Summary
Das kontinuierlich wachsende Maus Schneidezahn stellt ein Modell für die Untersuchung Erneuerung der Zahngewebe aus Zahn epithelialen Stammzellen (DESC). Ein robustes System für konsistent und zuverlässig diese Zellen von den Schneide erhalten und in vitro expandiert sie hier berichtet wird.
Abstract
Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Zahnwiedergeburt und Erneuerung zugrunde liegen, hat sich zu einem Thema von großem Interesse 1-4, und die Maus Schneidezahn ein Modell für diese Prozesse. Diese bemerkenswerte Orgel wächst kontinuierlich während des ganzen Lebens des Tieres und alle notwendigen Zelltypen aus dem aktiven Pools von adulten Stammzellen in der labialen (in Richtung der Lippe) und lingual (zur Zunge) Hals-Schleife (CL) untergebracht Regionen erzeugt. Nur die Zahn Stammzellen von der labialen CL verursachen Adamantoblasten die Emaille, die äußere Ummantelung der Zähne, auf der labialen Oberflächen zu erzeugen. Diese asymmetrische Zahnschmelzbildung ermöglicht Abrieb an der Schneidezahnspitze und Vorläuferzellen und Stammzellen in der proximalen Schneidezahn sicherzustellen, dass die Zahngewebe werden ständig aufgefüllt. Die Fähigkeit, in vitro zu isolieren und zu wachsen diese Vorläufer-oder Stammzellen erlaubt die Expansion und öffnet Türen zu zahlreichen Versuchen nicht erreichbar in vivo, wie Hoch Durch Prüfung von potenziellen Stammzellregulationsfaktoren. Hier beschreiben wir und zeigen eine zuverlässige und konsistente Methode zur Kultivierung von Zellen von der labialen CL der Maus Schneidezahn.
Introduction
Eines der einzigartigen Merkmale von Wirbeltieren ist die Entwicklung der Zähne. Der Zahn ist ein wichtiges Modellsystem für viele Bereiche der Forschung, da die molekularen Signalwege und relevant zu dieser Orgel morphologischen Spezialisierungen aus verschiedenen Perspektiven untersucht worden, unter anderem durch Entwicklungs-und Evolutionsbiologen 5. Vor kurzem hat der Bereich der regenerativen Medizin hat damit begonnen, wertvolle Erkenntnisse zu gewinnen mit dem Zahn als Modell. Insbesondere die Entdeckung von Zahn epithelialen Stammzellen ist ein wichtiger Fortschritt 6-13.
Alle Nager besitzen stetig wachsenden Schneidezähne, deren Wachstum durch Stammzellen angeheizt, so dass diese Zähne ein zugängliches Modellsystem, um die adulte Stammzellregulation zu studieren. Markierungsexperimente in der 1970er 10,11, gefolgt von genetischer Abstammung Tracing 8,9,12,14 Experimente haben gezeigt, dass DESC befinden sich im proximalen Bereich der Schneidezähne. Der SchaftZelle Nachkommen in der epithelialen Fach auf der labialen Seite bewegen sich aus der vermeintlichen Nische, wie die Lippen-Hals-Schleife (CL) bekannt ist, und zu einer Population von Zellen, die sogenannten Transit-Verstärkung (TA)-Zellen (Abbildung 1). Genauer gesagt, befinden DESC in der äußeren Schmelzepithels (OEE) und sternförmigen Retikulum (SR) 8,9,14 und die innere Schmelzepithels (IEE) gibt Anlass zu den TA-Zellen, die durch eine begrenzte Anzahl von Zellzyklen fortschreiten und dann bewegen distal entlang der Länge der Schneidezähne (Abbildung 1). Die Differenzierung Ameloblasten in der Maus Schneidezahn weiter distal entlang der Schneidezähne mit einer bemerkenswerten Geschwindigkeit von etwa 350 um an einem einzigen Tag 15,16 bewegen. Wie sie sich bewegen, zu differenzieren die Zellen zu reifen Ameloblasten und Stratum intermedium (SI)-Zellen. Nach dem Aufbringen der gesamten Dicke von Schmelzmatrix, viele der Adamantoblasten Apoptose, und die verbleibenden Zellen in der Größe schrumpfen und zu regulieren Schmelzreifung <sup> 17. Die Linie der anderen Zelltypen im Lippen CL, wie der SR, ist weniger klar, und Daten über den Stammzellen im Mesenchym 18 und in der lingualen CL beginnen erst zu entstehen.
Mit der Maus Schneidezahn-Modell, eine Reihe von Gruppen gearbeitet haben, um die genetischen Signalwege und zellbiologische Prozesse in natürlichen Stammzellen-basierten Orgelerneuerung beteiligt aufzuklären. Jedoch enthält der labialen CL eine relativ kleine Anzahl von Zellen, auf etwa 5000 pro Maus Schneidezahn, die die Arbeit mit primären Zellen Herausforderung macht. Daher haben sich bemüht, Kultur wurden und erweitern diese Zellen in vitro 6,16,19,20, um neue Türen zu experimentellen Ansätzen, die nicht in vivo erreichbar sind zu öffnen. Die jüngste Studie hat gezeigt, dass diese Zellen sowohl selbst erneuern und zu differenzieren in amelogenin exprimierenden Zellen kultiviert, wenn 13. Hier beschreiben wir und zeigen ein Verfahren zur the zuverlässige und konsistente Kultur von Zellen von der Maus labialen CL.
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Protocol
1. Dissect Nieder Hemi-Mandibeln von erwachsenen Maus
- Vor der Durchführung dieses Protokolls erforderlichen institutionellen Genehmigung zu erhalten und sicher sein, mit allen Tierpflege-Richtlinien. Euthanize Tier mit Standard IACUC genehmigten Verfahren. Für diese Arbeit CO 2-Erstickung wurde verwendet, gefolgt durch zervikale Dislokation.
- OPTIONAL: Separate Kopf vom Rest des Körpers mit einer Rasierklinge.
- Entfernen Sie die Haut vor der Unterlippe an den Halsausschnitt.
- Mit einem Skalpell einen Einschnitt zwischen den beiden unteren Schneidezähne, die lose miteinander verbunden sind. Beim Anlegen von Druck wird der Unterkiefer in zwei Hälften geteilt werden.
- Keil das Skalpell zwischen dem Gelenkkopf des Kiefers und der Kiefergelenk und neben der Kiefermuskel geschnitten, um den Kiefer zu lösen.
- Entfernen Sie das gesamte Muskel-, Sehnen-und Bänder bis nur noch die Knochenreste.
2. Isolieren Sie die Schneidezahn
- Mit einem Skalpell Nr. 15Sorgfältig rasieren den Knochen in einem Winkel von 45 ° von dem distalen Ende zu dem proximalen Ende des membranartigen Bereichs. Verwenden Sie die Spitze des Skalpells zu holen Sie verbleibende Knochen einschließlich der Knochenfragmente am Rand. Langsam beginnen, bei der lingualen kortikalen Platte des Unterkiefers entfernt holen, beginnend knapp unterhalb der 3. Molaren.
- Fortfahren, bis der Schneidezahn ist sauber, sorgfältig arbeiten auf den Bereich, der die CL.
- Entfernen alveolaris inferior Nervenbündel.
- Machen Sie einen sauberen Schnitt, zuerst die Knochen-und Gewebe proximal der CL zu entfernen.
- Machen Sie einen zweiten Schnitt distal mit dem Skalpell, etwa unter dem 2. Molaren. Das proximale Schneidezahnbereich wird dann durch Einsetzen des Skalpells zwischen dem Knochen und der medialen Fläche des proximalen Schneidezahn präpariert. Dies muß sorgfältig durchgeführt werden, um nicht in das Gewebe zu zerreißen. Der Schnitt Bewegung ist proximal-distalen.
ALTERNATIVE STEP:
Zu entfernen, so viel Knochen wie möglich an dem Bereich über dem incisor. Sobald Bereich wird gelöscht, entfernen Sie vorsichtig gesamte Schneidezahn mit eine Größe von 5 Zange, um den Zahnschmelz Teil hand am nächsten CL Region. - Platzieren seziert Gewebe (entweder isoliert CL, wie in Fig. 3E oder ganze Schneidezahn nach alternativen Schritt 2.5) in 2% Kollagenase in 1X PBS für 3-4 Stunden bei 4 ° C in einer Niederhalten Platte. Für 1-10 Schneidezähne, verwenden Sie 100 ul pro Well in einer 12-Well-Platte. Für mehr als 10 Schneidezähne, verwenden Sie 500 ul pro Well in einer 6-Well Platte geringe Haftung.
3. Microdissect die Labial Cervical-Schleife
- Entfernen CL Region aus der Kollagenase und in kaltem DMEM/F12-Medium.
- Ziehen Sie am unteren Ende der CL entweder mit der Größe 5 Zange oder einer Insulinspritze (1 ml, 28 G ½); das Mesenchym auseinander fallen, während das Epithel intakt bleibt. Die CL-und die benachbarte Epithel, die sich seitlich als "flügelartigen" Struktur erstreckt sichtbar.
- Entfernendie apikalen Knospe von der benachbarten Epithel, indem ein V-förmiger Einschnitt auf jeder Seite, und sofort in kaltem DMEM/F12 auf Eis.
- Wiederholen Sie für alle CLs, sammeln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Spin down Mikrozentrifugenröhrchen mit Proben, entfernen Medien, ersetzen mit 100 ul Zellablösung Lösung.
- Gewebe in Zellentfernungslösung für 30 min bei 37 ° C.
- Distanzieren das Gewebe, um eine Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit einer 1.000 ul geringer Haftung Pipettenspitze herzustellen. Zellen können auch durch ein steriles Sieb Zelle angeordnet werden, um die Dissoziation zu erreichen.
- Zählen von Zellen mit Hämozytometers, Platte auf Gewebekultur Kunststoff oder anderen gewünschten Material.
4. Primärkultur von DESC
- Platten Zellen in einer 6-Well-Platte bei 1-6 × 10 4 Zellen / ml in DESC Medien, die von DMEM/F12 mit Maus-EGF rekombinantes Protein ergänzt war, bei einer Konzentration von 20 n bestehtg / ml FGF rekombinantes Protein in einer Konzentration von 25 ng / ml, 1 × B27 Ergänzung und 1% Antibiotika-Lösung (Penicillin, 100 U / ml Streptomycin, 50 ug / ml).
- Wachsen Zellen auf einer 6-Well-Platte ausplattiert, auf 37 ° C in 5% CO 2 in 1 ml DESC Medien. Anfangs Kulturen für 5 Tage nach der Beschichtung, um die Zellhaftung und Koloniebildung ermöglichen nicht stören.
- Zum ersten Medienwechsel, ersetzen Sie die Hälfte des Volumens (500 ul) alten Medien mit Halb Volumen (500 ul) der neuen Medien. Überprüfen Kolonien unter dem Mikroskop beim Medienwechsel.
- Nach dem ersten Medienwechsel, weiterhin Medien (1-2 ml) alle 2 Tage ändern. Überprüfen Kolonien unter dem Mikroskop beim Medienwechsel.
5. Passage DESC
- Saugen Medien und waschen Sie die Zellen 3x mit vorgewärmter PBS.
- Hinzufügen vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA in einer Salzlösung und Inkubation bei 37 ° C für 10-15 Minuten für die DESC zu lösen.
- In DESC Medien, um das Trypsin zu neutralisieren, vorsichtig pipettieren entlang Gewebekulturplatte, um die Zellen, und in eine 15 ml konischen Röhrchen zu sammeln.
- Spin down Zellen bei 800 g für 2 min.
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Representative Results
Die Maus halbKiefers weist einen kontinuierlich wachsenden Schneidezähne und Backenzähne drei Wurzeln (Fig. 1A). Alle Zähne aus Dentin und Zahnschmelz, der zwei mineralisierten Komponenten der Zahnkrone (Fig. 1A und 1A '). Die Schneidezähne beherbergt zwei Stammzellnischen genannt labialen und lingualen CL CL und Email wird ausschließlich auf der labialen Seite (Abbildung 1A ') gebildet wird. DESC für Schneidezahn Schmelzbildung verantwortlich und werden in der labialen CL, insbesondere der OEE und SR (1A'') 8,9 untergebracht. Die labiale CL enthält auch die IEE, TA-Zellen und den SI (1A''). Unser Verfahren basiert auf der Zerlegung und Isolierung DESC der labialen CL (1A'') fokussiert. KRT14-Actin GFP markiert alle Epithelzellen abgeleitete Zellen des halbKiefer (1B) und der labialen CL ist deutlich erkennbar, through der Unterkiefer (Abbildung 1B ', weißer Pfeil). Es sei darauf hingewiesen, dass alle Zelltypen kann bei starker Vergrößerung (vergleiche Fig. 1A 'und B'') identifiziert werden.
Das Verfahren zur Isolierung von DESC von der labialen CL ist in Fig. 2 zusammengefaßt. Kurz gesagt wird das erste halbKiefer des Tieres entfernt, Unterkieferknochen entfernt, um die labialen CL freizulegen, und dann wird die Lippen CL wird mit Kollagenase behandelt trennen das Epithel von der umgebenden Mesenchym. Die CL mikrodisseziert mit Zelldissoziationspuffer behandelt und in Gewebekulturplatten ausplattiert. Trennung der labialen CL von dem darunterliegenden Kieferknochen (3) und Addition von Eigenvolumen Medien sind für die Isolation und das Wachstum der Kolonien auf. Kleinen, engen epithelialen gebildeten Kolonien unter Verwendung dieser Technik sind von 7 Tagen (4A) sichtbar ist,und diese wachsen in großen Kolonien innerhalb von 2-3 Wochen (4B).
Abbildung 1. Abbildungen der erwachsenen Maus Schneidezahn. (A) Die erwachsenen Maus Hemi-Unterkiefer, die die mineralisierten Komponenten, Schmelz und Dentin, und die zwei Arten von Zähnen, Molaren und Schneidezähne. Das proximale Schneidezahnbereich, wo die DESC untergebracht sind, ist in A markiert. "(A ') Sagittale Ansicht des proximalen Schneidezahn, die die zwei Stammzellnischen, die Lippen-und Zungen Hals-Schleife (LACL und LiCl), Ameloblasten, die Zahnschmelz zu erzeugen, und die Odontoblasten, die Dentin bilden. Die LACL, die ausschließlich erzeugt ameloblast Vorläuferzellen und bilden schließlich Schneidezahn Zahnschmelz in A'' hervorgehoben. (A'') Die LACL, die das äußere Schmelzepithels (OEE), sternförmigen Retikulum (SR), Innen Schmelzepithels (IEE), Transit-Verstärker (TA)-Bereich, und das Stratum intermedium (SI). Der SR ist in blau und dunkelrosa dargestellt, um die Subpopulationen mit unterschiedlichen Dichten zu reflektieren. (B) Visualisierung der Halsschleife mit einem fluoreszierenden Reporter-Maus, KRT14-EGFP/Actb. Knochen relativ autofluoreszenten, und Entfernen des Knochen macht die zervikale Schleife (B ') und den Rest des Epithels, die dann leicht ausgeschnitten werden kann. (B'') Alle Strukturen der Halsschleife einschließlich der OEE, IEE, TA SI und kann leicht mit dem Reportergen visualisiert werden. Maßstabsbalken B ', B "= 2 mm, B" = 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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2. Übersicht der Präparation und Isolierung der CL der Maus Schneidezahn. Schematische Darstellung des Verfahrens. CL ist an dem proximalen Ende der Unterkieferschneidezähne angeordnet. Der erste Schritt ist, um umliegende Kieferknochen entfernen, um die Schneidezähne mit CL intakt aus. Als nächstes wird die Zahn Organ isoliert und in 2% Kollagenase gegeben separate Epithel-Mesenchym. Nach 4 Stunden Inkubation wird die CL manuell herausgeschnitten, in einzelne Zellen dissoziiert werden, und auf Standardgewebekulturplatten kultiviert.
Abbildung 3. Knochen Entfernung der Mausunterkiefer, um die zugrunde liegenden Region CL aussetzen. Visuelle Kontrollpunkte für die Entnahme des Knochen Dissektion Prozess gezeigt. (A) Zeigt die Hemi-Unterkiefer einach Schritt 1.5, sobald der Muskel-, Sehnen-und Bänder werden aus dem Knochen entfernt. (B) zeigt den Bereich Entfernen von Knochen zu beginnen, ausgehend von knapp unterhalb der 3. Molaren, bewegen proximal in Richtung der Region, die den CL. Als nächstes werden alle Knochen proximal des CL entfernt (C), wie in Schritt 2.4 festgestellt. Der nächste Einschnitt, um, wie in Schritt 2.5 erklärt den Rest der Knochen zu entfernen, ist in (D) gezeigt. Schließlich wird der CL aus dem verbleibenden Knochen wie in Schritt 2.6 (E) angegebenen entfernt vergrößerte Ansicht (siehe Einschub).
4. Repräsentative Ergebnisse erfolgreicher Koloniebildung in vitro. A. Phasenkontrastmikroskopie DESC, nach dem Ausplattieren in Kultur für 7 Tage. Enge Koloniebildung zeigt die erfolgreiche epithelialen isolation ohne mesenchymalen Verschmutzung. Maßstabsbalken = 400 um. B. Nach 10 Tagen Inkubation Kolonien sind größer und haben einen typischen Zellen epithelialen Morphologie Kopfsteinpflaster. Maßstabsbalken = 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Epithelzellen wurden zuerst erfolgreich kultiviert vor 40 Jahren über 21-24, und in jüngerer Zeit erfolgreiche Isolierung von epithelialen Stammzellen 25-27 unserem Wissen epithelialer Biologie fortgeschritten. Wir berichten über ein Protokoll zur Isolierung der DESC der erwachsenen Maus Schneidezahn, eine relativ wenig erforschten Population von Stammzellen, die das Potenzial, wichtige Einblicke in die Biologie und Zahnschmelzbildung ergeben hat. Dieses Protokoll wurde zunächst auf früheren Berichten von epithelialen Stammzellen isoliert von der Haarfollikel 28 basiert. Während viele Protokolle verwenden Feeder-Schichten und Serum zu epithelialen Stammzellen zu erhalten, ist unsere Methode ein Feeder kostenlos, Serum-freies System. Allerdings ist unser Wachstumsmedien erfordern den Einsatz von einem Cocktail von EGF, FGF2 und B27 Ergänzung. EGF ist seit langem verwendet, um undifferenzierte Zellen aufrecht zu erhalten 29. Ein Cocktail von EGF und FGF2 mit B27 wurde zuvor Kultur Haarfollikelstammzellen 27 verwendet wird, und B27 wird häufig verwendet, um neurale Stammzellen in Kultur 30,31 aufrechtzuerhalten. Wir haben auch die zuvor gemessene Rentabilität und Wachstum Eigenschaften DESC oben auf Gewebekultur-Kunststoff und auf einer Vielzahl von ECM-Substraten und in den Preisen der Proliferation 19 wurden keine Unterschiede festgestellt. Zellen können bis zu 10 serielle Passagen 19 gehalten werden.
Wir verwenden die unteren Schneidezähne für dieses Verfahren wegen der Einfachheit der Entfernung im Vergleich zu den oberen Schneidezähnen. Die wichtigsten Schritte in unserem Protokoll während der Isolierung sind die vollständige Entfernung des CL Bereich von der Unterkieferknochen, bevor sie in Kollagenase und eine saubere Mikrodissektion des CL. Da der proximale Schneidezahn ist sehr empfindlich, ist es wichtig, nicht zu beschädigen bei der Präparation, die zum Verlust der labialen CL führen könnte. Unvollständige Entfernung wird auf Reste der labialCL und einer geringeren Ausbeute an DESC führen. Darüber hinaus ist es wichtig, die Kontamination mit nicht-C vermeidenL Epithelzellen. Nachdem also das Epithel aus dem Mesenchym getrennt worden sind, sollte eine saubere V-förmigen Einschnitt vorgenommen werden, um die Lippen CL von der benachbarten Epithel zu entfernen. Schließlich ist es wichtig, diese Zellen in einer Konzentration von mehr als 1 x 10 4 Zellen pro ml Platte und verlassen die Hälfte der konditionierten Medien zum ersten Medienwechsel.
Der große Vorteil dieses Protokolls auf zahnmedizinischen Forschung ist, dass es eine effiziente Erzeugung und Manipulation von DESC in vitro. Obwohl die Maus Schneidezahn ist als in vivo-Modell 7-9,12,32-34, die Entwicklung eines in vitro-System etabliert Fortschritte der zahnmedizinischen Forschung, das durch das Öffnen der Türen zu Experimenten, die schwer zu in vivo durchzuführen sind. Vorteile dieses Systems umfassen die Fähigkeit, leicht zu manipulieren, die Zellen in verschiedenen Kulturbedingungen, einfache Ausrichtung der einzelnen oder mehrere Signalwege und die Inhibierung oder Aktivierung von targeted Moleküle mit siRNA oder Wachstumsfaktoren. Downstream-Anwendungen dieser in vitro-System sind mit den oben aufgeführten Techniken sowie andere Schneide-Techniken, um funktionelle und / oder mechanistische Studien besonders auf Einzelzellebene durchzuführen.
Insgesamt können Informationen aus DESC in-vitro-Kultur entnommen helfen, die Feinheiten der Stammzellerneuerung Zahn zu entwirren.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Xiu-Ping Wang für die erste Hilfe bei DESC Kulturen. Die Autoren sind zum Teil durch Stipendien und Zuschüsse aus den National Institutes of Health (K99-DE022059 zu AHJ, K12-GM081266 MGC, K08-DE022377-02 zu OH-und R01-DE021420 zu ODK) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, size 5 | Fine Science Tools | 11251-30 | FST by Dumont, Dumoxel |
| Forceps straight, fine, 3.5 | Roboz | RS5070 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Services | #71960 | |
| Scalpel Handle No. 3 | VWR | ||
| Feather Blade No. 15 | Electron Microscopy Services | #72044-15 | Surgical Stainless Steel |
| Collagenase Type-1 filtered | Worthington Biochemical Corporation | #4214 | |
| Insulin syringe | BD | #329424 | |
| Accumax | EMD Millipore | #SCR006 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| EGF | R&D | 2028-EG-200 | |
| FGF2 | R&D | 233-FB-025 | |
| B27 Supplement | Gibco | 10889-038 |
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