. Naturwissenschaften. 58, 421 (1971).
  23. Fusenig, N. E., Worst, P. K. Mouse epidermal cell cultures. I. Isolation and cultivation of epidermal cells from adult mouse skin. J Invest Dermatol. 63, 187-193 (1974).
  24. Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
  25. Barrandon, Y., Green, H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 2302-2306 (1987).
  26. Blanpain, C., et al. Self-renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 118, 635-648 (2004).
  27. Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol. 3, 778-784 (2001).
  28. Nowak, J. A., Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol. 482, 215-232 (2009).
  29. Rheinwald, J. G., Green, H. Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265, 421-424 (1977).
  30. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  31. Lesuisse, C., Martin, L. J. Long-term culture of mouse cortical neurons as a model for neuronal development, aging, and death. J Neurobiol. 51, 9-23 (2002).
  32. Felszeghy, S., Suomalainen, M., Thesleff, I. Notch signalling is required for the survival of epithelial stem cells in the continuously growing mouse incisor. Differentiation. 80, 241-248 (2010).
  33. Fujimori, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling in the dental mesenchyme regulates incisor development by regulating Bmp4. Dev Biol. 348, 97-106 (2010).
  34. Klein, O. D., et al. An FGF signaling loop sustains the generation of differentiated progeny from stem cells in mouse incisors. Development. 135, 377-385 (2008).

Tags

ביולוגיה של תאי גזע גיליון 87 אפיתל תאי גזע תאי גזע בוגרים הארקטיק צוואר הרחם Loop תרבית תאים
בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K.,… More

Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter